腺病毒介导蜂毒素基因转染对HepG2细胞生长及AFP表达的影响

目的:将蜂毒素基因置于甲胎蛋白(AFP)转录调控元件(rAFP)驱动之下,构件重组腺病毒载体,观察蜂毒素基因转染对肝癌细胞生长及AFP表达的影响.方法::将蜂毒素基因置于rAFP之后,用细菌内高效同源重组法将目的基因重组入腺病毒质粒中,将腺病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,用脂质体介导转染293细胞进行腺病毒的包装.携有蜂毒素基因的腺病毒感染肝癌细胞后,RT-PCR实验观察蜂毒素基因是否发生转录;MTT法测定蜂毒素基因转染对肝癌细胞增殖的影响;ELISA双抗体夹心法定量检测AFP.结果:RT-PCR实验表明蜂毒素基因转染肝癌细胞后可以被转录;蜂毒素基因在rAFP的控制下,可以特异性的抑制AFP阳性肝癌细胞的增殖,并降低其AFP的生成量.结论:蜂毒素基因转染对肝癌细胞的生长及AFP的表达具有抑制作用,可降低其恶性度.     

携蜂毒素基因腺病毒感染对HepG2细胞CD54表达的影响

目的 研究蜂毒素基因转染对肝癌细胞生物学性状的影响。方法 将蜂毒素基因置于甲胎蛋白(AFP)转录调控序列驱动下，用细菌内高效同源重组法将目的基因重组于腺病毒质粒中；将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后，脂质体介导转染293细胞进行腺病毒的包装。携有蜂毒素基因的腺病毒感染肝癌细胞后，RT-PCR实验观察蜂毒素基因是否可以被转录，流式细胞术检测CD54表达情况。结果 携蜂毒素基因的重组腺病毒载体构建成功；RT-PCR实验表明蜂毒素基因可以得到转录；流式细胞术结果表明，蜂毒素基因转染可以抑制CD54分子的表达。结论 蜂毒素基因转染肝癌细胞后，可改变肿瘤细胞的生物学行为。使其恶性度降低。     

携蜂毒素基因腺病毒感染对HepG2细胞CD54表达的影响

目的研究蜂毒素基因转染对肝癌细胞生物学性状的影响。方法将蜂毒素基因置于甲胎蛋白(AFP)转录调控序列驱动下,用细菌内高效同源重组法将目的基因重组于腺病毒质粒中;将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,脂质体介导转染293细胞进行腺病毒的包装。携有蜂毒素基因的腺病毒感染肝癌细胞后,RT-PCR实验观察蜂毒素基因是否可以被转录,流式细胞术检测CD54表达情况。结果携蜂毒素基因的重组腺病毒载体构建成功;RT-PCR实验表明蜂毒素基因可以得到转录;流式细胞术结果表明,蜂毒素基因转染可以抑制CD54分子的表达。结论蜂毒素基因转染肝癌细胞后,可改变肿瘤细胞的生物学行为,使其恶性度降低。     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达.MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用.结果 成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV 可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响.结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞.     

重组腺病毒载体携带凋亡素基因对肝癌细胞的作用

目的 探讨带有AFP启动子的重组腺病毒载体介导凋亡素基因对肝癌细胞的作用.方法 测定腺病毒AdAFPvp3滴度,并以MOI=100感染Hepal-6肝癌细胞(AFP ),HEK293细胞(AFP-),Lewis肺癌细胞(AFP-),24 h后Hoechst 33258染色观察凋亡形态学改变,RT-PCR检测vp3基因的表达.腺病毒AdAFPvp3以MOI=100感染hepal-6肝癌细胞,FCM检测肝癌细胞不同时段凋亡率.结果 腺病毒AdAFPvp3滴度为5×10(9)PFU/ml.Hoechst 33528染色显示甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞出现凋亡形态学改变,RT-PCR检测只有甲胎蛋白阳性的Hepal-6肝癌细胞表达vp3mRNA.FCM表明凋亡素基因能有效诱导肝癌细胞凋亡.结论 带有特异性甲胎蛋白启动子的重组腺病毒载体.介导凋亡素基因导入肝癌细胞后,对于能合成甲胎蛋白的肝癌细胞,具有特异性靶向性致凋亡作用.     

携蜂毒素基因重组腺病毒载体的构建

目的构建含巨细胞病毒 (cytomegalovirus ,CMV)启动子或甲胎蛋白 (α fetoprotein ,AFP)调控序列驱动下的蜂毒素基因的重组腺病毒 ,进行体外抗肿瘤效果的比较。方法人工合成蜂毒素基因时 ,用Kozak序列优化翻译起始区 ,并进行人类最适密码子的转换 ,然后置于CMV启动子或AFP调控序列之后 ,用细菌内高效同源重组法构建腺病毒质粒 ,脂质体转染 2 93细胞进行包装。结果目的基因成功地重组人腺病毒质粒。结论上述蜂毒素 腺病毒载体构建时的几个特点 ,有助于载体的顺利构建 ,并为下一步的实验奠定了基础     

甲胎蛋白特异启动元件介导的肝癌靶向性基因治疗的体外实验研究

目的采用体外培养的肿瘤细胞系探讨甲胎蛋白特异启动元件介导的靶向性肝癌基因治疗.方法将2.2 kb的重组人甲胎蛋白(AFP)基因顺式调控元件克隆于胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的上游,构建逆转录病毒载体LX2.2CD.再以此载体和另一不含AFP基因调控元件的逆转录病毒载体pCD2分别转染3种肝癌细胞系和1种肺腺癌细胞系,筛选出整合CD基因的抗G418克隆,并进行细胞生长抑制实验.结果5氟胞嘧啶(5FC)对用LX2.2CD转染的AFP阳性肝癌细胞具有特异杀伤作用,而对AFP阴性的肝癌细胞和非肝癌细胞无杀伤作用.结论在细胞水平实现了对AFP阳性肝癌细胞的靶向性基因治疗.     

pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体的构建及在PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体介导下转染肝癌细胞

目的:构建甲胎蛋白(AFP)启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)重组真核表达载体,并检测其在AFP阳性肝癌细胞株的特异性表达.方法:PCR 扩增AFP 基因启动子、HSV-TK基因,将上述片段插入EGFP-N1载体的多克隆位点,构建pEGFP-AFP-TK重组表达载体,通过包裹PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体,经其介导,转染AFP 阳性肝癌细胞株HepG2 和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721, 利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法检测目的基因在2种细胞系中的表达.结果与结论:肝癌特异性真核表达载体pEGFP-AFP-TK构建成功.利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法可以检测到嵌合AFP启动子的pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体能够特异性在AFP阳性的肝癌细胞株表达,而在AFP阴性的肝癌细胞株中基本不表达.     

靶向性融合基因对人肝细胞性肝癌治疗作用的体外研究(摘要)

目的观察由人甲胎蛋白(AFP)启动子调控的单纯疱疹病毒II型胸苷激酶基因(HSV-Ⅱ-tk)与血管生成抑制素基因(Angio)的融合基因对人肝细胞性肝癌的体外治疗作用·方法通过PCR技术,从临床肝癌标本中克隆AFP启动子;通过基因重组技术,构建的真核表达载体pcDNA3/AFP/tk/Angio;通过阳离子脂质体Liofectamine介导,体外转染人肝细胞性肝癌细胞株SMMC-772l和Bel7402加入GCV,细胞培养·用RT-PCR、光镜、透射电境、MTT,流式细胞仪等方法检测HSV-Ⅱ-tk和An-giostatin基因在SMMC-7721和Bel 7402细胞中的表达及其对该细胞的杀伤作用·结…     

PEG-PEI／Fe3O4纳米磁流体-TK对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的:探讨PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体-TK对肝癌细胞HepG2凋亡的影响.方法:构建重组质粒PEGFP-AFP-TK并通过纳米磁流体分别转染入AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2及AFP表达阴性的肝癌细胞SMMC7721.转染12 h后,于荧光显微镜下动态观察;48 h后,RT-PCR和Western blot分析HepG2细胞巾HSV-TK基因的表达情况,用MTT法检测HepG2细胞的存活,用流式细胞分析HepG2细胞的凋亡.结果:纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-TK转入HepG2细胞,并且其转染效率高于脂质体;RT-PCR及Western blot证明转染的HepG2细胞有HSV-TK基因的表达;MTT及流式细胞分析说明HSV-TK基因发挥杀伤细胞作用.结论:纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-TK转染HepG2细胞并获得表达,PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体-TK可显著抑制HepG2细胞增殖,可望成为肝癌基因治疗的新型生物制剂之一.     

以乙肝病毒衣壳为载体的AFP启动子-DTA对肝癌细胞特异杀伤作用的实验研究

目的探讨以乙肝病毒衣壳（hepatitis B virus envelope HBVE）为栽体的AFP启动子-DTA在体外对肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法用β-丙内脂法制备HBVE，将包裹AFP启动子-DTA真核表达质粒的HBVE转染HepG2、SMMC-7721、A549、FB后，检测DTA的表达，观察其对肝癌细胞的杀伤作用。结果以乙肝病毒衣壳为栽体的AFP启动子-DTA转染后观测到：在HepG2细胞中，DTA在mRNA和蛋白水平的表达量显著增加；细胞分裂相少见、存活率低且生长缓慢，对照细胞却很快进入对数生长期；凋亡指数比对照细胞显著增加。结论以乙肝病毒衣壳为栽体的AFP启动子-DTA在体外可特异性地杀伤AFP阳性肝癌细胞。     

AFP基因转染CD34+造血干细胞来源的树突状细胞诱导特异性抗肝癌免疫

目的: 以AFP基因转染CD34 造血干细胞来源的树突状细胞(DC),诱导DC产生特异性抗肝癌免疫,观察其对肝癌细胞的杀伤.方法: 采用化疗和集落刺激因子动员肝癌患者外周血造血干细胞,血细胞分离机采集CD34 造血干细胞,IL-4、GM-CSF联合TNF-α刺激CD34 细胞分化为DC.通过脂质体转染的方法将携带人AFP基因质粒pEGFP-AFP转染树突状细胞,MTT法检测对人肝癌细胞HepG2的特异性杀伤.结果: 经细胞因子刺激诱导培养的DC具有典型的分枝状突起,高表达CD11C,CD80,CD86.转染AFP基因后可见到转染细胞表达绿色荧光蛋白,细胞化学染色胞质内可见到红色颗粒.MTT法检测AFP基因转染后的DC可诱发特异性CTL反应杀伤HepG2细胞,AFP基因转染组、空载体组和对照组的杀伤率分别为(92.0±3.5)%,(75.5±4.1)%和(72.9±3.4)%,转染组与空载体组和对照组间存在显著性差异(P＜0.05).结论: AFP基因转染CD34 造血干细胞来源的DC可诱导特异性CTL反应杀伤肝癌细胞.     

含CEA片段的重组腺病毒转染DCs诱导特异性T细胞对结直肠癌细胞株的体外杀伤作用

目的:探讨人外周血单核细胞来源的树突状细胞转染含CEA片段的重组腺病毒后所诱导的特异性T细胞对直肠癌细胞株LOVO和SW480的体外杀伤作用。方法:抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养,使用含CEA片断的重组腺病毒转染未成熟DCs,诱导特异性T细胞。检测体外培养的DCs和CTL活性,并使用MTT法检测CTL对LOVO细胞的杀伤作用。结果:转染或未转染的体外培养的成熟DCs高表达CD40、CD86,IL-12,诱导的CTL细胞高表达IFN-γ;转染后DCs诱导特异性CTL可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LOVO细胞。结论:重组腺病毒转染DCs,不明显改变DCs表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能,可诱导自体CTL增殖,含CEA片断的腺病毒转染DCs诱导自体CTL对LOVO细胞有明显杀伤作用。     

纳米磁流体介导的重组质粒PEGFP-AFP-hTN Fα对肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用

目的探讨纳米磁流体作为肝癌基因治疗载体的可行性及AFP增强子能否使外来基因在AFP阳性细胞内高表达。方法构建重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα并通过纳米磁流体分别转染入AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2及AFP表达阴性的宫颈癌细胞Hela。转染12h后，于荧光显微镜下动态观察；48h后，RT-PCR和Westemblot分析HepG2细胞中hTNFα基因的表达情况，用MTT法检测HepG2细胞的存活，用流式细胞分析HepG2细胞的凋亡。结果纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα转入HepG2细胞，并且其转染效率高于脂质体；RT-PCR及Westemblot证明转染的HepG2细胞有hTNFα基因的表达；MTT及流式细胞分析说明hTNFα基因发挥杀伤细胞作用。结论纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα转染HepG2细胞并获得表达，可作为肝癌基因治疗的基因载体。采用AFP增强子可使目的基因在HepG2细胞中定向而特异性表达。     

蜂毒素对肝癌细胞磷脂酶A_2的影响

目的观察蜂毒素诱导细胞凋亡及对胞质型细胞磷脂酶A2（cPLA2）的影响。方法肝癌细胞BEL-7402体外培养,采用MTT法了解蜂毒素对肝癌细胞增殖的影响,用流式细胞术测定细胞凋亡,采用RT-PCR检测cPLA2的表达。结果蜂毒素在体外能够抑制肝癌细胞的增殖活性,并有诱导细胞凋亡的作用,RT-PCR检测显示,蜂毒素mRNA水平均具有激活cPLA2的作用。结论蜂毒素具有诱导肝癌凋亡及激活cPLA2的生物活性。     

蜂毒素对肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用

[目的]观察蜂毒素对肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用。[方法]肝癌细胞BEL-7402体外培养,采用MTT法检测蜂毒素对其增殖抑制作用,流式细胞术测定蜂毒素对细胞增殖核抗原表达和细胞周期的影响。[结果]蜂毒素体外能够抑制BEL-7402肝癌细胞的增殖活性;并抑制细胞增殖核抗原的表达,呈剂量依赖性;干扰细胞周期,使S期细胞增加,G2/M期细胞减少。[结论]蜂毒素具有抑制BEL-7402肝癌细胞增殖的作用,机制可能与抑制细胞增殖核抗原表达和干扰细胞周期有关。     

人甲胎蛋白基因启动子驱动siRNA表达载体的构建及其在HepG2细胞中RNA效应的初步鉴定

目的：探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性，为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法：PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencer1．0-U6中以置换其U6启动子；依据人hIRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA,体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链。再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中，实时定量RT—PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hIRH-1的RNAi效应，以及hIRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果：获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSWFPo以人hLRH-1为报告基因，本研究发现所建的RNAi载体系统可在表达AFP的细胞HepG2中有效诱导靶基因表达下调，抑制率约达85％；同时引致hLRH-1调控下游靶基因CydinEl与Oct4的表达相应下调。结论：人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的细胞HepG2中有效介导靶基因的RNAi效应，为临床肝癌细胞靶向的基因特异性RNAi治疗提供了初步的实验依据。     

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应.方法 通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达.结果 转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降.hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低.结论 hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性.     

pcDNA3．1（＋）／hTERT-tk真核表达质粒的构建及其在HepG-2细胞中的表达

目的：研究人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／更昔洛韦（HSV-tk／GCV）系统对肝癌HepG-2细胞的体外杀伤作用。方法：构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）／hTERT-tk,用脂质体法分别转染肝癌细胞（HepG-2）和正常肝细胞（L-02）后给予更昔洛韦（GCV）,用TUNEL法观察自杀基因对肝癌细胞生长的影响。结果：HETRT启动子调控下的HSV-tk／GCV系统对肝癌HepG-2细胞有明显的杀伤作用,而对正常肝细胞则作用不明显。结论：hTERT-tk／GCV基因体系能够靶向杀伤肝癌细胞,有靶向治疗肝癌的潜力。