DNA引物酶的提取分离与引物合成活性的研究

以小鼠艾氏腹水癌细胞经超声破碎的提取液为材料，依次用ＤＥ５２和Ｐ１１层析柱进行离子线性洗脱，分别在ＫＣｌ浓度为０．１７～０．２ｍｏｌ／Ｌ和０．２５～０．２７ｍｏｌ／Ｌ处ＤＮＡ引物酶被洗脱下来。用大肠杆菌大片段ＤＮＡ多聚酶Ⅰ延长引物法检测ＤＮＡ引物酶比活性为８７５３Ｕ／ｍｇ，酶总获得为２２．１％。放射自显影法检测引物合成活性显示引物酶合成了不同长度的引物     

聚苯乙烯载体亲和层析纯化尿激酶

聚苯乙烯经磺化后连接手臂６－氨基己酸，然后偶联配基对氨基苯甲脒，制成亲水性的亲和载体。载体的最适配基密度为每克湿载体３２μｍｏｌ，最适吸附条件为ｐＨ７．５、０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（含ＮａＣｌ０．５ｍｏｌ／Ｌ）。在ｐＨ４．０、０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸缓冲溶液（含ＮａＣｌ０．５ｍｏｌ／Ｌ）中，采用０～１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＳＣＮ梯度洗脱，可将比活８．３３μｍｏｌ·Ｓ－１·ｍｇ－１的粗酶纯化５０倍，收率大于５３％。     

重组人肝细胞生长因子的纯化及鉴定

目的对重组人肝细胞生长因子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｏｒ, ｒｈＨＧＦ）进行初步纯化及鉴定。方法 培养上清液经过离心、超滤,在ＦＰＬＣ系统上经肝素亲和层析分离纯化,用ＥＬＩＳＡ法检测、收集ｒｈＨＧＦ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电 泳鉴定纯度和相对分子质量,大鼠原代肝细胞培养法检测ｒｈＨＧＦ的生物学活性。结果ｒｈＨＧＦ主要在０．９～１．３ ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ 范围内被洗脱,由约６２ ０００和３４ ０００两个亚基组成,明显促进大鼠肝细胞ＤＮＡ合成。结论　经肝素亲和层析分离,从 表达山ＨＧＦ的ＣＨＯ细胞培养上清液中纯化出有活性的ｒｈＨＧＦ。     

HBx—DNA探针的研制及在肝癌发生机制研究中的应用

将非放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ／ＥｃｏＲ Ｉ酶切片段（３．２ｋｂ）制备ＨＢＶ－ＤＮＡ探针及由ＨＢＶ／ＢａｍＨ Ｉ、Ｂｇｌ Ⅱ酶切片段（０．５９ｋｂ）制备ＨＢｘ－ＤＮＡ探针。将Ｄｉｇ－ＨＢＶ ＤＮＡ探针用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测筛选肝细胞性肝癌ＨＢＶ－ＤＮＡ整合型标本，进而用Ｄｉｇ－ＨＢｘ ＤＮＡ探针检测ＨＢＶ－ＤＮＡ纯整合型肝细胞性肝癌中ＨＢｘ的存在情     

PCR引物法及随机引物法标记cDNA探针杂交效率的研究

目的：为提高原位杂交所用ｃＤＮＡ探针的杂交效率。方法：采用正义引物ＰＣＲ法及正义、反义引物ＰＣＲ法制备地高辛（Ｄｉｇ）标记的ＴＧＦ－βｃＤＮＡ探针。同时采用常规的随机引物法标记上述探针。用斑点杂交及原位杂交法比较三者的效率。结果：在斑点杂交中，正义引物ＰＣＲ法所标记的单链探针的杂交效率最高，高于随机引物法一个数量级。在探针浓度相同条件下，正义引物ＰＣＲ法标记探针的原位杂交效果优于随机引物法标记的探     

自动超氧化物歧化酶活性分析仪的研究

目的研究和评价自动超氧化物歧化酶活性分析仪。方法通过正交试验分析影响测试的因素并研究最佳测试条件等。结果①影响测试结果的因素依次为：Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ缓冲液的ｐＨ值＞焦性没食子酸浓度＞Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ缓冲液的体积＞Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ缓冲液的浓度＞搅拌速度；②最佳测试条件为：在２５℃时，０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．２的Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ缓冲液０．２ｍｌ，样品用量５～２０μｌ，０．２ｍｏｌ／Ｌ焦性没食子酸加入量为２０μｌ（终浓度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）；③线性工作范围为：ＳＯＤ浓度２．２５～１１．２５μｇ／２０μｌ；检测限：ＳＯＤ２．２５μｇ／２０μｌ，灵敏度１．０４；④分析的精密度为：组内合并ＣＶ３．８８％～６．７８％，组间合并ＣＶ５．５５％；⑤分析的准确率为：回收率９０．１０％～１０２．３７％，平均回收率（９４．５１±８．２０）％。结论自动超氧化物歧化酶活性分析仪快速、简便、适用范围较广。     

HBx-DNA探针的研制及在肝癌发生机制研究中的应用

将非放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ／ＥｃｏＲⅠ酶切片段（３．２ｋｂ）制备ＨＢＶ－ＤＮＡ探针及由ＨＢＶ／ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ酶切片段（０．５９ｋｂ）制备ＨＢｘ－ＤＮＡ探针。将Ｄｉｇ－ＨＢＶＤＮＡ探针用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测筛选肝细胞性肝癌ＨＢＶ－ＤＮＡ整合型标本，进而用Ｄｉｇ－ＨＢｘＤＮＡ探针检测ＨＢＶ－ＤＮＡ纯整合型肝细胞性肝癌中ＨＢｘ的存在情况。结果显示，７５％（３３／４４）的肝癌ＤＮＡ中有ＨＢＶ－ＤＮＡ存在，其中，以纯整合型方式存在的为６３．６％（２１／３３），混合型为３６．４％（１２／３３），无游离型。纯整合型ＨＢＶ－ＤＮＡ片段中，ＨＢｘ－ＤＮＡ阳性率为９０．５％（１９／２１）。提示ＨＢＶ在肝细胞性肝癌的发生中起着重要的作用，ＨＢＶ－ＤＮＡ可能以片段性整合的方式存在于肝癌细胞染色体上，其中以ＨＢｘ基因的整合为主。     

阳离子交换色谱一步法制备级纯化单克隆抗体

应用快速蛋白液相色谱系统（ＦＰＬＣ）建立一种一步法制备级纯化单隆抗体方法。方法：将ＭｃＡｂ腹水用ｐＨ６．０，０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢ透析或稀释８倍后直接上ＳＰ－４０ＨＲ阳离子交换色谱柱，用ＰＢ－ＮａＣｌ二元线性离子梯度洗脱，即得到纯化的ＭｃＡｂ。结果：每次上样量７０～８０ｍｌ腹水，可获得纯化ＭｃＡｂ５００～５８０ｍｇ，得率７～７．５ｍｇ／ｍｌ腹水，回收率为７０％～７５％，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测纯度为     

肾上腺素能受体激动剂与阻断剂对血管平滑肌细胞增殖和c－fos，c－myc原癌基因表达的影响

目的：研究肾上腺素能受体激动剂与阻断剂对血管平滑肌细胞增殖、ＤＮＡ合成和ｃ－ｆｏｓ，ｃ－ｍｙｃ原癌基因表达的影响．方法：应用细胞培养、￣３Ｈ－胸腺嘧啶核苷掺入和斑点杂交的方法．结果：１～１０μｍｏｌ／Ｌ去甲肾上腺素（ＮＥ）和０．１～１０μｍｏｌ／Ｌ异丙基肾上腺素（ＩＳＯ）可明显促进离体培养的ＳＤ大鼠的主动脉平滑肌细胞增殖、￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入和ｃ－ｆｏｓ，ｃ－ｍｙｃ原癌基因表达，并呈剂量依赖效应．该效应可为相应的受体阻断剂Ｐｈｅｎｔｏｌａｍｉｎｅ（１０μｍｏｌ／Ｌ）和Ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ（１０μｍｏｌ／Ｌ）所抑制（Ｐ＜０．０５）．结论：肾上腺素能受体激动剂可促进离体培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖、ＤＮＡ合成和原癌基因的表达，该效应可被其相应的阻断剂所抑制．     

限量饮食对致癌物活化代谢及DNA断裂的影响

目的；研究限量饮食（ＤＢ）对小鼠肝代谢活化致癌以及致癌物导致的ＤＮＡ链断裂程度的影响。方法：用＾３２Ｐ－后标记和高效液相色谱法测定致癌物－ＤＮＡ主要加合物生成量；用随机寡核甘酸引物合成法（ＲＯＰＳ）测定ＤＮＡ链断裂程度；用体外代谢酶活性测定法检测有关代谢酶的活性。     

一种从总RNA制备非放射性cDNA探针的方法

目的介绍一种从总ＲＮＡ制备ＤＩＧ标记的非放射性ｃＤＮＡ探针的方法。方法以总ＲＮＡ的反转录产物为模板,用随机引物延伸法掺入ＤＩＧ－１１－ｄＵＴＰ来制备ｃＤＮＡ探针。结果该方法标记的探针灵敏度较高,可达０．０１ｇｐ。结论这种ｃＤＮＡ探针可用于差异筛选的反向杂交及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交。     

Sa抗原的提取和纯化

目的：提取和纯化Ｓａ抗原。方法：应用ＤＥ５２离子层析法。结果：Ｓａ抗原的分子量是５０ＫＤ，存在于０．２０ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ ＴＢＳ洗脱组分中，在－２０℃保存期为１２０天。结论：分离和纯化的Ｓａ抗原可应用于免疫印迹检测抗Ｓａ抗体。     

β—L—2‘,3’—双脱氧—5—氟胞苷在体外对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的：研究β－Ｌ－２＇，３＇－双脱氧－５－氟胞苷的抗乙型肝炎病毒作用。方法：从２．２．１５细胞培养液中提取乙肝病毒ＤＮＡ，用ＤＮＡ印迹法分别药物对乙肝病毒ＤＮＡ复制的影响。观察药物对人Ｔ－成淋巴样细胞的生长抑制作用，用狭线印迹法检测人Ｔ－成淋巴样细胞的线粒体ＤＮＡ。结果：β－Ｌ－２＇，３＇－双脱氧－５－氟胞苷对乙肝病毒ＤＮＡ合成的半数抑制浓度为０．０５μｍｏｌ／Ｌ，但其抗乙肝病毒作用是可逆的。对人     

用三对引物检测血液中细胞DNA的方法学

目的：建立稳定、敏感的检测血液中肠源性细菌ＤＮＡ的方法。方法：取２３例腹部手术后体温＞３８．５℃患者的肘静脉血进行血培养,并以酚抽提法提取全血ＤＮＡ进行ＰＣＲ,靶基因分别为大肠杆菌特异性的β－半糖甘酶基因、脆弱类杆菌特异性的谷氨酰胺合成酶基因,以及大多数细菌所共有的１６ＳｒＲＮＡ基因。以标准菌株提取的ＤＮＡ为阳性对照。空白对照为阴性对照,２０例健康志愿者全血ＤＮＡ为正常对照。对２０例标本重复检测２次以确定其复现性。结果：ＰＣＲ复现率为９５％。血培养阳性率为１３．０％（３／２３）,ＰＣＲ检测阳性率为４３．５％（１０／２３）,较血培养阳性率高（Ｐ＝０．０１６）。结论：按照规范进行的ＰＣＲ检测血液中肠源性细菌方法稳定,比血培养敏感。     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＥＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射生标记制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶ ＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｍｇ ＨＣＭＶ ＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。     

马桑内酯对脑γ－氨基丁酸分泌和谷氨酸脱羧酶及其受体结合力的影响

为探讨癫痫发病的生物化学机制，用培养的大鼠大脑皮层神经元和大脑皮层匀浆及突触膜为模型，采用酶联免疫法，放射分析法观察马桑内酯（ＣＬ）对大鼠脑内γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）分泌，谷氨酸脱梭酶（ＧＡＤ）活性和谷氨酸（Ｇｌｕ）受体结合力的影响。结果表明，５０μｍｏｌ／ＬＣＬ可抑制ＧＡＢＡ分泌，１２、２４、４８小时抑制率为８．３％～１４。５％；在０．１５～１５０μｍｏｌ／Ｌ范围，ＣＬ可抑制ＧＡＤ活性，抑制率为１．３２％～１８．７６％；ＣＬ在２．８～３５０μｍｏｌ／Ｌ范围内可降低Ｇｌｕ受体结合力，降低程度为１８．８％～３１．６％，且各剂量组与对照组差异均有极显著意义（Ｐ＜０．０１）。证实ＣＬ可抑制培养神经元ＧＡＢＡ分泌，并呈时间依赖和剂量依赖关系。     

D湖与长江水源末梢自来水致癌性比较研究：非挥发性有机物DN…

用ＤＮＡ合成抑制试验对Ｄ湖和长江水源末梢自来水非挥发性有机物致癌活性做了比较研究，发现前者开始出现ＤＮＡ合成抑制作用的浓度为１．０μｇ／ｍｌ，而后者为５．０μｇ／ｍｌ；在同一浓度组，Ｄ湖水的ＤＮＡ合成抑制率高于长江水样，表明Ｄ湖水的潜在致癌活性大于长江末梢自来水，研究结果与我们先前流行病学调查和该两水样Ａｍｅｓ试验及用ＧＣ／ＭＳ作化学组分分析的结果一致。     

D湖与长江水源末梢自来水致癌性比较研究──非挥发性有机物DNA合成抑制试验

用ＤＮＡ合成抑制试验对Ｄ湖和长江水源末梢自来水非挥发性有机物致癌活性做了比较研究，发现前者开始出现ＤＮＡ合成抑制作用的浓度为１．０μｇ／ｍｌ，而后者为５．０μｇ／ｍｌ；在同一浓度组，Ｄ湖水的ＤＮＡ合成抑制率高于长江水样。表明Ｄ湖水的潜在致癌活性大于长江末梢自来水。研究结果与我们先前流行病学调查和该两水样Ａｍｅｓ试验及用ＧＣ／ＭＳ作化学组分分析的结果一致。     

HPLC法测定经皮渗透接受液中双氯灭痛的浓度

采用ＲＰ－ＨＰＬＣ以４＇－羟基－５－氯双氯灭痛为内标，测定了经皮渗透接受液中双氯灭痛的含量。考察了流动相组成、ｐＨ值等对双氯灭痛色谱行为的影响情况。方法简便准确，回收率为９８．４４％～１０２．３％，ＲＳＤ＜２．４％，双氯灭痛浓度在０．５～１６μｇ／ｍｌ范围内，线性关系良好（ｒ＝０．９９９９），最低检测限５０ｎｇ／ｍｌ。色谱条件为：Ｃ（１８）Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（５μｍ，１００ｍｍ×４．６ｍｍ）不锈钢柱，甲醇ｐＨ７．０磷酸盐缓冲液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ）（５６：４４）作流动用，检测波长２８０ｎｍ，进样量２０μｌ。     

强直性脊柱炎相关抗原HLA—B2704基因克隆

目的 对ＨＬＡ－Ｂ２７０４的编码基因进行克隆。方法 通过酚提法获取基因组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲⅠｇ／Ｌ琼脂糖凝胶分离目的基因片段,采用内闰素末端标记的寡核苷酸探针对重组体噬斑转膜原位杂交,筛选阳性克隆,并进一步克隆化,用Ｗｉｚａｒｄ λＤＮＡ纯化系统试剂盒撮以纯化λＤＮＡ。结果 经酚提法获取基因组ＤＮＡ浓度为０．。８ｇ／Ｌ,Ｄ２６０／Ｄ２８０为１．７５,经高盐洗脱和乙醇纯化法获取的ＤＮＡ浓度为０．１６