两种脐带间充质干细胞标记方法及在1型糖尿病小鼠体内示踪的研究

目的 探究用细胞膜染料PKH26与DiR两种标记方法标记人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)在1型糖尿病小鼠(type 1 diabetes mellitus, T1DM)模型中的归巢情况,并分析两种示踪方法的优缺点。方法 在体外分别用PKH26与DiR对细胞进行标记,观察其标记效果。将PKH26或DiR标记的hUC-MSCs通过尾静脉注射的方式移植入1型糖尿病小鼠体内,24h后观察hUC-MSCs在各脏器的分布情况。结果 hUC-MSCs移植后24h,T1DM小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胰腺组织冷冻切片可观察到PKH26阳性的细胞。活体成像系统下可直观观察到DiR标记的hUC-MSCs在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胰腺中的归巢。结论 PKH26标记适用于荧光显微镜下观察受体组织切片中的hUC-MSCs,DiR标记适用于在活体成像系统中观察hUC-MSCs在活体动物组织中的分布,两种方法结合可从组织切片和整体上对hUC-MSCs进行示踪。     

绿色荧光转基因大鼠模型的建立

目的随着干细胞研究的推进,大鼠干细胞的研究日趋迫切。本研究旨在为活体荧光影像系统、干细胞归巢、细胞移植体内示踪研究,提供绿色荧光蛋白EGFP转基因大鼠模型。方法通过显微注射方式获得EGFP转基因大鼠,采用活体荧光影像系统、激光共聚焦显微镜,对EGFP转基因大鼠各个组织的荧光表达水平进行比较;采用流式细胞术检测转基因大鼠血液和骨髓细胞、骨髓干细胞的荧光标记率,筛选骨髓干细胞高效标记绿色荧光的转基因大鼠。结果建立了心脏、肝脏、肌肉、肺、胰腺、脑、膀胱、胃、肾脏、肠和脾脏组织中,系统性表达EGFP的SD-TgN(ACT-EGFP-1)ZLFILAS转基因大鼠;流式细胞术检测表明,该品系血液细胞绿色荧光标记率为94.4%,骨髓干细胞绿色荧光标记率为97.8%。结论建立了多组织系统性高表达绿色荧光,骨髓干细胞荧光标记率高达95%以上的转基因大鼠,为影像分析,造血干细胞的归巢等研究提供了大鼠模型。     

脐带源间充质干细胞促进造血细胞在NOD/SCID小鼠归巢

目的探讨脐带源间充质干细胞(hUC-MSC)在促进造血细胞归巢,提高造血干细胞植入中的作用. 方法 RT-PCR检测经体外培养扩增所得hUC-MSC归巢相关分子的表达;将hUC-MSC和CFDA-SE荧光标记的人脐带血单个核细胞(MNC)植入NOD/SCID小鼠建立共移植模型,分离共移植24 h后小鼠骨髓有核细胞,用流式细胞仪和荧光倒置显微镜观察脐带血造血细胞在NOD/SCID小鼠骨髓中含量的变化. 结果 hUC-MSC表达SDF-1及其受体CXCR-4以及相关黏附分子CD11a/ICAM-1、CD49d/VCAM-1;在hUC-MSC共移植情况下,流式细胞仪检测和荧光显微镜下细胞计数均发现人脐带血MNC在小鼠骨髓中的含量与单独脐带血移植相比较有显著提高[(145±59)/1×105vs (298±72)/1×105;(755±158)/5×105vs (1598±227)/5×105个骨髓有核细胞;n=9,P<0.05)]. 结论 hUC-MSC具有表达化学趋化因子及相关黏附分子的特性,有利于实现自身的归巢定位并引导造血干祖细胞的有效归巢与植入;动物模型的建立进一步证实其引导脐带血MNC在NOD/SCID小鼠体内向造血龛--骨髓富集(归巢)的作用.     

PKH26和Hoechst 33258联合示踪Uncv无毛小鼠iRhom2及其突变体蛋白

目的利用PKH26和Hoechst 33258联合示踪Uncv无毛小鼠iRhom2及其突变体蛋白在Vero细胞中的定位。方法用PKH26对细胞膜进行染色,同时用Hoechst 33258染料对细胞核进行染色,置于激光共聚焦显微镜下观察。结果通过激光共聚焦荧光显微镜观察目的蛋白,发现野生型iRhom2分布在细胞的胞浆,而iRhom2mut于细胞浆内和细胞核内都存在。结论亚细胞定位的不同推测到iRhom2的N末端缺失突变可能对其细胞内的定位有影响。     

CM-DiI示踪人脐血源基质细胞体内迁移定位的研究

目的:课题组前期实验发现人脐血源基质细胞(hUCBDSC)体外具有促进造血细胞集落扩增的能力,文中拟采用CM-DiI荧光标记技术,观察hUCBDSC移植后的归巢、定位和增殖情况. 方法:传代培养hUCBDSC,CM-DiI荧光染料预染后经尾静脉输入BALB/c-nu/nu裸鼠体内,分别于移植后1、7、14、21 d取裸鼠骨髓、脾脏、肝脏、肺脏组织,激光共聚焦显微镜观察CM-DiI标记hUCBDSC体内分布情况. 结果:传代培养hUCBDSC呈成纤维样,CM-DiI染色后胞膜呈红色.经尾静脉移植至裸鼠体内,移植后1 d,hUCBDSC广泛分布在骨髓、脾脏、肝脏、肺脏等组织中,移植7 d以后,hUCBDSC主要分布在骨髓,在骨髓中增殖、分化;脾脏、肝脏、肺脏等组织中的hUCBDSC明显减少. 结论:人脐血源基质细胞经尾静脉输注可"归巢"至骨髓,并在骨髓中增殖、分化,重建受损造血微环境.     

脐带源间充质干细胞促进造血细胞在NOD/SCID小鼠归巢

目的探讨脐带源间充质干细胞(hUC-MSC)在促进造血细胞归巢,提高造血干细胞植入中的作用。方法RT-PCR检测经体外培养扩增所得hUC-MSC归巢相关分子的表达;将hUC-MSC和CFDA-SE荧光标记的人脐带血单个核细胞(MNC)植入NOD/SCID小鼠建立共移植模型,分离共移植24h后小鼠骨髓有核细胞,用流式细胞仪和荧光倒置显微镜观察脐带血造血细胞在NOD/SCID小鼠骨髓中含量的变化。结果hUC-MSC表达SDF-1及其受体CXCR-4以及相关黏附分子CD11a/ICAM-1、CD49d/VCAM-1;在hUC-MSC共移植情况下,流式细胞仪检测和荧光显微镜下细胞计数均发现人脐带血MNC在小鼠骨髓中的含量与单独脐带血移植相比较有显著提高〔(145±59)/1×105vs(298±72)/1×105;(755±158)/5×105vs(1598±227)/5×105个骨髓有核细胞;n=9,P<0.05)〕。结论hUC-MSC具有表达化学趋化因子及相关黏附分子的特性,有利于实现自身的归巢定位并引导造血干祖细胞的有效归巢与植入;动物模型的建立进一步证实其引导脐带血MNC在NOD/SCID小鼠体内向造血龛———骨髓富集(归巢)的作用。     

造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的 对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型.方法 采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2) ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3)ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin(-)c-kit(+)Sea-1+(LSK)造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠.结果 活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光.流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS和C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞.结论 筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具.     

间充质干细胞在致敏受者造血干细胞移植中的作用

【目的】 本实验拟研究骨髓间充质干细胞(MSC)在致敏受者造血干细胞移植中的作用?【方法】 体外分离BALB/c小鼠骨髓细胞,通过贴壁培养方法获得MSC,应用流式细胞仪检测细胞表面分子标记?通过异基因脾细胞输注方法建立致敏动物模型;绿色荧光染料标记骨髓MSC,分别移植到非致敏及致敏受者体内,并于移植后不同时间点检测MSC的归巢情况?致敏BALB/c小鼠经照射预处理,联合应用同基因MSC与异基因骨髓细胞移植,每日观察小鼠的生存情况?【结果】 体外培养第4代MSC表现为长梭形,阴性表达造血细胞表面分子而阳性表达粘附分子?动物体内实验发现移植后第48小时,MSC在非致敏受者体内主要归巢于骨髓,而在致敏受者体内主要归巢于脾脏?造血干细胞移植实验中,致敏小鼠接受同基因骨髓MSC与异基因骨髓细胞移植,结果发现致敏小鼠在移植后第12 ~ 16天全部死亡,生存中位数时间是14 d?【结论】 成功培养小鼠骨髓MSC;移植后MSC在致敏受者体内主要归巢于脾脏组织;联合应用MSC移植并不能有效促进异基因造血干/祖细胞在致敏受者体内植入?     

羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的研究

目的 探讨活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的可行性和最适条件.方法清洁型SD大鼠20只,用密度梯度离心结合贴壁法分离、纯化、培养大鼠MSCs,取长满25 cm×25 cm培养瓶瓶底的第3代大鼠MSCs,用2.5,5,10,20,40 μmol/L的CFSE分别作用1,5,10,15,20 min后染色,通过观察染色后细胞荧光强度和细胞贴壁率筛选出CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度.采用MTT法检测最佳条件CFSE标记的大鼠MSCs的增殖能力.结果浓度10 μmol/L的CFSE在37 ℃下孵育10 min为MSCs染色、观察和研究的最佳条件.此条件下,CFSE标记的MSCs的增殖能力不受影响.结论活体染料CFSE是一种标记率高、细胞毒性小、操作简便的标记大鼠MSCs的新方法,浓度10 μmol/L的CFSE在37 ℃下孵育10 min为CFSE标记大鼠MSCs的最佳条件.     

荧光磁性纳米粒子体外标记骨髓间充质干细胞研究

目的:探索高效体外示踪骨髓间充质干细胞体系的方法。方法:采用贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞CD29、CD90和CD45表达情况,用诱导剂诱导干细胞检测骨髓间充质干细胞的分化能力,采用普鲁士蓝染色,用激光共聚焦显微镜、磁共振成像仪观察荧光磁性纳米粒子标记的干细胞体外成像效果。结果:流式细胞仪检测CD29、CD90和CD45阳性表达率分别为84.69%、90.28%和0.72%;碱性磷酸酶染色和油红O染色结果均表明骨髓间充质干细胞成功分化为成骨细胞和脂肪细胞;普鲁士蓝染色、激光共聚焦显微镜成像和磁共振成像表明荧光磁性纳米粒子标记的骨髓间充质干细胞具有很好的成像效果。结论:荧光磁性纳米粒子作为示踪剂可以在体外标记骨髓间充质干细胞,为干细胞研究提供新思路。     

绿色荧光蛋白标记骨髓基质干细胞在恒河猴体内构建组织工程骨的示踪作用

目的 用绿色荧光蛋白(GFP)标记恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC),以示踪其在体内参与组织工程骨形成的情况.方法 用OBI-293A细胞对腺病毒Ad5.CMV-GFP进行扩增,用Ad5.CMV-GFP转染rBMSc,将转染成功的第三代BMSc在转染后48 h消化制成细胞悬液,接种至块状可吸收HA上,体外培养3 d后,将其植入恒河猴(同体移植)背阔肌的肌袋内,以未转染GFP的BMSC用同样的方法接种块状可吸收HA上,作为对照,术后6周取材,4%的中性多聚甲醛固定,塑料包埋,制作骨磨片PI染色在激光共聚焦显微镜下进行观测.结果 转染GFP后,rBMSc仍贴壁生长,呈梭形或多角形,仍分裂增殖,但增殖速度有所降低.48 h可见细胞发出强烈的荧光,呈全细胞分布,计数转染率达80%.在激光共聚焦显微镜下观察骨磨片,可见材料内有发出较强荧光的细胞结构,能同时被PI染液着色.结论 绿色荧光蛋白能有效示踪组织工程骨种子细胞,种人体内的BMSC是组织工程骨骨组织形成的主要细胞来源.     

人骨髓基质干细胞体外三维立体培养的实验研究

目的：探讨人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)在部分脱钙骨三维支架上立体培养的可行性。方法：将自人骨髓中分离出的骨髓基质干细胞进行培养、扩增,接种于多孔的部分脱钙骨支架上,通过荧光活性染料DiI标记和扫描电镜观察骨髓基质干细胞在部分脱钙骨上的生长和粘附情况,并测量hBMSCs在部分脱钙骨上的粘附率。结果：hBMSCs在部分脱钙骨上的粘附率为(99.1±1)%;DiI标记的细胞于接种后第2、4、7天激光共聚焦检测,见支架空隙中细胞逐渐增多;电镜观察,接种7天后,电镜下见细胞覆盖了部分脱钙骨表面;自部分脱钙骨中份切开,横断面电镜观察见断面中充满细胞。结论：hBMSCs在部分脱钙骨支架的三维立体环境中生长良好,是一种较好的体外培养方法。     

骨髓基质细胞在气电纺丝蛋白纤维支架上早期粘附的研究

目的检测大鼠骨髓基质细胞在气电纺蚕丝蛋白纳米纤维支架上的早期粘附状况,研究其基本生物学性能.方法将具有良好生物性能的蚕丝蛋白通过气流高压静电纺丝工艺制成纳米纤维,并且通过激光共聚焦显微镜对骨髓基质细胞在气电纺蚕丝蛋白纳米纤维支架表面的早期粘附进行观察.结果骨髓基质细胞对气电纺蚕丝蛋白无纺织物表现出良好的亲和性,细胞在材料表面4h即形成了稳定的粘附,并有部分细胞开始在材料表面铺展,铺展细胞数与粘附细胞数的比率为75.9%,而对照组仅为49.63%.结论气电纺蚕丝蛋白纳米纤维支架具有良好的亲和性,提示其作为骨组织工程材料的可能性.     

骨髓telocytes的形态及免疫表型特征

 目的  探讨骨髓telocytes(TCs)的免疫表型特征。方法  以C57BL/6J小鼠为研究对象,通过扫描电镜原位观察骨髓TCs的形态学特征;分离培养骨髓TCs并利用相差显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察。结果  扫描电镜下,骨髓TCs胞体向外发出极其细长的突起(telopodes,Tps),相邻Tps通过直接接触形成相互联系。细胞培养发现TCs胞体较小,呈椭圆形,胞体发出细长的突起(25033 μm),由膨大的粗段(Podom)与细段(Podomer)交替组成。亚甲蓝染色、吉姆萨染色和詹纳斯绿染色均提示为典型的TCs。免疫荧光染色发现CD34、CD117、CD45、CD73 和 CD90在骨髓TCs中为阳性表达。结论  首次成功分离和培养骨髓TCs,并对其形态学和免疫表型特征进行了描述。     

Ferumoxide标记Flk1＋＋CD31＋-CD34-人骨髓间充质干细胞及其在食蟹猴脑内移植示踪观察

目的探讨Ferumoxide-PLL标记Flk1 CD31-CD34-人骨髓间充质干细胞(hBMSC)的方法及其在食蟹猴脑实质内移植活体示踪的可行性。方法采用Ferumoxide-PLL标记hBMSC,台盼蓝染色、普鲁士蓝染色和透射电镜扫描鉴定标记效率及细胞活力。体外磁共振成像(MRI)分别扫描标记和未标记细胞,计算T2*的弛豫时间和弛豫率(R2*)变化。通过立体定向手术将标记的hBMSC移植入食蟹猴右侧基底节区,采用MRI扫描活体示踪细胞。采用免疫组织化学、普鲁士蓝和HE染色对脑组织切片进行干细胞存活、分化及病理学研究。结果Ferumoxide-PLL标记hBMSC效率为96%,普鲁士蓝染色、电镜可显示标记hBMSC细胞质内铁颗粒。1×106和5×105两组Ferumoxide-PLL标记细胞的T2*的弛豫时间分别为68.86和79.88ms,而未标记细胞分别为12.71和15.24ms。标记细胞的R2*分别为78.68和65.61/s,分别是未标记细胞(14.52和12.52/s)的5.4和5.2倍。移植后3周MRI扫描T2WI仍可发现hBMSC呈明显的低信号。病理及免疫荧光结果显示hBMSCs在移植区大量存活,移植区有大量新生血管,但未见hBMSC向神经细胞分化。结论Ferumoxide-PLL可高效标记hBMSC,能显著增加其MRI图像对比度。MRI可活体示踪干细胞。移植入食蟹猴脑内的hBMSC可大量存活并促进新生血管形成。     

氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞对小鼠造血干祖细胞归巢过程的影响

目的 探讨清除巨噬细胞对小鼠造血干祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells,HSPC）归巢过程的影响。 方法 免疫磁珠分选获得小鼠HSPC,使用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（Carboxyfluorescein diacetate succinimide ester,CSFE）染色标记,采用氯膦酸二钠脂质体（clodronate liposomes,Clod）方法建立去除巨噬细胞的小鼠模型,通过流式细胞术检测HSPC移植的归巢效率,通过实时荧光定量逆转录酶链式反应方法和酶联免疫吸附测定方法检测去除巨噬细胞后骨髓微环境中CXCL12、SCF和人血管内皮细胞粘附分子1(vascular adhesion molecule 1,VCAM1)分子mRNA表达水平和蛋白表达水平的变化。 结果 氯膦酸二钠脂质体作用后第24小时和第48小时,小鼠骨髓中CD11b+F4/80+巨噬细胞数量显著减少（P＜0.05）;移植小鼠HSPC后,相较于对照组,去除巨噬细胞组小鼠HSPC归巢效率显著降低（P＜0.05）;同时去除巨噬细胞组小鼠骨髓微环境中CXCL12、SCF的mRNA和蛋白表达量比对照组显著降低（P＜0.05）,而VCAM1表达量无显著变化。 结论 去除巨噬细胞能够显著降低小鼠HSPC归巢效率,该作用可能与去除巨噬细胞后导致的骨髓微环境中CXCL12与SCF含量减少有关。     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

双光子显微镜用于在体监测小鼠视交叉上核Ca2+动态变化的方法学研究

目的 通过颅底暴露手术联合双光子荧光成像技术实现在体记录视交叉上核(SCN)神经元钙离子活动信号并研究其活动规律的新型方法.方法 对麻醉小鼠实行颅底暴露手术,通过双光子荧光显微镜对已注射钙指示剂的活体小鼠SCN核团钙信号进行实时动态测定.结果 成功建立一套小鼠颅底暴露SCN核团手术方法,术后应用双光子显微镜清晰地检测到SCN核团钙离子荧光信号,也能够实现稳定的在体细胞钙离子成像,并发现不同自发反应细胞中钙离子活动规律差异.结论 通过颅底暴露手术,利用双光子显微镜成功实现了实时监测SCN区域神经元钙离子信号.     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑卒中的磁共振活体追踪

目的探索利用磁共振技术活体追踪干细胞的可行性以及干细胞对卒中大鼠脑梗死体积的影响。方法采集大鼠后肢股骨和胫骨骨髓,采用密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)。利用超顺磁性氧化铁和多聚左旋赖氨酸的混合物标记BMSCs,普鲁士蓝染色检测标记率。线栓法建立18只大鼠脑缺血2h再灌注动物模型,分为缺血对侧BMSCs移植组(细胞数1.5×105/15μl)、缺血同侧纹状体移植组(细胞数1.5×105/15μl)和对照组(15μlD-Hanks液)3组,每组6只。分别在脑缺血后第1天、细胞移植后第1天及第14天进行磁共振扫描,对各时间点梗死体积的变化进行统计学分析。结果超顺磁性氧化铁对BMSCs的标记率为96%。磁共振追踪显示移植后第14天缺血同侧移植组BMSCs向缺血灶边缘迁移,缺血对侧移植组BMSCs沿胼胝体弥散,但是3组之间的脑梗死体积变化差异无显著性(P>0.05)。结论超顺磁性氧化铁对干细胞标记率高,磁共振活体追踪有利于了解干细胞移植后的存活和迁移。BMSCs脑内移植对于卒中大鼠脑梗死体积的影响无统计学意义。