免疫抑制小鼠侵袭性肺烟曲霉菌病动物模型的建立及病理分析

目的:建立侵袭性肺烟曲霉菌病动物模型,探讨免 疫抑制宿主曲霉菌病致病机制.方法:以甲基强的松龙为免 疫抑制剂,造成小鼠免疫抑制,对腹腔巨噬细胞和脾细胞进行 计数.双侧鼻孔滴注烟曲霉菌孢子引起侵袭性肺烟曲霉菌病, 不同时间点处死小鼠,进行组织培养及病理分析.结果:糖皮 质激素注射后小鼠免疫细胞数量急剧下降,腹腔巨噬细胞数 量明显减少[(6.33±1.76)×106vs(3.18±0.57)×106, P<0.01],脾细胞和外周血淋巴细胞数量下降(P<0.01);病 理切片可见免疫抑制小鼠感染烟曲霉菌后肺组织大量烟曲 霉菌聚积,组织坏死,形成肺脓肿.结论:成功建立了免疫抑 制小鼠侵袭性肺烟曲霉菌病动物模型,为研究免疫抑制宿主 易于感染烟曲霉菌的致病机制以及疾病的发生发展奠定基 础.     

ＨＬＡ－Ａ*０２０１转基因小鼠侵袭性肺曲霉病模型的建立与鉴定

摘要：【目的】建立ＨＬＡ－Ａ*０２０１转基因小鼠侵袭性肺曲霉病模型,并进行实验室鉴定。【方法】在真菌孢子感染前,给予ＨＬＡ－Ａ*０２０１转基因小鼠腹腔注射环磷酰胺。乙醚麻醉后,小鼠经鼻腔吸入３组不同浓度的（３×１０６、３×１０７、３×１０８ｍＬ－１）烟曲霉孢子悬液。阴性对照组小鼠吸入ＰＢＳ。感染后３６ｈ,处死各组小鼠,取肺组织病理行ＨＥ、ＰＡＳ以及ＧＭＳ染色分析,以验证感染是否成功并计算肺侵袭性肺烟曲霉感染小鼠模型成模率。肺组织研磨涂皿后行菌落计数,分析小鼠肺烟曲霉负载量。【结果】小鼠肺组织病理检查显示,正常肺组织结构遭到显著破坏,大量菌丝生长并可见菌丝侵犯血管现象,证实侵袭性肺曲霉病模型造模成功。在免疫抑制的方法和条件恒定时,３种孢子浓度由低到高成模率分别为３６．７％、７６．７％、９６．７％。各实验组成模小鼠肺组织研磨液在ＰＤＡ培养基上均有大量烟曲霉菌落生长,未感染小鼠组未见烟曲霉菌落生长。【结论】成功建立ＨＬＡ－Ａ*０２０１转基因小鼠侵袭性肺曲霉病模型,在免疫抑制的方法和条件恒定时,模型成模率与接种孢子悬液的浓度成正比,采用高浓度的孢子悬液（３×１０８ｍＬ－１）时,可以达到较高的成模率。     

免疫抑制BALB/c小鼠侵袭性白念珠菌感染动物模型的建立

目的建立免疫抑制BALB/c小鼠侵袭性白念珠菌感染的动物模型。为研发新型靶向抗真菌药物提供依据。方法对BALB/c小鼠腹腔注射环磷酰胺200 mg/kg,每日1次,连续2次,第4天经鼻腔灌注白念珠菌菌悬液50μl(10~7 cfu/ml),第7天取肺组织标本进行真菌直接镜检、培养、病理检查、(1,3)-β-D-葡聚糖检测及电镜观察。结果小鼠被注射环磷酰胺的第4天,白细胞2.48×10~9/L、中性粒细胞16.8×10~9/L降至最低值。免疫抑制的小鼠经鼻腔灌注白念珠菌菌悬液后的第7天,取肺组织标本进行真菌镜检,镜下可见大量菌丝及芽生孢子,沙堡培养有白念珠菌生长,组织病理可见大量菌丝及芽生孢子及炎性细胞浸润、坏死,(1,3)-β-D-葡聚糖检测(5 181.33±223.67)pg/ml与生理盐水对照组(75.62±18.34)pg/ml比较,差异有统计学意义(t=-4.536,P0.01),透射电镜可见白念珠菌细胞壁为多层板状结构、清晰的细胞膜及细胞器。结论对免疫抑制BALB/c小鼠鼻腔灌注白念珠菌菌悬液后,经取肺组织标本进行真菌检查、培养、病理检查、(1,3)-β-D-葡聚糖检测及电镜观察方法,成功建立了免疫抑制BALB/c小鼠侵袭性白念珠菌感染动物模型,为观察药物在体内对真菌细胞壁及(1,3)-β-D-葡聚糖的影响提供了依据。     

气管插管法建立免疫抑制小鼠侵袭性肺曲霉病模型

目的动物实验被广泛应用于侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)诊断及治疗等方面的研究。文中利用气管插管法建立免疫抑制小鼠IPA模型。方法以环磷酰胺及地塞米松对小鼠进行免疫抑制处理后,气管插管气管内滴入烟曲霉孢子悬液,通过组织病理进行验证,并观察小鼠生存-时间曲线。同时运用平板菌落计数方法比较气管插管法与传统滴鼻法造模实际进入鼠肺的孢子量。结果气管插管法可成功建立小鼠IPA模型。小鼠1周内死亡率为55%,接种24h后肺组织匀浆平板菌落计数显示气管插管法所造成的孢子入肺量为(5.17±0.32)log10CFU/g肺组织,而传统滴鼻法仅为(3.82±0.49)log10CFU/g肺组织。结论气管插管法成功建立小鼠IPA模型,较滴鼻法更适于进行IPA相关研究。     

NF-κB和TNF—α在烟曲霉菌感染小鼠肺组织中的表达

目的探讨核因子-κBB（NF-κB）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在小鼠抗烟曲霉菌早期感染中的作用。方法将小鼠分4组：正常组、免疫抑制组、正常＋烟曲霉菌接种组和IPA模型组。小鼠鼻吸人烟曲霉菌48h处死，取肺组织用western blot法检测胞核NF-κB p65蛋白和细胞中TNF-d的表达。结果正常＋烟曲霉菌接种组和IPA模型组小鼠肺组织细胞核NF-κB p65蛋白和细胞中TNF—α表达的量高于正常组和免疫抑制组；正常组小鼠中检出NF-κB p65蛋白和TNF-α表达的量高于免疫抑制组；免疫抑制组肺组织细胞核NF-κB p65蛋白量最低，并且未检出TNF-α的表达。结论烟曲霉菌早期感染可激活小鼠肺组织中NF-κB并上调TNF-α蛋白的表达。     

免疫抑制小鼠超声雾化吸入新生隐球菌的实验研究

目的探讨超声雾化吸入新生隐球菌引起免疫抑制小鼠发生感染的可行性。方法 24只Balb/c小鼠随机分成2组,环磷酰胺(CTX)组12只腹腔内注射环磷酰胺再超声雾化吸入新生隐球菌,对照组12只直接吸人新生隐球菌。观察小鼠一般状况(食欲、体质量和行为等)和白细胞数目改变;感染3 d和7 d后处死小鼠,取外周血及肺、脑组织匀浆作真菌计数;肺组织切片染色作病理学观察。结果环磷酰胺注射后小鼠食欲差,体质量下降,注射后第4天白细胞数与对照组相比明显降低(2.77±0.45 vs8.26±0.56,P<0.05)。CTX组小鼠在感染后3 d和7 d肺组织真菌负荷明显增高,肺组织菌落形成单位(CFU)分别为271.67±122.22和41.67±0.28,高于正常对照组的(P<0.05);CTX组小鼠感染后3 d和7 d外周血中可检出新生隐球菌,CFU分别为10.17±5.42和9.17±6.34,而对照组外周血在感染后3 d和7 d未培养出新生隐球菌;CTX组小鼠感染3 d和7 d后脑组织CFU分别为6.83±4.92和11.00±5.44,对照组脑组织未培养出新生隐球菌。肺组织病理切片可见免疫抑制小鼠感染后正常肺泡结构消失,肺泡壁增厚,炎性浸润明显,肺内可见新生隐球菌孢子。结论免疫抑制小鼠超声雾化吸入新生隐球菌后,肺组织真菌负荷增多并有明显炎性病变,在外周血和脑组织中可检出隐球菌。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌系统性感染小鼠模型的制备

目的 采用临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染ICR小鼠,建立MRSA系统性感染小鼠模型。方法 采用连续3 d腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg）进行免疫抑制后,将浓度为1×10⁷ cfu/mL的MRSA菌液经尾静脉接种ICR小鼠,通过生存分析、外周血白细胞计数、组织载菌量和病理学检查对模型进行评价。结果 MRSA接种后第2天小鼠开始死亡,14 d内累积死亡率达60%;外周血白细胞总数显著升高,细菌在多个器官定植,载菌量由高到低依次是肾、关节、肺、肝和脑,肾载菌量高达10⁹ CFU/g,关节、肺、肝和脑的载菌量范围在10⁴~10⁹ CFU/g。病理观察显示肾、心脏、肺、肝、脑和关节多器官感染的组织病理学改变。结论 采用环磷酰胺免疫抑制后静脉接种MRSA的方法首次成功建立MRSA系统性感染小鼠模型,该模型可应用于MRSA发病机理及药物筛选等研究领域。     

NF-κB和TNF-α在烟曲霉菌感染小鼠肺组织中的表达

目的探讨核因子-κB(NF-κB)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在小鼠抗烟曲霉菌早期感染中的作用。方法将小鼠分4组:正常组、免疫抑制组、正常+烟曲霉菌接种组和IPA模型组。小鼠鼻吸入烟曲霉菌48 h处死,取肺组织用western blot法检测胞核NF-κB p65蛋白和细胞中TNF-α的表达。结果正     

侵袭性曲霉病大鼠生化指标的改变及烟曲霉分生孢子致病力研究

目的：观察原发侵袭性曲霉大鼠生化指标的改变,探讨烟曲霉分生孢子致病性与其表面小棘状层的密切关系。方法：60只大鼠随机均分为免疫抑制组和非免疫抑制组。非免疫抑制组分为实验组和对照组,分别接种含或不含胰酶的孢子悬液;免疫抑制组先注射环磷酰胺和醋酸可的松．余处理同非免疫抑制组。观察所有大鼠病理学改变,通过内眦静脉采血生化分析、组织器官研磨涂片以及肾脏印模等观察免疫抑制大鼠分生孢子的致病力及菌落生长情况。结果：非免疫抑制组无明显病理学改变。免疫抑制对照组病理学损伤较实验组严重。在相同培养条件下免疫抑制对照大鼠的肾脏印模、血液培养、肺组织可观察到的烟曲霉多于实验组。血清TBIL和DBIL在感染后8h有一过性升高,血清ALP、GGT、TP和Alb无显著改变,LDH、LDH1、CK、CK—MB在2h后即有明显升高,8～24h达到最高峰,为对照组的3～6倍,48～72h后逐渐下降至正常水平。结论：在烟曲霉感染过程中,细胞免疫有很重要的作用。用蛋白质破坏性试剂可除去刺猬毛样小棘状层,经过胰酶预处理的烟曲霉分生孢子所引起的原发侵袭性曲霉病大鼠病理与其对照组有显著差异,提示烟曲霉分生孢子致病力强弱与其表面棘状突起的多寡密切相关。     

免疫抑制小鼠超声雾化吸入新生隐球菌的实验研究

摘要：目的探讨超声雾化吸入新生隐球菌引起免疫抑制小鼠发生感染的可行性。方法24只Balb/c小鼠随机分成2组,环磷酰
胺（CTX）组12只腹腔内注射环磷酰胺再超声雾化吸入新生隐球菌,对照组12只直接吸入新生隐球菌。观察小鼠一般状况（食
欲、体质量和行为等）和白细胞数目改变;感染3 d和7 d后处死小鼠,取外周血及肺、脑组织匀浆作真菌计数;肺组织切片染色作
病理学观察。结果环磷酰胺注射后小鼠食欲差,体质量下降,注射后第4 天白细胞数与对照组相比明显降低(2.77±0.45 vs
8.26±0.56,P<0.05)。CTX组小鼠在感染后3 d 和7 d 肺组织真菌负荷明显增高,肺组织菌落形成单位（CFU）分别为271.67±
122.22 和41.67±0.28,高于正常对照组的(P<0.05);CTX组小鼠感染后3 d 和7 d 外周血中可检出新生隐球菌,CFU分别为
10.17±5.42和9.17±6.34,而对照组外周血在感染后3 d和7 d未培养出新生隐球菌;CTX组小鼠感染3 d和7 d后脑组织CFU分
别为6.83±4.92和11.00±5.44,对照组脑组织未培养出新生隐球菌。肺组织病理切片可见免疫抑制小鼠感染后正常肺泡结构消
失,肺泡壁增厚,炎性浸润明显,肺内可见新生隐球菌孢子。结论免疫抑制小鼠超声雾化吸入新生隐球菌后,肺组织真菌负荷增
多并有明显炎性病变,在外周血和脑组织中可检出隐球菌。
     

一组曲霉单克隆抗体的制备及在免疫病理诊断中的研究

目的 研究一组抗曲霉共同抗原的单克隆抗体,在病理组织切片中特异性诊断曲霉感染的免疫病理学方法。 方法 采用烟曲霉细胞壁抗原、分泌抗原和灭活分生孢子,分别免疫BALB/c小鼠,制备特异性的抗曲霉单克隆抗体,免疫荧光法鉴定单克隆抗体与曲霉属和念珠属抗原的交叉反应。以单克隆抗体检测侵袭性烟曲霉感染兔模型的肾、肝脏组织切片和SARS合并侵袭性曲霉感染病人和"肺曲霉病"患者的肺组织切片。结果 特异性抗曲霉共同抗原的单克隆抗体可敏感检测组织病理切片中曲霉菌丝体抗原。结论 抗曲霉共同抗原的单克隆抗体在免疫病理诊断中为确定组织中曲霉,区分真菌种属提供了有用的工具,具有很好的临床应用前景。     

黄芪多糖对粒细胞减少期侵袭性肺曲霉病SD大鼠血清半乳甘露聚糖的影响

目的 观察黄芪多糖（APS）与两性霉素B（AmB）联合应用对粒细胞减少期侵袭性肺曲霉病（IPA）大鼠血清半乳甘露聚糖（GM）值的影响,并探讨其作用机制.方法 40只清洁级雄性SD大鼠,随机分为5组,每组8只：（1）对照组：正常饲养;（2）模型组：建立IPA模型后正常饲养;（3）APS组：建模后腹腔注射APS 26.27mg（kg·d）×5d;（4）AmB组：建模后腹腔注射AmB 1.575mg（kg·d）×5d;（5）APS＋AmB组：建模后分别予腹腔注射APS 26.27mg（kg·d）×5d＋AmB 1.575mg（kg·d）×5d.（2）～（5）组大鼠经环磷酰胺（CTX）诱导、烟曲霉菌气管内接种建立粒细胞减少期大鼠IPA模型,并于接种后连续腹腔注射给药5d,第5天取大鼠动脉血以ELISA法检测血清中GM值,并取胸腺称重计算胸腺指数,根据统计分析结果评价APS对IPA模型大鼠胸腺指数和血清GM值的影响.结果 对照组胸腺指数高于其余4组,均有统计学差异（均P＜0.05）;APS组、APS＋AmB组与模型组、AmB组比较胸腺指数升高,均有统计学差异（均P＜0.05）;模型组、APS组和APS＋AmB组血清GM检测敏感性均为87.5％,AmB组为75.0％,对照组为0.0％;模型组、APS组、AmB组和APS＋AmB组血清GM值升高,与对照组比较均有统计学差异（均P＜0.05）;APS＋AmB组与APS组、模型组比较,血清GM值减低,均有统计学差异（均P＜0.05）.结论 APS联合AmB治疗粒细胞减少期IPA大鼠能够减轻病情,减低血清GM值,其机制可能与APS提高胸腺免疫功能,减少烟曲霉菌菌丝数量有关.     

侵袭性肺曲霉病小鼠的凝血功能异常及低分子肝素的治疗作用

目的探讨侵袭性肺曲霉病（IPA）小鼠的凝血功能异常及低分子肝素的治疗作用。方法采用环磷酰胺免疫抑制、烟曲霉孢子悬液滴鼻法构建中性粒细胞减少小鼠IPA模型。（1）凝血功能测定：72只小鼠随机分为正常免疫非接种组（A组）、正常免疫接种组（B组）、免疫抑制非接种组（C组）、模型组（D组）,每组18只。烟曲霉孢子接种量为1.5×10^5个孢子/小鼠,接种后每24 h每组随机取6只小鼠进行出血时间、凝血时间、血小板计数及抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）活性测定,共3次。（2）低分子肝素对IPA小鼠生存时间的影响：118只IPA模型小鼠随机分为模型对照组（E组,n=29）、低分子肝素治疗组（F组,n=30,1 000 IU/kg,背部皮下注射,qd×7 d）、两性霉素B治疗组（G组,n=29,1 mg/kg,腹腔注射,qd×7 d）、低分子肝素加两性霉素B治疗组（H组,n=30）。治疗均从接种后24 h开始。烟曲霉孢子接种量为6×10^5个孢子/小鼠。接种孢子后每天观察生存情况1次,至21 d。结果D组接种烟曲霉孢子后24 h即出现血浆AT-Ⅲ活性降低;48 h后出、凝血时间缩短,血浆AT-Ⅲ活性较24 h时降低;72 h后出现明显的血小板减少,出血时间进一步缩短,凝血时间较48 h延长,但仍低于正常,血浆AT-Ⅲ活性进一步降低;上述各指标变化D组与同时间点其他各组比较均有显著性差异（P〈0.01）,在各时间点A组、B组及C组之间比较均无显著性差异（P均〉0.05）。生存分析结果表明,单独应用低分子肝素未提高IPA小鼠21 d存活率,亦未延长平均生存时间（F组与E组比较,P〉0.05）。联合应用低分子肝素与两性霉素B疗效优于单独应用两性霉素B（G组与E组及F组比较,P均〈0.05;H组与E组及F组比较,P均〈0.01;H组与G组比较,P〈0.05）。结论小鼠发生IPA后可出现凝血功能紊乱,血浆AT-Ⅲ活性可以作为IPA出现凝血功能紊乱的早期监测指标。与单独应用两性霉素B?     

原发浸润性肺真菌感染的高分辩CT诊断及鉴别诊断

目的：探讨原发浸润性肺真菌感染的CT表现特点。方法：选取我院28例原发浸润性肺真菌感染患者为研究对象,采用高分辨CT进行诊断检查,对不同感染分类的CT表现特点进行统计分析。结果：共分离出28株病原菌,包括白色念珠菌、曲霉菌、毛霉菌及隐球菌等,其中白色念珠菌12株（42．86％）,曲霉菌6株（21．44％）、毛霉菌4株（14．28％）,隐球菌3株（10．71％）。白色念珠菌所占比例明显高于其他病原菌,差异有统计学意义（均P＜0．05）。28例患者的CT表现分别为肺亚段或肺小叶实变、曲菌球型、弥漫型及结节或肿块样改变,肺亚段或肺小叶实变型13例,所占比例（46．43％）明显高于其他分型,差异均有统计学意义（均P＜0．05）。结论：原发浸润性肺真菌感染的CT临床诊断检出率高,具有较大的临床诊断意义。     

蛤蚧肽对小鼠免疫功能的调节作用

目的:观察蛤蚧肽对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响.方法:动物分组设正常对照组、模型阴性对照组、左旋咪唑(25mg/kg)阳性对照组、蛤蚧肽三剂量(400,200,100 mg/kg)组,腹腔注射环磷酰胺(CTX)造成小鼠免疫功能低下模型,给药7d后,应用MTS法测定小鼠脾淋巴细胞增殖反应、自然杀伤细胞(NK)活性、腹腔...     

肺部侵袭性曲菌病的CT表现

目的:总结侵袭性肺曲菌病的CT表现。方法:回顾分析了经病理确诊的侵袭性肺曲菌病21例,总结其CT表现并与病理对照。结果:21例患者中11例CT表现为不同程度的肺实变,8例患者表现为双肺散在或弥漫磨玻璃影,5例表现为肺内单发或多发结节或肿块,其中3例周围可见晕征,肺内单发或多发空洞3例。结论:肺实变、磨玻璃影、结节及肿块是侵袭性肺曲菌病较早期的表现,空气新月征及空洞影提示病变趋于好转。典型的晕征、空气新月征或空洞对诊断侵袭性肺曲菌病具有一定的特异性。     

大蒜素对烟曲霉菌感染小鼠的细胞免疫功能的影响

目的:探讨大蒜素对烟曲霉菌感染的免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响。方法:将30只昆明种(KM)小鼠随机分为对照组、预防组、治疗组,每组10只。实验前均给予腹腔内注射环磷酰胺(CY)200 mg/kg,制备免疫功能抑制模型鼠。实验时,预防组灌服大蒜素溶液14 d,治疗组灌服大蒜素溶液7 d(第8~14天),对照组灌服等量生理盐水14 d,并于实验第8天时给各组小鼠麻醉后鼻腔滴入烟曲霉菌孢子悬液。采用MTT法检测各小鼠T细胞活性;采用ELISA法检测各小鼠脾细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ的表达水平。结果:预防组T淋巴细胞增殖活性、IFN-γ、IL-12水平与对照组比较,差异有显著性(P<0.01);治疗组与对照组比较,两者间有显著性差异(P<0.01);预防组和治疗组比较,两组间也有差异(P<0.05)。结论:治疗组和预防组脾脏T淋巴细胞增殖活性、IL-12和IFN-γ的水平均有提高,提示大蒜素可提高小鼠细胞免疫功能,增强机体抵抗烟曲霉菌感染能力。     

变态反应性支气管肺曲菌病48例临床分析

回顾2004年至2011年确诊的48例变态反应性支气管肺曲菌病患者的临床资料。其中男23例,女25例,年龄（36±15）岁;95．8％（46／48）有发作性喘息、89．6％（43／48）咳嗽,85．4％（41／48）咳痰。患者嗜酸性粒细胞和总IgE均有增高,曲霉菌抗原皮内试验呈速发阳性反应,烟曲霉特异性IgE均增高,26例痰曲霉培养阳性;胸部CT表现45例见斑片渗出影,40例病灶呈游走性,35例见中心性支气管扩张,18例见痰栓征象;肺功能主要表现为阻塞性通气功能障碍。     

间断腹腔注射脂多糖制作内毒素诱导的小鼠急性肺损伤肺纤维化动物模型

目的探讨采取小剂量脂多糖(LPS)间断腹腔注射的方式制作内毒素诱导的小鼠ALI和肺纤维化动物模型,了解该方法引起的肺急性炎性反应以及纤维化的发展过程。方法健康C57BL/6小鼠40只随机分为阴性对照组(Con组)、LPS-3d组、LPS-2周组和LPS-4周组,每组10只。对三个LPS处理组连续3d腹腔注射LPS(5mg/kg),分别于各观察终点(3d、2周和4周)取材;对Con组连续3d腹腔注射等体积生理盐水,于注射后3d取材。通过HE染色和Van-Gieson胶原染色及Ashcroft肺纤维化评分了解LPS刺激后不同时期小鼠肺组织炎症和纤维化发展的过程,同时采用RT-PCR检测了解肺组织Ⅰ型前胶原和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA表达强度,通过肺组织羟脯氨酸含量测定了解肺间质胶原沉积和纤维化程度,并观察各组实验动物的存活情况。结果小鼠在接受LPS腹腔注射后3d肺组织即出现急性炎性反应;注射后2周,肺间质出现胶原沉积,Ashcroft纤维化评分增高;4周形成明显肺间质纤维化,Ashcroft纤维化评分进一步升高。肺组织胶原及α-SMA的表达量自LPS刺激后3d起增高,4周后达到高峰。到观察终点所有动物全部存活。结论LPS诱发的ALI和炎性反应在感染早期即启动了纤维化进程。使用剂量为5mg/kg的LPS对于小鼠进行连续3d腹腔注射可以成功制作内毒素诱导的小鼠ALI和肺纤维化的动物模型,制作成功率高,动物死亡率低,适合对小动物进行较长时间的观察和研究。