重组E.coli. LLO/OVA明显增强小鼠CD11c细胞活性及抗肿瘤免疫

目的 探讨重组E.coli. LLO/OVA 诱导C57BL/6小鼠机体免疫的途径,观察其免疫后小鼠机体抑制B16-OVA黑色素瘤的效果.方法 磁珠分离E.coli. LLO/OVA及E.coli. OVA免疫后小鼠脾脏CD11c、CD4 和CD8 T细胞并检测CD11c细胞诱导同源CD4 和CD8 T增殖水平和细胞因子分泌程度;流式细胞检测小鼠脾脏内肿瘤抗原OVA257-264 SIINFEKL特异的细胞毒T细胞含量.比较两种E.coli. 免疫后,恶性黑色素瘤B16-OVA在小鼠肺内形成瘤结节的数量.结果 与E.coli. OVA相比, E.coli. LLO/OVA免疫后小鼠脾脏CD11c细胞诱导同源CD4 T细胞增殖作用增强、IL-2分泌增高;同时诱导CD8 T细胞增殖和IFN-γ分泌的作用也明显增强;OVA257-264 SIINFEKL特异的CD8 T细胞含量也明显增高;小鼠肺内形成B16-OVA瘤结节平均数明显减少. 结论 E.coli. LLO/OVA有效地诱导小鼠CD11c细胞活化,增强其对CD4 T细胞增殖和IL-2分泌以及对CD8 T细胞增殖、IFN-γ分泌的作用,诱导了更多的OVA特异的CD8 T细胞,使机体产生了更强的抗肿瘤免疫.     

抗原特异性CD4+CD25+ T细胞的制备及功能鉴定

目的: 制备供体抗原特异性CD4+CD25+调节性T细胞,并对诱导的细胞进行免疫生物学功能鉴定?方法:分离供体ICR小鼠的脾细胞经尾静脉免疫BALB/cByJ小鼠,每周1次,连续3周?第4周,体外免疫磁珠分离技术(MACS)分选被免疫小鼠CD4+CD25+ T细胞和CD4+CD25-T细胞?混合淋巴细胞反应和ELISA检测细胞的功能?结果:体外共培养实验显示,被免疫BALB/cByJ小鼠的脾细胞呈低增殖反应?CD4+CD25+T细胞能够抑制同种异体抗原刺激的天然(na?觙ve)BALB/cByJ小鼠CD4+CD25-T细胞的增殖反应和γ干扰素(IFN-γ)的分泌?结论:供体特异性脾细胞输注后分选的CD4+CD25+调节性T细胞是抗原特异性的,在体外具有免疫无能性和免疫抑制性?     

穿龙薯蓣皂苷元对DBA1/J小鼠CD4+CD25-T细胞的影响

目的 初步探讨穿龙薯蓣皂苷元对DBA1/J小鼠CD4+CD25-T细胞的影响.方法 采用MACS磁珠分选法分离DBA1/J小鼠脾CD4+CD25-T细胞,并鉴定纯度.穿龙薯蓣皂苷元作用CD4+CD25-T细胞后,采用ELISA方法检测各组培养上清中IL-10的浓度,Real-Time PCR方法检测Foxp3的水平,FCM检测Treg细胞的比率.结果 免疫磁珠术分选D B A1/J小鼠脾C D4+C D25-T细胞纯度达93.89％.给药作用48h后,与对照组相比,穿龙薯蓣皂苷元组上清中IL-10的浓度显著升高(P<0.05),Foxp3 mRNA水平明显上升(P<0.05),Treg细胞比率明显升高(P<0.05).结论 穿龙薯蓣皂苷元能明显提升DBA1/J小鼠脾脏CD4+CD25-T细胞上清中细胞因子IL-10浓度,Treg细胞Foxp3 mRNA水平及Treg细胞比率.     

CD4+CD25+调节性T细胞在糖尿病发病中作用的研究

目的:探讨CD4+CD25+调节性T细胞在糖尿病发病中的作用及机制。方法:选取BALB/c小鼠,每日腹腔注射链脲佐菌素(STZ)40mg/kg,连续5天,建立1型糖尿病模型;从小鼠内眦静脉采血,检测血糖;取小鼠尿液,检测尿糖;流式细胞术检测两种小鼠感染不同时间脾细胞悬液中CD4+T细胞和CD4+CD25+T细胞百分含量;ELISA法检测脾细胞培养上清IFN-γ和IL-10水平。结果:BALB/c小鼠的IFN-γ水平在注射STZ第2周和4周明显增高(P<0.05);IL-10水平在注射STZ第2周和4周明显降低(P<0.05);CD4+T细胞数量在注射STZ第2周未见明显升高,第4周水平明显升高(P<0.05);CD4+CD25+T细胞数量在注射STZ第2周和4周明显降低(P<0.05)。结论:CD4+CD25+调节性T细胞通过抑制Th1型细胞因子分泌,分泌IL-10等细胞因子,防止糖尿病的发生,维持自身耐受。     

n⁃3多不饱和脂肪酸对NOD小鼠T细胞的免疫调节作用

目的：探讨n?3多不饱和脂肪酸（n?3 poly unsaturated fatty acid,n?3 PUFA）对NOD小鼠T细胞免疫学功能的影响。 方法： 野生型Balb/c小鼠和已出现典型的Ⅰ型糖尿病症状的NOD小鼠脾 细胞,磁珠分选后获得小鼠CD4+ T细胞,将其分 为4组：野生型 鼠为Wild type组;NOD小鼠分为未处理组、二十二碳六烯 （docosahexaenoic acid,DHA）处理组、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid,EPA）处理组。DHA、EPA处理24h,PMA和Ionomycin刺激活化后,采用CCK?8法检测T细胞增殖 流式细胞仪检测Th1/Th2极化、ELISA法检测T细胞细胞因子的分 水平变化。结果：DHA、EPA对T细胞增殖具有显著抑制作用,促 NOD小鼠Th2细胞分化,抑制Th1细胞分化,经ELISA检测,DHA EP 能够抑制T细胞IL?6、IL?17的分泌。结论：n?3多不 饱和脂肪酸 过抑制T细胞增殖,平衡Th1/Th2比例和抑制IL?6、IL?17的分泌对NOD小鼠的T淋巴细胞起到免疫抑制作用。     

弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞持续性免疫应答

目的观察弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导的脾淋巴细胞的免疫应答及持续时间。方法96只BALB/c小鼠随机分为免疫组和对照组,免疫组以弓形虫复合黏膜疫苗20μl/只(20μg可溶性速殖子抗原 1μg霍乱毒素)滴鼻免疫2次(间隔2周),对照组以PBS滴鼻。分别于末次滴鼻后第1,2,3,4,6,8,10,12周处死小鼠,脾淋巴细胞计数,免疫细胞化学法检测CD4 、CD8 T细胞亚群水平。结果免疫组小鼠于第1,2周脾淋巴细胞明显高于对照组(P<0.01),其中以CD4 T细胞增生为主,第1,2,3,4,6周增生显著(P<0.01),CD8 T细胞水平在第2,3周也有增生(P<0.05),CD4 /CD8 比值第6周高于对照组(P<0.01)。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠可有效诱导脾淋巴细胞增殖性免疫应答,且可持续较长时间。     

钩吻素子对免疫磁珠分离纯化的小鼠CD4+T细胞体外增殖的影响

目的 探讨小鼠脾脏CD4⁺T细胞的分离方法,观察钩吻素子(Kou)对小鼠脾脏CD4⁺T细胞体外增殖的影响.方法 以免疫磁珠分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD4⁺T细胞,流式细胞术检测所得细胞的纯度,台盼蓝法检测细胞活力.将10～20μg/ml Kou分别作用于经刀豆蛋白A或植物血凝素刺激的小鼠T淋巴细胞,四唑盐比色法检测细胞增殖情况,用酶联免疫法检测细胞上清中IL-2的含量.结果 经过流式细胞仪测定分离后的小鼠脾脏CD4⁺T细胞纯度达到90.%±5.8%:0.2%台盼兰染色细胞活力为94.9%±.6%;增殖试验表明分离后未加Kou的CD4⁺T细胞对刀豆蛋白A、植物血凝素的刺激保持了良好的增殖能力,当浓度范围为20～20μg/ml时,Kou均能抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05),且表现出一定的剂量相关性;不同浓度的Kou(20、100、200μgm1)作用后,CD4⁺T细胞培养上清中的IL-2水平明显低于对照组(P<0.05).结论 免疫磁珠阴性分选法操作简单、快速,可获得较高纯化率、有活性的CD4⁺T细胞;Kou明显抑制小鼠CD4⁺T淋巴细胞增殖反应,此抑制作用可能与Kou抑制小鼠CD4⁺T细胞IL-2的分泌及免疫抑制作用相关.     

两种方法分离小鼠脾原始T淋巴细胞效果比较

目的比较Ficoll-Paque梯度离心法与免疫磁珠法分离T淋巴细胞的效果差异,筛选有效的、优异的分选小鼠脾原始T淋巴细胞方法。方法分别采用Ficoll-Paque梯度离心法及Miltenyi Biotec免疫磁珠进行小鼠淋巴细胞分离。血小板计数器统计单核淋巴细胞数,苔盼蓝染色判断细胞存活率,流式细胞术鉴定CD4＋CD62＋T淋巴细胞纯度,并进行统计学分析。结果免疫磁珠法CD4＋CD62＋T淋巴细胞纯度较高为（66.27±3.52）%,Ficoll-Paque梯度离心法细胞纯度为（15.27±4.16）%,两者比较差异有统计学意义（P〈0.01）;但Ficoll-Paque梯度离心法获取淋巴细胞数（1.47±0.35）×10^8较免疫磁珠法的（0.67±0.26）×10^8多,两者比较差异有统计学意义（t=8.199,P〈0.01）,且Ficoll-Paque梯度离心法细胞存活率（93.9±2.6）%较免疫磁珠法的（89.9±2.9）%高,两者比较差异亦有统计学意义（P〈0.05）。结论免疫磁珠法适合分离小鼠脾原始T淋巴细胞并用于细胞纯度要求高的免疫学实验,但细胞得率需进一步优化。     

靛玉红诱导免疫性血小板减少性紫癜小鼠免疫耐受机制的研究

目的 探讨靛玉红对免疫性血小板减少性紫癜(ITP)小鼠模型的治疗作用.方法 Wistar大鼠血小板免疫CBA小鼠20只,建立ITP动物模型,随机分为两组,实验组给予靛玉红腹腔注射,对照组给予PBS腹腔注射,在建模第4周分离小鼠脾细胞,MIT检测脾细胞增殖,流式细胞仪检测小鼠脾中淋巴细胞表型(CD4、CD8、CD25、Foxp3),并以MACS分离CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)进行混合淋巴细胞培养(MLR),评价调节性T细胞的抑制功能.结果 靛玉红通过抑制ITP小鼠脾细胞增殖,减少CD4细胞的数量,提高CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的相对比例,有效改善ITP的血小板减少程度,而MLR显示靛玉红并不抑制Treg的抑制功能.结论 靛玉红可通过影响调节性T细胞诱导ITP免疫耐受.     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

CIK、DC-CIK细胞杀伤胃癌MKN-28细胞的作用比较

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后对胃癌MKN-28细胞株的杀伤作用。方法取正常人外周血,分离出外周血单个核细胞(PBMC),加入不同的细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,共培养成DC-CIK细胞,以MTS法测定不同组CIK细胞对MKN-28杀伤活性。结果与单纯CIK细胞相比较,DC-CIK组细胞增殖速率明显提高(P<0.05);具有更强的杀伤胃癌MKN-28细胞株的活性(P<0.05),效靶比为20.0∶1时,DC-CIK组对MKN-28的杀伤活性为(38.02±2.06)%,>CIK组的(29.78±1.84)%,差异有统计学意义。结论 DC-CIK细胞是一种增殖活性和细胞毒作用均高于单纯CIK细胞的免疫活性细胞。     

基质细胞对髓性白血病细胞的促分化作用

髓性白血病存在着骨髓基质细胞的异常。本文从基质细胞对骨髓造血细胞的支持作用、基质细胞异常与髓性白血病的关系、基质细胞对髓性白血病细胞株的促分化作用以及细胞因子对髓性白血病的促分化作用等几个方面对国内外文献进行了综述,阐明基质细胞对髓性白血病细胞的促分化作用,并描述基质细胞的应用前景。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

肝干细胞--肝卵圆细胞的研究进展

对于肝卵圆细胞的研究已有一定时间，但近几年才明确其属于干细胞范畴，笔者简要综述了肝卵圆细胞的特征、来源、调控分化及与肝病的关系。     

Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Cells to Neural Cells

Summary： To explore the possibility and condition of differentiation of bone marrow mesenchymal ceils （BMSCs） to neural ceils in vitro, BMSCs from whole bone marrow of rats were cultured. The BMSCs of passage 3 were identified with immunocytochemical staining of CD44 （ ＋ ）, CD71 （ ＋ ） and CD45（-）, There were type I and type H ceils in BMSCs. Type I BMSCs were spindlehaped and strong positive in immunocytochemical staining of CD44 and CD71, whereas flat and big type H BMSCs were lightly stained. The BMSCs of same passage were induced to differentiate into neural ceils by β-mercaptoethanol （BME）. After induction by BME, the type I BMSCs withdrew to form neuron-like round soma and axon-like and dendrite-like processes, and were stained positively for neurofilament （NF）. The type H BMSCs did not change in the BME medium and were negatively or slightly stained of NF.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.