丹参素对IL-1β刺激的大鼠肝星状细胞JNK、NF-κB信号通道的影响

目的 观察丹参素对活化的大鼠肝星状细胞(HSC)氨基末端蛋白激酶(JNK)以及NF-κBP65表达的影响,探讨其抗肝纤维化作用的机制.方法 分离大鼠原代HSC,MTT法检测丹参素对细胞的生长抑制,免疫细胞化学法观察Ⅲ型胶原合成,ELISA法观察Ⅲ型胶原分泌.AO/EB荧光染色观察HSC凋亡形态学变化,Annexin-V-FITC/PI联合流式细胞仪检测HSC的凋亡率,Western blotting观察丹参素对IL-1β刺激的HSCs内P-IκBα、NF-κBP65和JNK蛋白的表达.结果 和结论丹参素可抑制活化的HSC增殖,降低胶原合成和分泌,促进HSC凋亡,并抑制IL-1β刺激的HSC中JNK的磷酸化及NF-κBp65的表达.     

丹参素对PDGF-BB刺激下肝星状细胞的抑制作用

目的观察丹参素对PDGF-BB刺激下大鼠肝星状细胞活化增殖,Ⅰ、Ⅲ型胶原合成与分泌,ERK1/2和PI3K通道蛋白表达的影响,探讨丹参素抑制肝纤维化的分子机制。方法用不同浓度丹参素(0.250、0.125、0.062 mmol/L)、ERK通道特异性抑制剂UO126(20 nmol/L)和PI3K通道特异性抑制剂LY294002(20 nmol/L)分别作用于经血小板衍生生长因子PDGF-BB(10 ng/ml)处理的大鼠肝星状细胞(HSC)48 h,CCK8法检测HSC增殖活性,免疫化学染色法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原合成,酶联免疫吸附法观察Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌,Western blot测定ERK1/2、p-ERK1/2、AKT和p-AKT蛋白表达。结果 PDGF-BB 10 ng/ml处理后,HSC增殖明显增加(0.139±0.009),丹参素能抑制PDGF-BB刺激大鼠HSC增殖的作用,并随丹参素浓度增加(0.062、0.125、0.250 mmol/L)细胞增殖受到的抑制作用越强(0.102±0.008、0.083±0.007、0.066±0.014,P<0.05),Ⅰ、Ⅲ型胶原合成及分泌均显著减少(P<0.05),p-ERK1/2和p-AKT蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论丹参素可通过抑制PDGF-BB诱导的HSC增殖和活化,同时抑制与肝纤维化密切相关的MAPK、PI3K途径中ERK、AKT蛋白的磷酸化,负性调控肝纤维化过程,其机制可能与抑制ERK1/2和PI3K信号转导通路有关。     

丹参素对肝星状细胞ERK1/2信号转导通路的影响

目的:观察丹参素对血小板衍生生长因子-BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)刺激大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖、Ⅰ型胶原合成、磷酸化细胞外信号调节激酶1,2(Phosphoryhted extracellular signal-regulated kinase 1/2,P-ERK1/2)表达的影响,探讨丹参素抗肝纤维化的分子机制.方法:四甲基偶氮唑盐法检测大鼠HSC增殖活性;免疫细胞化学染色法测定大鼠HSC Ⅰ型胶原合成的表达;Western blot测定大鼠肝星状细胞P-ERK1/2的表达.结果:丹参素有抑制PDGF-BB刺激大鼠HSC增殖,Ⅰ型胶原表达,p-ERK1/2表达的作用.结论:丹参素可抑制PDGF-BB刺激的大鼠HSC增殖,Ⅰ型胶原合成,其机制可能与抑制ERK1/2信号转导通路有关.     

汉防己甲素对脂多糖刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的观察汉防己甲素对脂多糖刺激的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及瘦素表达的影响,并观察Ⅰ型胶原表达的变化。研究汉防己甲素抗肝纤维化过程中的作用和机制。方法用脂多糖刺激大鼠肝星状细胞后,加汉防己甲素分组培养。采用MTT法测定细胞增殖,ELISA法检测其上清液瘦素和Ⅰ型胶原水平。结果脂多糖可刺激HSC增殖,汉防己甲素抑制脂多糖刺激的HSC增殖,并抑制瘦素和Ⅰ型胶原的表达。结论汉防己甲素可能通过抑制HSC增殖和抑制瘦素的分泌发挥抗纤维化作用。     

红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞激活后功能的影响

目的:观察红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖、细胞周期、Ⅰ型胶原蛋白分泌及TGFβ1 mRNA表达的影响.方法:常规细胞培养,红景天甙对乙醛刺激的HSC进行处理;以MTT比色法检测细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞周期,ELISA法检测HSC内Ⅰ型胶原蛋白的分泌,RT-PCR方法检测HSC内TGFβ1 mRNA表达.结果:红景天甙可明显抑制乙醛刺激的HSC增殖;抑制乙醛刺激的HSC由G1→S期转化;抑制HSC内Ⅰ型胶原蛋白分泌和TGFβ1 mRNA表达.结论:红景天甙抗肝纤维化与抑制HSC增殖,Ⅰ型胶原蛋白分泌和TGFβ1 mRNA表达有关.     

老鹰茶总黄酮中山奈酚-葡萄糖苷对TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制

目的 观察老鹰茶总黄酮中山奈酚-葡萄糖苷对TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制.方法 选用SD大鼠,分离出大鼠肝星状细胞(HSC)进行培养;MTT法检测4种黄酮类单体对HSC增殖的抑制作用;RT-PCR方法 检测分析其对HSC的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Smad2、Smad3及Smad7受体中mRNA的表达的影响.结果 4种黄酮类单体中山奈酚-葡萄糖苷能够较强的抑制HSC增殖;能够明显下调HSC的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Smad2及Smad3中mR-NA的表达,上调Smad7 mRNA的表达.结论 老鹰茶总黄酮中山奈酚-葡萄糖苷相比于其它几种单体较明显抑制HSC的增殖作用,对TGF-β/Smad通路的影响可能是其抗肝纤维化的作用机制之一.     

川芎嗪抑制H_2O_2诱导肝星状细胞活化的研究

目的建立体外氧化应激诱导肝星状细胞(HSC)活化模型,探讨活血化瘀中药活性成分川芎嗪对该HSC活化模型的作用及潜在机制。方法原代大鼠HSC体外给予不同剂量过氧化氢(H2O2)处理并检测HSC活化标志物,筛选出H2O2诱导HSC活化的有效浓度;以MTS法和流式细胞术检测川芎嗪对H2O2刺激下HSC增殖与凋亡的影响;以Real-time PCR和Western blot检测H2O2刺激下HSC中肝纤维化标志物的基因与蛋白表达。结果体外H2O2在5μmol/L剂量下能够显著促进HSC增殖和活化标志物的表达。川芎嗪能够剂量依赖性地抑制H2O2诱导的HSC增殖,诱导其发生凋亡,并降低肝纤维化标志物的基因与蛋白表达;此外,川芎嗪还可抑制基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1(TIMP-1)的蛋白表达,从而调控ECM的降解平衡。结论川芎嗪能抑制H2O2诱导的氧化应激状态下的HSC活化,可作为抗肝纤维化潜在药物进一步研究其作用机理。     

红景天甙对HSC—T6细胞株Rho／ROCK信号通路影响的研究

目的:观察红景天甙对大鼠肝星状细胞株HSC-T6细胞增殖活化、胶原合成、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶-I(Rho associated coiled coil forming protein kinase-Ⅰ,ROCK-Ⅰ)及基质金属蛋白酶抑制剂-1(Tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)表达的影响并以ROCK特异性抑制剂Y-27632作为阳性对照,探讨红景天甙抗肝纤维化作用的分子机制.方法:MIT法检测HSC-T6细胞生长增殖;酶联免疫吸附(ELlsA)法检测HSC-T6 细胞上清Ⅰ型胶原含量;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、ROCK-Ⅰ、TIMP-1mRNA的表达;Western blot 检测细胞α-SMA、ROCK-Ⅰ、TIMP-Ⅰ蛋白表达.结果:MTT检测显示红景天甙和Y-27632对HSC-T6细胞的生长增殖具有抑制作用,并呈剂量依赖性;ELISA结果提示红景天甙和Y-27632可抑制HSC-T6细胞I型胶原的分泌;Real-time PCR和Western blot结果表明红景天甙和Y-27632均能下调HSC-T6细胞ROCK-Ⅰ、TIMP-1和α-SMA的表达.结论:红景天甙可抑制HSC-T6细胞活化增殖.减少其Ⅰ型胶原分泌,其机制可能与抑制HSC-T6细胞的Rho/ROCK信号通路有关.     

LPS诱导HSC增殖与提高其胶原表达水平的细胞模型研究

目的建立较为全面反映肝星状细胞活化效应的细胞模型。方法应用脂多糖刺激体外培养的大鼠HSC。MTT法测定HSC增殖率。免疫组化法显示HSC表达Ⅰ、Ⅲ型胶原水平，并进行图像分析。结果LPS明显刺激HSC的增殖和提高其Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平，与对照组比较有非常显著性差异（P〈0．01）。结论LPS诱导HSC活化模型能够相对全面反映HSC活化效应。     

姜黄素抗血吸虫病肝纤维化及其机制的实验研究

目的 探讨姜黄素抗血吸虫病肝纤维化的作用及可能机制。方法 小鼠随机分为4组：对照组、感染模型组、吡喹酮治疗组和姜黄素治疗组,除对照组外,各组建立血吸虫病肝纤维化小鼠动物模型,用实时荧光定量 PCR 反应观察小鼠肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) mRNA 的表达。应用 HE 染色,免疫组化法及多媒体病理图文定量分析,观察各组小鼠肝脏的病理改变及转化生长因子β1(TGF-β1),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的变化。结果 姜黄素可显著减轻肝脏纤维组织增生。感染模型组及吡喹酮治疗组 PPARγmRNA 表达较对照组及姜黄素治疗组显著减弱 ( P ＜0.05);姜黄素治疗组 TGF-β1,α-SMA 及Ⅰ、Ⅲ型胶原水平均明显低于吡喹酮治疗组和感染模型组 ( P ＜0.05)。结论 姜黄素有明显的抗日本血吸虫病肝纤维化作用,其抗纤维化机制与其激活 PPARγ 的表达、抑制肝星状细胞 (HSC) 表达 α-SMA 及分泌 TGF-β1,并减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成有密切关系。     

乙醛刺激大鼠肝星状细胞活化的动力学分析

目的:从动力学角度分析乙醛刺激大鼠肝星状细胞活化的时间变化,以确定大鼠肝星状细胞活化的最佳时间,从而为后续肝纤维化的相关研究提供实验数据。方法:培养大鼠肝星状细胞,同步化处理12h,随机分为乙醛刺激组和对照组。其中乙醛刺激组细胞加入乙醛(终浓度200μmol/L)分别刺激12h、24h和36h,每12h补加一次乙醛;对照组加入等量培养基。采用MTT法测定各组细胞增殖;ELISA法检测Ⅰ型胶原蛋白、纤维黏连素;Western blotting检测α-SMA的表达。结果:加入乙醛后,细胞的增殖活性随时间的延长而增强,24h细胞增殖活性达最高峰;ELISA测定结果显示,乙醛刺激组较对照组有明显上调;Western blotting检测结果,乙醛刺激组明显促进α-SMA表达量上调,且在24h达高峰。结论:乙醛可激活大鼠肝星状细胞且活化的最佳作用时间为24h。     

肝纤维化中丹参素对TGFβ1/Smads/ERK信号通路的影响及其相互关系

目的探讨肝纤维化过程中转化生长因子β1(transforming growth factorβ,TGFβ1)/Smads/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路的相互作用。方法体外分离培养大鼠肝星状细胞(hepatic stellatecell,HSC),MTT法筛选丹参素最适浓度;以最适浓度丹参素及ERK阻断剂(PD98059)作用于经TGFβ1处理的HSC,CCK-8法检测各组HSC增殖;免疫细胞化学染色法检测各组HSC内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle sctin,α-SMA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;RT-PCR检测各组HSC的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达量;Western blot法检测各组Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化及Smad7蛋白水平。结果 0.062 5～0.25 mmol/L的丹参素可有效抑制HSC增殖,作为最适处理浓度;PD98059(100μmol/L)可抑制TGFβ1诱导的HSC增殖,丹参素剂量依赖性抑制TGFβ1诱导的HSC增殖(P<0.01);TGFβ1促进细胞内α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达,PD98059及丹参素降低TGFβ1诱导的α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原水平;PD98059可拮抗TGFβ1诱导的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达(P<0.05,P<0.01),丹参素下调Smad2、Smad3 mRNA水平,但上调Smad7 mRNA水平(P<0.01);PD98059及丹参素抑制TGFβ1诱导的Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.01),但对TGFβ1诱导的Smad7蛋白表达上调有不同效应(P<0.01)。结论 TGFβ1上调Smad2、Smad3 mRNA表达及蛋白磷酸化,进而诱导HSC增殖、活化及胶原合成,ERK通路可能参与HSC中TGFβ1诱导Smad基因表达及蛋白磷酸化过程。丹参素对TGFβ1/Smad/ERK信号通路具有抑制效应。     

压力负荷增加大鼠模型心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的表达

目的观察压力负荷增加大鼠心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的表达,探讨压力负荷增加大鼠模型心肌纤维化的分子机制。方法SD大鼠随机分为假手术组和模型组（手术组）,利用腹主动脉缩窄法制备压力负荷增加大鼠模型,造模8周后观察左室心肌病理形态胶原染色、左室心肌间质超微结构等心肌纤维化指标的改变;采用RT-PCR的方法检测心肌组织α2（Ⅰ）胶原、α2（Ⅲ）胶原的基因表达。结果假手术组造模后左室心肌胶原染色在心肌细胞间仅有少许鲜红色胶原纤维;模型组造模后左室心肌病理形态胶原染色显示心肌细胞间有大量的鲜红色胶原纤维存在;左室心肌细胞超微结构也见明显异常改变。模型组大鼠左室心肌组织α2（Ⅰ）胶原mRNA表达较假手术组上升（P〈0.01）,左室心肌组织α2（Ⅲ）胶原mRNA表达较假手术组上升（P〈0.05）。结论压力负荷增加大鼠在造模8周后即已形成心肌纤维化的病理生理改变,该改变可能主要是通过降低α2（Ⅰ）型胶原和α2（Ⅲ）型胶原基因表达来实现的。     

龙血素A对大鼠肝星状细胞增殖及Frizzled-4受体蛋白表达的影响

［摘要］目的　研究WNT信号通路中卷曲蛋白-低密度脂蛋白相关蛋白复合受体（Frizzled/LRP）在体外培养活化大鼠肝星状细胞（aHSCs）中的表达及龙血素A（Loureirin A）干预对大鼠肝星状细胞（aHSC）增殖及α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1分泌的影响,探讨龙血素A抗肝纤维化的细胞分子机制．方法　分离SD大鼠肝星状细胞,体外传代培养诱导细胞活化,倒置相差显微镜下观察肝星状细胞活化前后形态学变化,用不同浓度龙血素A处理活化的大鼠肝星状细胞（aHSCs）．MTT法测定龙血素A对肝星状细胞的生长抑制率;Western Blot方法从蛋白水平检测肝星状细胞中Frizzled-4受体蛋白;Elisa测定药物干预后细胞培养上清液中α-SMA和TGFβ1的含量．结果　与对照组相比,龙血素A抑制肝星状细胞增殖并有明显的时间-剂量效应关系,IC50=0.30 μg/μL;龙血素A在蛋白水平显著下调受体蛋白Frizzled-4表达,同时抑制肝星状细胞分泌α-SMA、TGFβ1（P＜0.05）．结论　Frizzled-4受体蛋白在活化的大鼠肝星状细胞（aHSCs）中高表达,经龙血素A干预后,Frizzled-4表达量明显降低,细胞增殖受到抑制,α-SMA、TGFβ1合成和分泌量下降,这提示龙血素A可能与WNT信号通路调节肝纤维发生和血管新生的分子机制相关．     

阿魏酸钠对TGF—β1诱导下肾脏成纤维细胞α-SMA、CTGF表达及细胞外基质合成的影响

目的观察阿魏酸钠（SF）对转化生长因子β1（TGF-β1）作用下肾成纤维细胞（NRK-49F）α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及结缔组织生长因子（CTGF）表达、细胞外基质（ECM）合成的影响,探讨其抗肾间质纤维化的效果及可能机制。方法体外培养NRK-49F细胞,利用MTT观察阿魏酸钠对TGF-β1诱导细胞活力的影响;实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应（Real TimeRT—PCR）检测细胞α-SMA及CTGF mRNA的表达;免疫细胞化学法观察细胞α-SMA、CTGF蛋白表达的情况;ELISA法测定细胞上清Ⅰ型胶原（Col I）、纤维连接蛋白（FN）的表达。结果TGF-β1可以显著增加大鼠肾脏成纤维细胞活力、上调细胞α-SMA、CTGF在mRNA和蛋白水平的表达、增加ColI及FN的合成;阿魏酸钠能够减轻TGF-β1,的上述效应。结论阿魏酸钠可以在一定程度上抑制TGF-β1诱导的肾脏纤维化。     

丙戊酸钠对阿霉素肾病大鼠的肾保护作用

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠（VPA）干预对阿霉素肾病大鼠的肾脏保护作用。方法20只雄性SD大鼠随机分为正常对照组（n=6）和阿霉素肾病组（经阴茎静脉注射阿霉素造模,n=14）,后者造模后随机分为模型组和VPA干预组,每组7只。造模8周后,代谢笼留取尿液,腹主动脉采血后处死动物并取肾脏组织,观察各组大鼠血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（Tc）、谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）、白蛋白（Alb）和尿微量白蛋白与尿肌酐比值（UACR）的变化。天狼星红染色光学显微镜（光镜）下观察大鼠肾小管间质和。肾小球胶原改变;免疫组织化学方法检测肾脏组织α平滑肌肌动蛋白（α—SMA）表达;采用Real-TimePCR技术检测大鼠肾脏组织中Ⅰ型胶原（ColⅠ）、ColⅢ、α-SMAmRNA的表达。结果与正常对照组比较,阿霉素肾病组大鼠SCr、BUN、TG、TC、UACR均显著升高（P〈0．05或P〈0．01）,Alb明显降低（P〈0．01）,肾小球及。肾间质中胶原和α—SMA表达增多;三组大鼠GOT和GPT的差异无统计学意义（P〉0．05）。与模型组比较,VPA干预组SCr、BUN、TC、UACR均显著降低（P〈0．05）,肾小球及。肾间质中胶原和α-SMA表达减少,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和α-SMAmRNA表达下调。结论VPA能显著改善阿霉素肾病大鼠的。肾功能,减轻肾脏组织纤维化程度,延缓病情的进展。     

马兜铃酸对体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞的损伤作用

目的:观察马兜铃酸(aristolochic acid,AA)对体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的损伤作用。方法:体外培养NRK-52E,分别以不同浓度的AA-Na刺激细胞,每组设6个复孔,孵育24 h。透射电镜观察NRK-52E细胞的超微结构,MTT法检测不同浓度AA对NRK-52E细胞增殖的影响,流式细胞仪检测NRK-52E细胞的凋亡,免疫细胞化学法检测AA对NRK-52E细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响;检测不同时间段(12、24、48 h)马兜铃酸对NRK-52E细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)及内皮素-1(ET-1)mRNA和Ⅰ型胶原(ColⅠ)表达的影响。结果:①AA浓度低于10μg/ml时对NRK-52E的增殖无明显影响,20~40μg/ml浓度的AA可明显抑制NRK-52E细胞的增殖;②较高浓度的AA(40μg/ml)可明显刺激细胞凋亡;③AA5、10、20、40μg/ml均可刺激NRK-52E表达α-SMA,其中AA10μg/ml对α-SMA表达较强;④AA刺激NRK-52E细胞24 h后TGF-β1mRNA、ET-1 mRNA表达最多,48 h时表达水平下降,而COL-I的表达水平随时间的延长而上调,呈时间依赖性。结论:AA可直接损伤肾小管上皮细胞,促进其表达肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA,即有促转分化作用,且其对NRK-52E细胞的损伤作用呈剂量及时间依赖性。