应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法，哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料，分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T／A连接构建文库，将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选，随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆，随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增，90％的克隆中均有200～600bp的插入片段，这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库，该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩半后,随机挑取100个白色克隆及菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,95％的克隆中均有100－600bp的插入片段,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T／A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选,克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。     

猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库.方法:15只成年家猫随机分为正常对照组、视神经压迫4周组和视神经压迫8周组(n=5),压迫4周组和压迫8周组猫利用球囊植入法建立慢性视神经损伤模型.取各组动物视神经,TRIzol法提取总RNA,SMART技术合成cDNA,随后利用抑制消减杂交方法分离受压4周和8周视神经中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取300个白色克隆进行菌落PCR鉴定.结果:菌落PCR扩增显示每个文库80%的克隆中均有200～800 bp的插入片段.结论:成功构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆慢性视神经损伤相关差异表达基因奠定了基础.     

抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库

目的 应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库 ,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因. 方法 用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A+ RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与 两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR 产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定, 反向Northern blot分析差异基因的可靠性. 结果 成功地构建了具有高消 减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83.5%的 克隆均具有100～600 bp左右的插入片段. 随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝 癌细胞cDNA为探针,进行Reverse Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡 相关基因cDNA片段. 结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋 亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有 助于了解细胞凋亡的分子机制.     

应用抑制消减杂交技术筛选颞叶癫痫的相关基因

目的 构建颞叶癫痫大鼠海马组织差异表达基因的消减cDNA 文库,筛选颞叶癫痫的差异基因。方法 采用抑制消减杂交方法,以正常大鼠和癫痫大鼠的海马组织作为对比材料,分离组织中差异表达基因的cDNA 片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆,用菌落PCR法筛选差异基因克隆,并进行测序分析。结果 获得14个在癫痫大鼠海马组织中有差异表达,并与大鼠的已知基因片段高度同源的基因。 结论 抑制消减杂交技术是一种高效的筛选差异表达基因的方法,颞叶癫痫大鼠海马组织中存在许多差异表达基因,为深入研究癫痫发病的分子机制提供重要线索。     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

IgA肾病肾阴虚证cDNA文库的构建

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人IgA肾病肾阴虚证cDNA消减文库。方法选择IgA肾病且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用TrizolBD法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaⅠ酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,然后将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建IgA肾病肾阴虚证消减文库。结果用SSH方法筛选出了IgA肾病肾阴虚证的差异cDNA片段,其中正向消减文库共获得325个阳性克隆,反向消减文库获得306个阳性克隆,从而成功地构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA消减文库。结论SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段,成功构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA文库,为进一步克隆肾阴虚证的相关基因奠定了基础。     

HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定

目的:建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库,并从中克隆鉴定出新的应答基因.方法:分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA,用SMART PCR技术合成全长双链cDNA,经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组,分别衔接两个不同的接头,再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR,将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,挑取克隆进行筛选排除假阳性,再行序列分析,鉴定胎肝细胞感染HBV后的差异应答基因.结果:成功构建高效消减的HBV感染胎肝细胞cDNA文库,得到158个白色的克隆,随机选择了128个克隆经PCR扩增获得含有明确单一目的片断的克隆99个,长约100～400 bp,经筛选后得到70个克隆,测序表明有16个差异表达的基因,其中可能的新基因有5个.结论:用抑制性消减杂交技术成功建立了HBV感染培养人胎肝细胞的消减cDNA文库,为进一步大规模筛选HBV感染后的应答基因奠定了基础,初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据.     

二烯丙基二硫诱导HT-29细胞差异表达cDNA文库的构建

目的:构建二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人结肠癌HT-29细胞差异表达cDNA文库,以期寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因。方法:用120μmol/L的DADS处理人结肠癌HT-29细胞,从DADS处理组及对照组HT-29细胞中提取poly A+RNA,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交(SSH)技术构建DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA消减文库,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果:成功构建具有高消减效率的DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,文库扩增得到了500个克隆,随机挑取100个制备质粒,酶切分析均得到150~1 300 bp大小插入片段,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段。结论:建立了DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,为进一步寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因奠定了基础。     

慢性肾炎肾阴虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交(SSH)技术构建汉族人慢性肾炎(CGN)肾阴虚证cDNA消减文库。方法:选择汉族人CGN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建CGN肾阴虚证消减文库。结果:用SSH方法筛选出了CGN肾阴虚证的差异cDNA片段,得到了386个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了CGN肾阴虚证的cDNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建CGN肾阴虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆CGN肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

Suppression subtractive hybridization for identifying differentially expressed genes in renal cell carcinoma

Objective To construct a renal cell carcinoma (RCC) cDNA subtractive library using suppres sion subtractive hybridization.Methods Polyadenylated RNA ［Poly (A)(+) RNA］ was isolated from tissues of RCC and norm al kidney, and single- strand cDNAs and double-strand cDNAs were synthesized in turn. RCC cDNAs were divided into two groups and ligated to the specific adaptors l and 2, and then h ybridized with normal kidney cDNA twice with two rounds of suppression PCR. Sec ond round PCR products were cloned to T/A plasmid vectors to set up the subtract ive library. One hundred clones were randomly picked to perform enzyme digest a nalysis, and some underwent sequence analysis and Northern blot to identify RCC specifically expressed genes. SMART RACE procedure was operated to clone full l ength novel RCC specifically expressed genes.Results A human RCC subtractive library with high subtractive efficiency was successfull y set up. The amplified library contains 350 positive clones. Random analysis of 100 clones with enzyme restriction showed that 85 plasmids in the clones cont ained 50-400 bp inserts. Sequence analysis was performed for 10 clones. All t he 10 sequences were unknown before and derived from 6 unique, novel genes among which the cDNA insert RCC18 had five copies. Northern blot analysis showed tha t RCC18 cDNA was highly expressed in RCC, but no signal could be detected in nor mal kidney. Using SMART RACE technique, we obtained the full length of the nove l gene RCC18.Conclusions The constructed cDNA subtractive library of human RCC is a highly efficient one and lays a solid foundation for large scale screening and cloning new and speci fic oncogenes or tumor suppressor genes of RCC. The novel specifically expresse d genes provided an important clue for studying the mechanisms of occurrence and development of RCC.     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

基于舌鳞癌Tca8113细胞醛脱氢酶活性不同构建差异表达基因cDNA文库

目的构建舌鳞癌Tca8113细胞系中高、低醛脱氢酶活性(high/low aldehyde dehydrogenase activity,ALDHhigh/ALDHlow)细胞差异表达基因cDNA文库。方法用流式细胞仪检测ALDEFLUOR染色的Tca8113细胞中干细胞标志物ALDH的表达,并收集ALDHhigh和ALDHlow细胞;用Trizol分别提取两亚群细胞的总RNA;用抑制性消减杂交(SSH)对2组RNA进行差异基因筛选和扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α。文库扩增后,每库随机挑取24克隆进行酶切、测序及同源性分析。结果分选得到ALDHhigh和ALDHlow两亚群细胞,其中ALDHhigh细胞的比例为2.5%;分光光度计测得ALDHhigh和ALDHlow的RNA D(260)/D(280)的比值分别为1.93和1.92;构建了ALDHhigh和ALDHlow细胞差异基因cDNA双向文库,每个库约500个克隆菌落,每库随机挑选24个菌落进行PCR分析,克隆片段均匀分布在200～700 bp,无假阳性克隆。测序结果经同源性比对分析和PubMed检索,其中与肿瘤有关的基因有SLC25A13、KLHL2、NPC1、WAPL、BARD1、Notch2、EEF2K。结论成功构建ALDHhigh和ALDHlow细胞差异基因cDNA文库。     

慢性间歇缺氧兔模型肝组织cDNA文库构建

目的:构建抑制性差减cDNA文库筛选鉴定慢性间歇性缺氧兔模型肝脏相关基因.方法:选取24只兔随机分成4组,分别为普通饲料喂饲组,高脂饲料喂饲组,间歇性缺氧组和高脂并间歇性缺氧组.提取高脂组和高脂并间歇性缺氧组兔肝脏组织mRNA,酶切cDNA,分别与不同的接头连接,经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR后得到两者之间差异表达的cDNA.将PCR产物与T/A载体连接构建差减cDNA文库.挑选克隆进行PCR扩增鉴定.结果:基于高脂组和高脂并间歇性缺氧组兔腹主动脉和肝病理改变的基础,构建的差减cDNA文库包含500个克隆,其中462个有插入片段,大小为250～700 bp.鉴定获得1个新基因Cthrc1,GenBank登录号XM_418373.结论:对Cthrc1基因的研究有助于进一步阐明慢性间歇性缺氧促进动脉粥样硬化形成的分子机制.     

应用抑制性消减杂交技术筛选脂肪细胞分化相关基因

目的:利用脂肪分化细胞模型筛选与脂肪细胞分化相关的差异性表达基因。方法:采用抑制性消减杂交技术,以诱导分化后的人前体脂肪细胞系SW872总RNA为Tester,诱导分化前的人前体脂肪细胞系SW872为Driver,将消减杂交获得的DNA片段与pGM-T载体连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,并与GenBank数据库进行同源性分析,获得差异性表达基因。结果:扩增消减cDNA文库获得135个白色克隆,随机挑选64个进行测序,共获得34个阳性克隆基因。结论:本研究成功构建了脂肪细胞分化差异性表达基因的消减cDNA文库,筛选出了与脂肪细胞分化相关的差异表达基因。     

人肝脏高凝状态相关基因的筛选

目的 筛选人肝脏高凝状态（PTS）相关基因的全长cDNA序列。方法 采用差异筛选法对本室建立的PTS大鼠肝脏差异表达基因消减cDNA文库进行筛选；以获得的差异cDNA克隆为模板，采用PCR方法扩增目的片段；以PCR产物作探针，用噬菌斑原位杂交法筛选人肝脏cDNA文库，经初筛、二筛和三筛后，将获得的阳性克隆转入E．coli BM 25．8，使λTripIEx环化成质粒pTripIEx，经酶切鉴定后进行DNA测序。结果 从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条全长cDNA序列，经序列测定及生物信息学分析发现，其中3条的表达产物分别为纤维蛋白原、纤维蛋白原相关蛋白、10号染色体开放阅读框架104mRNA；另1条与氨基甲酰磷酸合成酶1同源。结论 以PTS大鼠肝脏差异表达基因cDNA为探针，从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条PTS相关cDNA全长序列。