青蒿琥酯和二氢青蒿素抑癌作用机理研究

【目的】基因芯片检测青蒿琥酯和二氢青蒿素作用于K562细胞后的基因表达情况,从基因水平上探讨青蒿琥酯和二氢青蒿素抑制K562增殖的作用机制。【方法】K562细胞经不同浓度青蒿琥酯和二氢青蒿素处理,倒置光显微镜和荧光显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞周期,MTT检测细胞生长抑制率。提取总RNA,逆转录成cDNA与基因芯片杂交,检测杂交结果。【结果】倒置光显微镜：细胞出现不同程度的皱缩,核分裂相减少,细胞密度下降,漂浮细胞增多。荧光显微镜：染色质高度浓缩、边缘化,凝聚成明亮的团块。流式细胞仪：G2期细胞的比例增加。MTT检测两种药物对K562细胞生长有抑制作用。扫描杂交信号,分析数据,青蒿琥酯组10条基因表达有差异,表达上调的基因有：p21、chk1,表达下调的基因有：cyclinB1、cyclinE1、E2F1、DNA—PK、hTERT、bcl-2、jnk、VEGF;二氢青蒿素组13条基因表达有差异,表达上调的基因有chk1,表达下调的基因有：PCNA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE1、cdk4、cdk2、E2F1、DNA—PK、DNA—TopoⅠ、Mcl-1、ink、VEGF。【结论】青蒿琥酯和二氢青蒿素抑制K562细胞增殖,作用机制与改变细胞周期某些调控物质的基因表达、诱导K562细胞凋亡等有关。     

基因芯片技术分析二氢青蒿素抑制K562细胞增殖的作用机制

[目的]利用基因芯片检测二氢青蒿素作用于K562细胞后的基因表达情况,从基因水平探讨二氢青蒿素抑制K562细胞增殖的作用机制。[方法]K562细胞经不同浓度二氢青蒿素处理24h,倒置光显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞周期变化。提取总RNA,逆转录生成cDNA,同时Cy3标记。标记好的cDNA与基因芯片杂交,用扫描仪检测杂交结果。[结果]倒置光显微镜可见细胞出现不同程度的皱缩,核分裂相减少,细胞密度下降,漂浮细胞增多。荧光显微镜下可观察到染色质高度浓缩、边缘化,凝聚成明亮的团块,即凋亡小体,同时有死亡细胞。流式细胞仪检测显示G2期细胞的比例明显增加。扫描杂交结果数据显示其中13条基因表达有差异。表达上调的基因有chk1,表达下调的基因有：PCNA、cyclinB1、cyclinD1、cyclinE1、cdk4、cdk2、E2F1、DNA-PK、DNA-TopoⅠ、mcl-1、jnk、VEGF。[结论]二氢青蒿素可以抑制K562细胞增殖,作用机制与改变细胞周期某些调控物质的基因表达、诱导K562细胞凋亡等有关。     

青蒿琥酯对K562细胞bcl-2基因表达的影响

【目的】研究青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡过程中bcl-2表达的改变。【方法】培养K562细胞,倒置光显微镜和荧光显微镜观察青蒿琥酯处理的K562细胞形态,RT-PCR检测bcl-2的表达。【结果】K562细胞经青蒿琥酯处理48h后,倒置光显微镜：细胞出现不同程度的皱缩,核分裂相减少,细胞密度下降,细胞出现发泡现象,细胞内可见多个折光性较强的圆形小泡样结构。荧光显微镜：染色质高度浓缩、边缘化,凝集成明亮的团块。RT-PCR显示青蒿琥酯处理的K562细胞的bcl-2的表达下调。【结论】青蒿琥酯抑制K562细胞生长的机制可能与bcl-2基因的表达下调有关。     

青蒿琥酯诱导人白血病细胞K562胀亡和凋亡作用的研究

目的:探讨青蒿琥酯(Artesunate,ART)对人慢性粒细胞性白血病细胞株K562增殖抑制的影响.方法:采用MTT比色法检测青蒿琥酯对体外培养的K562细胞的生长抑制作用,光、电镜下观察青蒿琥酯作用后的K562细胞形态学变化特征,流式细胞仪检测在不同浓度、不同时间作用下青蒿琥酯诱导K562细胞的细胞胀亡率和凋亡率.结果:青蒿琥酯对K562细胞有明显的增殖抑制作用,24h、48h、72h的半数抑瘤浓度IC50(μg/ml)分别为65.17、31.63、10.51.青蒿琥酯主要引起K562细胞的胀亡和凋亡变化,但胀亡率与凋亡率尤明显差别.结论:青蒿琥酯主要通过胀亡和凋亡2种方式抑制K562细胞增殖,并呈明显量效时效关系.     

Bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡

目的:研究bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应. 方法:合成bcl-2反义核酸(ASON)导入K562细胞,应用Western blot法检测bcl-2蛋白的表达,TUNEL技术、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡. 结果:bcl-2反义核酸(ASON)能明显抑制bcl-2蛋白的表达. 青蒿琥酯在1～7 mg/L浓度范围内能分别明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性, 7 mg/L青蒿琥酯作用72 h的K562细胞株A值最低. 原位细胞凋亡检测可见细胞变小,核固缩为一个或多个染色质团块,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2 ASON转染的K562细胞株对青蒿琥酯的诱导凋亡作用更加明显;FCM法出现低于G1期DNA含量的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡主要发生在G1/S期,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2 ASON转染的K562细胞凋亡率显著增加. 结论:青蒿琥酯在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡,bcl-2反义核酸可增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡的作用.     

青蒿琥酯诱导人白血病细胞K562凋亡的实验研究

目的观察青蒿琥酯对人白血病细胞株K562抑制增殖和凋亡作用.方法通过MTT显色法观察不同浓度青蒿琥酯对K562的生长抑制作用,通过Annexin V/PI双标记法检测青蒿琥酯对K562细胞的凋亡诱导作用.结果青蒿琥酯在1～8μg/ml浓度范围内能分别明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度的依赖性;在2～8μg/ml浓度范围内青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡具有明显的量效关系;4μg/ml浓度组的青蒿琥酯在0～72h内,诱导K562凋亡具有明显的时效关系.结论青蒿琥酯在体外能抑制K562细胞的增殖,可能是通过诱导其发生凋亡而起作用.     

青蒿琥酯对HeLa细胞生长的抑制作用

目的 研究青蒿琥酯对HeLa细胞生长抑制作用。方法 MTT法测定青蒿琥酯对HeLa细胞增殖抑制；用透射电镜观察青蒿琥酯对肿瘤细胞形态学影响；用流式细胞仪检测肿瘤细胞周期变化和细胞凋亡率；用免疫组化法观察肿瘤细胞端粒酶活性。结果 MTT实验表明青蒿琥酯作用HeLa细胞72h后，细胞存活率明显下降，而且随着药物浓度的增加，抑制作用增强；流式细胞仪检测青蒿琥酯可引起HeLa细胞阻滞于G1期，细胞凋亡率在一定范围内与药物浓度呈正比；透射电镜观察细胞超微结构呈现典型的凋亡特征；免疫组化检测细胞端粒酶活性降低。结论 青蒿琥酯可抑制HeLa细胞生长，诱导细胞发生凋亡，可降低细胞端粒酶活性。     

青蒿琥酯逆转K562/A02细胞对阿霉素耐药性机理的研究

目的:研究青蒿琥酯逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性及其作用机制。方法:以对阿霉素敏感的K562细胞作为对照,用MTT法观察在有或无阿霉素存在条件下青蒿琥酯对培养的K562/A02细胞干预48 h后的生长抑制情况,流式细胞仪检测100μg.m l-1青蒿琥酯作用48 h前后K562/A02细胞P糖蛋白(P-gp)平均荧光强度(MFI)的强弱,生化方法检测100μg.m l-1青蒿琥酯作用48 h前后K562/A02细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量。结果:(1)在不含阿霉素情况下,青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞的IC50分别为13.80μg.m l-1和13.62μg.m l-1(P>0.05),在阿霉素存在情况下,青蒿琥酯对K562/A02细胞抑制作用明显增加(P<0.01);(2)与K562细胞P-gp的表达相比,K562/A02细胞P-gp高表达,青蒿琥酯处理前后K562/A02细胞的MFI无差别(P>0.05);(3)青蒿琥酯处理后K562/A02细胞内GSH含量较处理前明显下降(P<0.05)。结论:青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞具有细胞毒作用,且可逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药,其机制可能是通过干扰细胞内GSH-GSH-s-转移酶系统功能的发挥,而非对P-gp表达的影响。     

青蒿琥酯对口腔鳞癌Tca8113细胞及其移植瘤小鼠的抗肿瘤作用研究

目的 观察青蒿琥酯对口腔鳞癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响,以及对Tca8113细胞移植瘤小鼠肿瘤生长的影响。方法 用不同质量浓度的青蒿琥酯处理Tca8113细胞,HE染色观察细胞形态的改变;MTT法检测细胞增殖的情况;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化。用口腔鳞癌Tca8113细胞建立口腔鳞癌淋巴道转移模型,ip给予移植瘤小鼠青蒿琥酯200 mg/(kg?d),连续给药10 d,观察青蒿琥酯对肿瘤生长抑制作用,以5-氟尿嘧啶（5-FU）作为阳性对照。结果 青蒿琥酯作用Tca8113细胞后,形态学观察可见细胞凋亡现象,部分细胞明显肿胀、变圆、变大,溶解成碎片,甚至死亡;细胞增殖受到抑制且呈时间、剂量相关性;青蒿琥酯能有效诱导Tca8113细胞凋亡并呈时间、剂量相关性,还能将Tca8113细胞阻滞在G₀/G₁期。体内实验显示,青蒿琥酯对Tca8113细胞移植瘤具有明显的抑制作用,抑瘤率为41.18%。结论 青蒿琥酯体内及体外对口腔鳞癌Tca8113细胞均有抑制作用,其机制可能与青蒿琥酯诱导细胞凋亡或改变细胞周期的分布有关。     

青蒿酸对人红白血病K562细胞增殖抑制的体外研究

目的：探讨青蒿酸体外作用对K562细胞增殖的影响及其机制.方法：采用MTT法检测青蒿酸对K562细胞增殖的影响,流式细胞术分析细胞周期分布情况,透射电子显微镜进行形态学观察.结果：青蒿酸作用K562细胞24h、48h,能显著抑制细胞增殖,随药物浓度增加,对细胞增殖的抑制强度也显著增高.经青蒿酸作用48h,处于G0/G1期K562细胞增加,且能诱导K562细胞发生凋亡.电镜可观察到细胞凋亡的形态学改变.结论：青蒿酸能抑制K562细胞增殖,这种抗肿瘤作用可能与抑制K562细胞进入细胞增殖周期和诱导细胞凋亡有关.     

5,7-0-异丙亚基-对甲基哥纳香醇甲诱导白血病K562细胞凋亡

目的：研究5，7－0－异丙亚基－对甲基哥纳香醇甲对白血病细胞凋亡的影响。方法：体外培养白血病细胞K562，应用MTT法测定IC50，Hoechst33342/PI双荧光染色观察细胞核形态，透射电镜观察细胞凋亡情况。结果：5，7－0－异丙亚基－对甲基歌纳香醇甲处理K562细胞24h IC50约为10^-5mol/L，可观察到明显核固缩，凝集等细胞凋亡表现，透射电镜下观察到染色质凝集等改变。结论：5，7－0－异丙亚基－对甲基哥纳香醇甲可诱导K562细胞凋亡。     

乳腺癌MCF-7肿瘤细胞SP亚群初步分析

目的鉴定乳腺癌干细胞系MCF-7中是否包含肿瘤干细胞相关的SP(side popu lation)亚群。方法制备MCF-7细胞悬液,经Hoechst33342和PI染色(其中一组同时加入拮抗剂维拉帕米作为对照),流式细胞仪分析SP亚群。另取贴壁生长的MCF-7细胞,用Hoechst33342和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)原位染色,荧光显微镜下观察细胞染色情况。结果SP亚群占MCF-7细胞的4%,维拉帕米阻断后减少为0.5%。荧光显微镜下见Hoechst33342阳性细胞约占95%。结论人乳腺癌细胞系MCF-7中存在SP亚群,即提示乳腺癌干细胞的存在;维拉帕米可抑制染料外排而减少SP细胞的比例。     

SHP1基因诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡及红系分化

目的探讨SHP1基因在诱导K562细胞凋亡及红系分化中的作用。方法应用RT-PCR法克隆SHP1基因全长cDNA序列并克隆于真核表达载体pcDNA3.0,脂质体转染使其基因在K562细胞中过表达。Hoechst33258染色和FACS(AnnexinⅤ-PI双标)分析检测转基因后K562细胞凋亡;联苯胺蓝染色和血型糖蛋白A(GPA)表达检测分析细胞分化情况。结果 pcDNA3-SHP1转染K562细胞,RT-PCR、蛋白免疫印迹分析证实SHP1在K562细胞中表达。转染48h后,K562细胞出现凋亡,AnnexinⅤ-PI双标FACS分析细胞凋亡率为16.84%,与转染空载体pcDNA3.0(6.23%)相比差异有统计学意义(P=0.000)。联苯胺蓝染色细胞阳性率14.67%,GPA表达率19.38%,与转染空载体组比较差异也有统计学意义(P=0.005)。结论 SHP1能有效地诱导K562细胞凋亡与红系分化。     

苦参碱诱导血管紧张素Ⅱ作用的心肌成纤维细胞凋亡

目的 :研究苦参碱 (matrine,Mat)诱导血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )作用的小鼠心肌成纤维细胞 (cardiacfi broblast,CFB)凋亡及相关调控蛋白表达的影响。方法 :不同浓度苦参碱作用于体外培养AngⅡ作用的小鼠心肌成纤维细胞 ,利用倒置显微镜、PI/Hoechst 33342双染结合荧光显微镜技术观察细胞形态 ;流式细胞术检测其凋亡率、细胞周期及凋亡相关基因Bcl 2、Bax蛋白表达的改变 ;采用WesternBlotting检测Caspase 3蛋白的表达。 结果 :不同浓度Mat处理AngⅡ作用的小鼠心肌成纤维细胞 2 4h ,可见到染色质浓缩、边集、碎裂 ;凋亡率随浓度的升高而升高 ;细胞周期分析显示G1升高 ,S期下降 ,G2 /M期无明显变化 ;,Bcl 2的表达量减少 ;Bax的表达量增加且呈剂量效应 ;WesternBlotting检测显示Caspase 3活化。结论 :Mat诱导AngⅡ作用的小鼠心肌成纤维细胞凋亡且呈剂量效应 ,其机制可能与降低Bcl 2、升高Bax、增强Caspas 3活性有关。     

补骨脂素加长波紫外线照射对白血病K562细胞的杀伤作用

目的:探讨补骨脂的提纯物补骨脂素(psoralen)加长波紫外线(ultraviolet-A light)照射光化学疗法,亦称PUVA(psoralen plus ultraviolet-A light)疗法,对慢性粒细胞白血病红白病变细胞株K562细胞的杀伤作用.方法:以传代培养的K562细胞为模型,采用四甲基偶氮唑盐比色法(monotetrazolium test, MTT)测定单纯补骨脂素、单纯紫外线照射及PUVA疗法对白血病细胞的杀伤作用;采用流式细胞仪对其进行DNA含量分析,并用早期凋亡试剂盒Annexin-Ⅴ-FITC和碘化丙啶(propidine iodide, PI)双染法测定单纯补骨脂素对白血病细胞的作用;采用电镜技术对其进行形态学观察.结果:单纯补骨脂素或单纯紫外线照射对K562细胞均有杀伤作用,PUVA比单纯补骨脂素或单纯紫外线照射对K562细胞的杀伤作用有明显增强(P＜0.05).PUVA处理后的白血病细胞通过流式细胞仪可以检测到亚二倍体凋亡峰.电镜下可见:细胞体积变小,胞浆浓缩,胞核染色质聚集或边集,核小体碎裂,大部分细胞呈典型的凋亡形态.结论:中药补骨脂提纯物补骨脂素对人白血病细胞K562具有杀伤作用.补骨脂素具有光敏活性,结合360 nm波长紫外线照射治疗对K562细胞的杀伤作用有明显增强.紫外线照射时间以10 min为最佳;补骨脂素适宜的终浓度为40 μg/ml.PUVA对人白血病细胞K562杀伤作用的机制主要是诱导细胞凋亡.     

Dopamine inhibits proliferation, induces differentiation and apoptosis of K562 leukaemia cells

Background Dopamine exerts its effects mainly in nervous system through D1, D2 or D3 receptors. There are few reports dealing with the effects of dopamine on leukaemia cells. However, some dopamine agonists or antagonists do show biological effects on some types of leukaemia cells. Here, we report the effects of dopamine on the proliferation, differentiation and apoptosis of K562 leukaemia cells.Methods Proliferation was determined by MTT assay and cell counting both in liquid and semisolid cultures. Differentiation was verified by morphology, benzidine staining and flow cytometry. Apoptosis was checked by Hoechst 33258 staining and flow cytometry. The two groups were untreated group and treated group (dopamine 10(-9) mol/L―10(-4) mol/L).Results In liquid culture, MTT assay and colony assay, dopamine inhibited proliferation of K562 cells. Inhibition rate was 29.28% at 10(-6) mol/L and 36.10% at 10(-5) mol/L after culture for 5 days in MTT assay. In benzidine staining and CD71 expression, dopamine induced K562 cells toward erythroid differentiation by increased 155% at 10(-6) mol/L and by 171% at 10(-5) mol/L after culture for 5 days in benzidine staining. In Hoechst 33258 staining and flow cytometry, dopamine induced K562 cells toward apoptosis. The sub G1 peak stained by PI was 14.23% at 10(-4) mol/L dopamine after culture for 3 days compared with the control (0.81%) in flow cytometry.Conclusion Dopamine inhibites proliferation and induces both differentiation and apoptosis of K562 leukaemia cells.