转LacZ基因骨髓间充质干细胞体内造血分化的初步研究

目的 初步探讨小鼠骨髓间充质干细胞在体内向造血细胞分化的潜能。方法 利用转LacZ基因小鼠MSCs输注X射线亚致死量照射的BALB／C小鼠，2个月后取骨髓细胞作体外甲基纤维素培养和X-Gal染色，取肝脏X-Gal染色。结果 MSCs输注组和对照组骨髓细胞体外集落培养均能形成鹅卵石样造血细胞集落，经X-gal组化染色后，输注组部分造血集落产生蓝绿色，对照组没有颜色变化。肝脏X-Gal染色输注组部分产生蓝色，对照组没有颜色变化。结论 小鼠MSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

电离辐射对胎鼠皮肤间充质干细胞支持骨髓粒系造血作用的影响

目的：观察不同剂量的X射线照射对体外培养的胎鼠皮肤间充质干细胞(MSCs)支持造血细胞增殖作用的影响,为提高造血干细胞体外扩增效率提供一种更为有效的方法,进而为造血干细胞移植提供一个新的途径。 方法：分别用不同剂量的X射线照射培养的胎鼠皮肤MSCs层,然后将骨髓细胞种植于该细胞层上,扩增后不同时间(0~12 d)进行骨髓CFU-GM集落培养,同时取经X射线照射的皮肤MSCs的上清液进行骨髓CFU-GM、CFU-E及BFU-E培养,观察射线对胎鼠皮肤MSCs造血支持作用的影响。 结果：6、8和10 Gy剂量X射线照射胎鼠皮肤MSCs与骨髓细胞共同作用7 d时,骨髓祖细胞集落显著增加,其中6 Gy组增加最为明显,CFU-GM是0 Gy组的2.17倍。6、8和10 Gy剂量X射线照射培养皮肤的上清液体外亦可刺激骨髓CFU-GM、CFU-E、BFU-E的生长,与0 Gy组比较差异均有显著性(P<0.05)。其中6 Gy组增加最为明显,分别达0 Gy组的1.81倍、3.94倍和3.51倍,集落亦明显加大。 结论：一定剂量X射线照射胎鼠皮肤MSCs,其体外支持造血的作用增强,无论照射后的单纯MSCs细胞层还是上清液都可使骨髓细胞集落数增多。     

人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血小鼠造血的影响

目的:通过从脐带中分离和培养脐带间充质干细胞(MSCs),探讨其对再生障碍性贫血(再障)小鼠骨髓造血的影响。方法:原代贴壁法培养人脐带MSCs,将小鼠分为模型组、对照组、MSCs输注组进行实验。经静脉输注免疫介导方法建立再障模型小鼠,分别于3、7、14、21、28 d观察其外周血象指标变化和骨髓组织形态;ELISA检测造血负调控因子(IFN-γ)的水平,计数骨髓造血干细胞集落生成单位。结果:原代培养中脐带组织块直接贴壁后8～10 d,边缘爬出长梭形MSCs,随传代培养呈平行、漩涡状生长;再障小鼠经MSCs输注治疗后外周血象明显增高,IFN-γ水平下降(P0.01);治疗组骨髓红细胞集落形成单位与粒-巨噬细胞集落形成单位均较模型组明显增高(P0.01),成纤维细胞集落形成单位计数差异无统计学意义(P0.05)。结论:人脐带来源的MSCs对再障模型小鼠骨髓可发挥造血支持作用。     

骨髓基质细胞输注对化疗小鼠造血功能恢复的实验研究

目的以BALB/C小鼠为实验对象,探讨骨髓基质细胞输注对化疗小鼠造血功能的影响.方法BALB/C小鼠骨髓基质细胞体外扩增培养后输注给化疗后的同系小鼠,在输注后第3、7、14天进行各项指标的检测和观察.用常规方法进行外周血细胞计数;在体外骨髓细胞混合集落培养形成后计数集落形成单位;用流式细胞仪测定细胞周期,计算骨髓细胞增殖指数(PI).结果(1)骨髓基质细胞输注组外周血WBC、PT在第7天较单纯化疗组明显提高(P＜0.05);(2)骨髓细胞混合集落形成单位数在第3、7、14天显著高于单纯化疗组(P＜0.01);(3)输注组骨髓细胞增殖指数(PI)第7、14天显著高于单纯化疗组(P＜0.05).且输注了骨髓基质细胞的小鼠各项指标到第7天就已恢复至正常水平,而对照组则需14d,两组间差异具有显著性(P＜0.05).输注扩增培养的骨髓基质细胞无毒副反应.结论骨髓基质细胞输注可加快化疗小鼠造血功能的重建.     

骨髓间充质干细胞移植重建极重度放射损伤小鼠造血功能

目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cell,mMSC)单独输注对重度放射损伤小鼠造血功能重建的影响.方法:将体外培养扩增的雄性C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞输注给受致死剂量全身照射(8 Gy)的雌性C57BL/6小鼠,检测移植后外周血象、骨髓有核细胞数、病理变化、粒-单核细胞系祖细胞集落(CFU-GM)计数及性染色体比例,以未输注MSCs的小鼠作对照.结果:对照组小鼠(n=6)在照射后20 d内全部死于造血功能衰竭;MSCs组移植后血象明显下降,但2周后迅速恢复,28 d时恢复到照射前的60%左右,42 d外周血象基本恢复.MSC促进骨髓有核细胞数及CFU-GM快速恢复,有利于骨髓组织学的明显恢复改善.移植后42 d,仍可在受致死量照射的受体鼠内检测到供体MSC,但不能长期植入.结论:小鼠骨髓间充质干细胞单独输注可促进重度放射损伤小鼠的造血功能恢复,其植入时间长短可能与输注的细胞量有关.     

联合应用粒细胞集落刺激因子和骨髓基质干细胞治疗急性心肌缺血的实验研究

目的 探讨粒细胞集落刺激因子和自体骨髓基质干细胞(MSCs)移植共同应用对心肌缺血的治疗作用.方法 采用MSCs在体外培养扩增.在结扎冠状动脉造成急性心肌缺血后,把被5溴-2脱氧尿苷(BrdU)标记后的MSCs移植到自体的缺血心肌中,同时腹腔注射粒细胞集落刺激因子5 d.4周后通过激光共聚焦显微镜验证移植后的MSCs是否向心肌细胞分化,通过心脏彩超和多导生理记录仪测定缺血心肌在移植自体MSCs后是否能提高心功能.另外,用Masson氏三色染色法从左室中断面切片量化心肌梗死范围.结果 移植4周后,MSCs向心肌细胞分化,表达出α-横纹肌肌动蛋白和存在于心肌闰盘中的connexin43,联合应用粒细胞集落刺激因子和MSCs的治疗组左心室收缩功能恢复较好,心肌梗死面积最小,单独应用MSCs移植的治疗组次之,对照组心肌左室收缩功能恢复较差,心肌梗死面积最大.结论 MSCs移植后可以向心肌细胞分化,粒细胞集落刺激因子可以动员机体内自体MSCs到心肌缺血区域,二者联合应用对于缺血心肌有协同治疗作用.     

当归多糖对造血干细胞SIRT1、p53和p21表达的影响

目的 研究当归多糖（ASP）基于辐射所致小鼠衰老造血干细胞（HSCs） SIRT1、p53和p21蛋白表达的影响,探讨ASP基于调控HSCs衰老的可能机制。方法72只SPF级C57BL/6J小鼠随机纳入对照组、模型组和ASP组。模型组通过X线3.0G y/8F全身照射建立小鼠HSCs衰老模型;ASP组在照射期间给予ASP灌胃;对照组与模型组予生理盐水。经免疫磁珠法分选小鼠HSCs,采用流式细胞术检测细胞周期,通过β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色观察衰老细胞;经混合集落培养（CFU-Mix）观察HSCs自我更新及定向分化潜能;Western blot检测SIRT1、p53、p21蛋白表达。结果与对照组比较,X线照射可能显著增加模型组HSCs G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性细胞率、p53及p21蛋白表达（P<0.05）,降低SIRT1表达和CFU-Mix形成能力（P<0.05）。与模型组比较,ASP会抑制衰老HSCs G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性细胞率、p53及p21蛋白表达增加（P<0.05）,同时SIRT1表达增加、CFU-Mix能力增强（P<0.05）。结论ASP可能上调SIRT1表达、下调p53及p21表达,从而可能延缓小鼠HSCs衰老。     

大鼠骨髓间充质干细胞体内向造血细胞分化的研究

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)及其天麻定向诱导神经细胞后向造血细胞分化的潜能。 方法:建立以亚致死量照射的BALB/C小鼠为受体动物模型,体外扩增的大鼠6～7代MSC为供体细胞,分以 下3组,每组12只进行实验:实验组1(A组),放疗+单纯输注MSC;实验组2(B组),放疗+输注天麻诱导1h MSC,A、B组每只小鼠注射0.3mL含1.5×106cells的无血清培养液。空白对照组,放疗+输注等量无血清培 养液。照射后4h内,分别经尾静脉注射。移植60d后取骨髓(BM)、外周血(PB)、脾(SP)细胞悬液,用流式细 胞仪检测供体大鼠源性CD11a、CD45表达。结果:所有实验小鼠均能存活到2个月,骨髓、外周血、脾细胞悬液 均可检测到低表达的大鼠源性CD11a、CD45。对照组为阴性。A、B两组相互比较,具有显著差别意义(P< 0.05)。结论:MSC及天麻定向诱导神经细胞后具有向造血细胞分化潜能。     

过量表达LMO2对成血管细胞增殖和造血分化的作用

目的利用小鼠胚胎干细胞进行体外造血细胞分化,研究LMO2蛋白在成血管细胞分化过程中的作用。方法构建小鼠成血管细胞特异性表达lmo2或绿色荧光蛋白的表达载体,分别转染小鼠胚胎干细胞。经过筛选获得细胞克隆进行自发分化以形成胚胎体。收集分化0～12 d的胚胎体细胞,检测造血细胞相关基因的表达;利用EB细胞进行细胞集落形成实验及血细胞集落形成单位实验,并统计集落形成数。结果成功构建了成血管细胞特异性表达目的基因的表达载体,转染目的基因的小鼠胚胎干细胞在其分化中产生的成血管细胞可特异表达目的基因。过量表达lmo2能够促进造血相关基因的表达,所产生细胞集落数是对照组的2倍,晚期造血分化的血细胞集落形成单位总数是对照组的2.5倍,其中红系集落单位数是对照组的3倍。结论在成血管细胞中过量表达LMO2,促进其细胞增殖及其造血细胞分化。     

体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化

目的:观察体外雪旺细胞环境对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的诱导分化作用。方法:分离和体外培养新生大鼠MSCs和雪旺细胞;实验组MSCs经DAPI标记后与雪旺细胞按1∶2比例共培养,观察细胞的形态变化,在第1,3,6天时使用免疫细胞化学染色检测MSCs中Nestin,GFAP及S-100表达。对照组MSCs单独培养,其余处理与实验组相同。结果:共培养1 d后部分MSCs出现雪旺细胞样形态,Nestin表达率为(83.4±3.5)%,随时间增加而降低。GFAP及S-100表达率随时间而增加。对照组细胞形态无变化,不同时间点均有少量MSCs表达Nestin,而GFAP和S-100未见表达。结论:MSCs可通过体外共培养向雪旺细胞分化。     

小鼠c-Kit+lin-骨髓细胞移植生成肝细胞的实验研究

目的 评价小鼠c-Kit^＋Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能，为骨髓源性肝干细胞的临床运用提供可行性实验依据。方法 供体为纯系BALB／C雄性小鼠．c-Kit^＋Lin-骨髓细胞采用免疫磁珠分选法分离细胞。受体为行35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB／C雌性小鼠，立即移植供体c-Kit^＋lin-骨髓细胞。接受c-Kit^＋lin-骨髓细胞移植1月后，活杀取肝做常规病理学检查、Y染色体的原位杂交检查、甲胎蛋白与白蛋白的免疫组化检测。结果 移植1月后小鼠肝脏的组织结构已恢复正常．肝组织细胞中存在原位杂交和免疫组化均呈阳性反应的双阳性细胞。结论 小鼠c-Kit^＋Lin-骨髓细胞具有肝干细胞潜能，移植后可以在肝内定居并分化形成肝细胞。可做为肝病细胞移植疗法的种子细胞。     

Recombinant human bone morphogenetic protein-2 promotes the proliferation of mesenchymal stem cells in vivo and in vitro

Background Bone morphogenetic protein （BMP） is a member of the superfamily of transforming growth factor-13. Recent studies show that it is an indispensable factor in hematopoiesis. To better characterize the effect of recombinant human BMP （rhBMP）-2 in hematopoiesis, we set out to determine whether rhBMP-2 could promote the proliferation of mesenchymal stem cells （MSCs） and increase the levels of hematopoietic cytokines in MSCs.
Methods 2,3-bis （2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-5-（（phenylamino） carbonyl）-2H-tetrazolium hydroxide （XTT）, real-time polymerase chain reaction （PCR） and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the effects of rhBMP-2 on the proliferation and hematopoietic cytokine levels of MSCs. In addition, MSCs marked with Hoechst33342 were transplanted into BALB/c mice by the intravenous route or intra-bone marrow transplantation, and cluster numbers were counted. Results The XTT test revealed that rhBMP-2 significantly induced proliferation of MSCs in doses ranging from 10 ng/ml to 0.1 mg/ml in a dose-dependent manner. The experiments in vivo showed that there were more clusters of donor cells in bone marrow, spleen, liver and lung of the BMP group than those in the control group after both intra-bone marrow transplantation （P 〈0.001, P 〈0.001, P 〈0.001, and P=0.001, respectively） and intravenous transplantation （P 〈0.001, P 〈0.001, and P 〈0.001 respectively）. The results of real-time PCR and ELISA revealed that rhBMP-2 significantly increased mRNA expressions and protein levels of IL-6, IL-7, IL-11, G-CSF, M-CSF and SCF.
Conclusions The treatment with rhBMP-2 promotes the proliferation of MSCs in vivo and in vitro and increases the levels of hematopoietic cytokines in MSCs, which may contribute to the improvement of hematopoietic function.     

基因修饰造血细胞移植后重建免疫功能的实验研究

目的 :探讨mFasL基因转移造血细胞移植后 ,受者免疫功能的重建情况。方法 :采用脂质体法将FasL cDNA转入BALB C鼠造血细胞 ,体外与BAC鼠骨髓移植物混合培养后输注给经致死量照射的BALB C鼠 ,通过观察死亡率、存活受者混合淋巴细胞反应 ,以了解移植后免疫功能的重建。结果 :未经骨髓移植组于 1周内全部死亡 ;未转基因骨髓移植组 6 0d存活率为 30 % ,转基因组 6 0d存活率为 80 % ;存活受者淋巴细胞对刺激原均表现有增殖反应。结论 :mFasL cDNA基因转移的造血细胞能成功地重建免疫功能     

RunX3对小鼠骨髓造血干细胞功能的影响

目的研究RunX3基因对造血干细胞自我更新和分化能力的影响。方法流式细胞术测定小鼠骨髓干细胞和外周血单个核细胞的比例;通过竞争性骨髓移植实验检测RunX3转基因小鼠骨髓干细胞的功能。结果移植后来源于RunX3-/-小鼠骨髓干细胞供体的外周血细胞占总外周血细胞的比例与野生对照鼠相比无明显差异,移植后来源于RunX3-/-小鼠骨髓干细胞供体的外周血中髓系细胞占总外周血髓系细胞的比例较野生型对照鼠高。结论RunX3基因缺失对骨髓造血干细胞的自我更新没有影响,但其可能参与了骨髓造血干细胞的分化过程。     

慢性粒细胞性白血病骨髓间充质干细胞的分离纯化及其功能特性的研究

目的 分离、纯化慢性粒细胞性白血病（CML）患者骨髓间充质干细胞（MSC）,并对MSC进行功能、特性鉴定。方法 获取CML患者的骨髓MSC,应用极限稀释法获取单克隆来源的MSC,并在低血清培养液中培养和扩增;流式细胞术检测MSC免疫表型和细胞周期;通过油红O染色、Von Kossa染色和Western印迹检测MSC向脂肪、骨和神经细胞的分化。电镜检测CML患者骨髓MSC的超微结构;通过软琼脂培养法和裸鼠接种,确定CML来源的MSC是否存在致瘤性。结果 MSC在相应的诱导条件下可以向骨、脂肪和神经细胞分化。CML来源的MSC在倒置显微镜下为梭形,表达CD29、CD44、CDl05,而CDllb,CD31、CD34、CD45、HLA—DR均为阴性。CML来源的MSCBCR／ABL融合基因阴性,不具备体内和体外致瘤性。结论CML患者骨髓中存在具有多向分化能力的MSC,该细胞群体不具备体外和体内致瘤性,表现为正常MSC的生物学特征。     

Monitoring the source of mesenchymal stem cells in patients after transplantation of mismatched-sex hematopoietic stem cells plus third-party cells

Background In bone marrow transplant patients, the microenvironment in bone marrow is damaged after chemotherapy or radiotherapy. Subsequent to allogenic hematopoietic stem cell transplantation in patients with clinically successful engraftments, the source of mesenchymal stem cells （MSCs） remains controversial. To further verify the stimulatory effect of the simultaneous transplantation of cells from second donors on engraftment success for hematopoietic stem cell transplantation in support of donor MSCs engraftments, the aim of this study is to monitor the dynamics of the engraftment of bone marrow-derived MSCs in patients after transplantation with mismatched-sex hematopoietic stem and third-party cells. Methods In this study, the hematopoietic stem cells from 32 clinical donors of different sexes that resulted in successful engraftments were selected for transplantation and were classified into three groups for research purposes： group A consisted of 14 cases of transplantation with bone marrow and recruited peripheral hematopoietic stem cell transplantation, group B contained 8 cases of simultaneous re-transfusion of MSCs from the second donor, and group C contained 10 cases of simultaneous re-transfusion of umbilical blood from the second donor. The bone marrow from 32 patients with successful engraftments of hematopoietic transplantation were selected and sub-cultured with MSCs. Flow cytometry （FCM） was used to measure the expression of surface antigens on MSCs. Denaturing high-performance liquid chromatography （DHPLC） in combination with polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats （STR- PCR） was used to measure the engraftment status of fifth-generation MSCs in patients. Fluorescence in situ hybridization （FISH） revealed the sex origin of the fifth-generation MSCs in 32 patients. Dynamic examinations were performed on patients receiving donor transplantations. Results The progenies of fifth-generation MSCs were successfully cultured in 32 cases. The results of FCM demonstrated that the expression levels of CD14＋ and CD45＋ cells were lower than 0.04% in the fifth-generation MSCs. The analysis using DHPLC and FISH showed similar results. One patient from group B also received a temporary transplantation of MSCs from the donor. The MSCs in the remaining 31 patients all originated from the patients themselves. Conclusions After transplantation, the MSCs present in patients originated from the host. In patients transplanted with MSCs from a second donor, the phenomenon of temporary chimerization of MSCs was observed.     

间充质干细胞在致敏受者造血干细胞移植中的作用

【目的】 本实验拟研究骨髓间充质干细胞(MSC)在致敏受者造血干细胞移植中的作用?【方法】 体外分离BALB/c小鼠骨髓细胞,通过贴壁培养方法获得MSC,应用流式细胞仪检测细胞表面分子标记?通过异基因脾细胞输注方法建立致敏动物模型;绿色荧光染料标记骨髓MSC,分别移植到非致敏及致敏受者体内,并于移植后不同时间点检测MSC的归巢情况?致敏BALB/c小鼠经照射预处理,联合应用同基因MSC与异基因骨髓细胞移植,每日观察小鼠的生存情况?【结果】 体外培养第4代MSC表现为长梭形,阴性表达造血细胞表面分子而阳性表达粘附分子?动物体内实验发现移植后第48小时,MSC在非致敏受者体内主要归巢于骨髓,而在致敏受者体内主要归巢于脾脏?造血干细胞移植实验中,致敏小鼠接受同基因骨髓MSC与异基因骨髓细胞移植,结果发现致敏小鼠在移植后第12 ~ 16天全部死亡,生存中位数时间是14 d?【结论】 成功培养小鼠骨髓MSC;移植后MSC在致敏受者体内主要归巢于脾脏组织;联合应用MSC移植并不能有效促进异基因造血干/祖细胞在致敏受者体内植入?     

人脐血干细胞对裸小鼠移植的实验研究

目的　探讨脐血干细胞移植到小鼠体内的增殖、分化以及维持情况。方法　将人脐血单个核细胞注入经致死量照射后的免疫缺陷小鼠— BAL B/C nu 小鼠。观察小鼠的生存、造血重建和植入指标情况。结果　移植组小鼠生存、造血重建及植入指标表达明显优于对照组 (P<0 .0 5 ) ,人脐血中的 CD34 细胞可植入且定居于小鼠骨髓中 ,并可在其中增殖、分化。结论　人脐血干细胞移植入裸鼠显示脐血的造血干 /祖细胞在体内具有长期重建造血的能力     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果：经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论：全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。