人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2 ( hPPARγ2)基因及构建其真核表达重组体,为进一步研究该基因打下基础.方法采用RT-PCR方法从中国人网膜脂肪垫总RNA中扩增出hPPARγ2 cDNA全长基因,将全长hPPARγ2cDRA定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,筛选出阳性克隆.通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定.结果克隆出全长hPPARγ2cDNA序列与GeneBanK序列相同,真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小与理论值一致.结论成功地克隆了hPPARγ2 cDNA,并构建了真核表达重组体.     

pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

大鼠Kir6.2基因真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的 克隆Kit6.2基因,构建真核表达载体pcDNA3.0/Kir6.2,将重组质粒转染HEK293细胞获得高表达Kir6.2基因的细胞克隆.方法 从SD大鼠脑组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得Kit6.2基因的全长cDNA,插入TI-simple克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pcD...     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

重组脂联素真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建重组人脂联素(ADPN)真核表达质粒,为进一步研究ADPN的功能提供实验基础.方法应用限制性内切酶双酶切载有人脂联素cDNA的重组克隆质粒pMD 18-T和真核表达质粒pcDNA 3.1 ,回收目的基因片段与线性化的真核表达质粒,经连接、转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,经酶切和核苷酸序列测定鉴定.结果重组真核表达质粒经HindⅢ、EcoRⅠ酶切后获得5.4 kb和800 bp两个片段,大小与理论值一致,并经核苷酸序列测定证实.结论成功地构建了人重组脂联素真核表达质粒.     

人脑组织中STUB1基因的克隆构建及表达

目的 构建人STUB1基因全长cDNA的真核表达载体DNA3.1-STUB1.观察STUB1基因在人脑胶质瘤细胞(U251细胞)中的表达.方法 RT-PCR技术扩增获得人脑组织STUB1基因全长cDNA,将扩增的产物进行TA克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将STUB1基因酶切后构成pcDNA3.1-STUB1的真核表达重组质粒.用脂质体将重组质粒转染入U251胶质瘤细胞系,48h以后通过Western blotting实验观察重组质粒的表达情况.结果 RT-PCR扩增获得人脑组织中STUB1 cDNA全长912bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-STUB1,经DNA测序与GenBank中的人STUB1 cDNA序列一致.经neomycin(neo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株后,经过Western blotting显示转染重组质粒的细胞中有高水平的STUB1基因表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-STUB1真核表达质粒,并发现其在U251细胞中过量表达,为进一步研究STUB1基因在胶质瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

组织蛋白酶L基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的:构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的真核表达质粒并进行表达鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人卵巢癌组织总RNA中逆转录CTSL基因的cDNA全长,克隆到pMDl8-T载体上;亚克隆至pcI)NA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和westeIn-blot检测CTSL基因和蛋白表达.结果:PCR克隆出CTSL cDNA全长,成功克隆人pMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,重组阳性克隆酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正确插入pcD-NA3.1载体.RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达.结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌中的作用提供了实验基础.     

人源性高血糖素原基因的克隆

目的 克隆人高血糖素原基因(proglucagon cDNA,PG cDNA),构建其真核表达质粒载体.方法 从人切除脑组织中提取总RNA,并分离mRNA,经过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出PG cDNA,并将其插入经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的真核表达质粒载体pVITRO3中,构建重组质粒载体pVITRO3-PG cDNA.结果 经过限制性酶切鉴定和测序证明,PG cDNA全长543bp,编码181个氨基酸,并已插入到pVITRO3中.结论 成功获得了PG cDNA,构建了含PG cDNA 的真核表达质粒载体,为研究重组PG的功能奠定了基础.     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

 [目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

[目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

诱导性鼠Smad7真核表达载体的构建与鉴定

目的构建四环素诱导性鼠Smad7真核表达载体。方法采用常规分子生物学方法，抽提SD大鼠肾脏总RNA，RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA，再定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MeI和HindⅢ之间，限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-Smad7真核表达载体经限制性内切酶酶切分析和测序分析，与理论值相符。结论本实验成功构建鼠Smad7四环索诱导性真核表达载体pBI-L-Smad7，为今后临床开展组织器官纤维化Smad7基因治疗奠定实验基础。     

鼠CD40配体cDNA真核表达载体的构建

目的:构建鼠CD40配体(Mcd40)cDNA真核表达载体，为进一步研究打下基础。方法:从鼠脾细胞中提取总RNA作为模板，用特异的引物和RT—PCIL法扩增mCD40L cDNA。PCIL产物T—A克隆了T载体构建中间重组体，NheI和EcoRI双酶切后，将Mcd40L cDNA定向插入真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点中，构建成重组表达质粒，并用酶切分析、PCIL扩增和序列测定进行了鉴定。结果:mCD40L cDNA被正确地克隆到真核表达载体pcDNA3．1^ 中，测序结果同文献报道的序列一致。结论真核表达载体pcDNA3．1^ -mCD40L的成功构建，为开展利用mCD40L基因治疗肿瘤的研究奠定了基础。     

大鼠Atoh1基因真核表达载体的构建及转染293T细胞的实验研究

摘要：目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因CDS,构建大鼠核转录因子Atoh1的真核表达载体并在真核细胞
中表达。方法从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增Atoh1基因CDS区序列并TA克隆至PMD-19T
载体中。测序鉴定后将Atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点（internal ribosome entrysite, IRES）的真核细
胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜、
PT-PCR和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果扩增得到大鼠Atoh1 CDS区长1056 bp,编码351个氨基酸,
与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基
应为单核苷酸多态性（SNP）,突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达
载体pIRES2-EGFP中,转染293T细胞48 h后,荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达,PT-PCR和Western blot证实Atoh1
的mRNA和蛋白能在293T细胞中正确表达。结论成功构建了真核表达载体pAtoh1 -IRES2-EGFP,并在293T细胞中成
功表达,为进一步研究Atoh1的功能、作用机制及感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。     

人白细胞介素-24基因的克隆及序列测定

目的克隆人白细胞介素-24(hIL-24)基因，以供重组表达。方法利用自行设计合成的一对引物，采用RT-PCR技术从LPS活化的人外周血单个核细胞的总RNA中分离hIL-24cDNA并重组到pUCl9载体上，进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果PCR及酶切产物电泳结果均证明所克隆的基因为621bp。经序列测定证实所克隆的hIL-24与GenBank报道的结果完全一致。结论该基因系国内首次获得并经序列测定证实的hIL-24cDNA基因。这为进一步在真核或大肠杆菌中高效表达有活性的重组hIL-24，更深入地研究其作用机制以及临床应用奠定了坚实的基础。     

人Gfil基因克隆及重组Gfil慢病毒表达载体的构建

目的 克隆人Gill基因的全长cDNA,构建用于真核细胞表达的含有Gfil基因ORF区的重组慢病毒表达载体pLOX-Gfil,为研究Gfil基因的功能打下基础.方法 应用RT-PCR从人K562细胞系中扩增出Gfil cDNA片段·经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态菌DH5a,通过蓝白筛选酶切鉴定出阳性菌落,质粒提取,BamH I限制性内切酶酶切获得目的 基因,插入慢病毒载体pLOX中并转化感受态细菌DH5a.质粒提取后进行酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行DNA序列分析.结果 RT-PCR扩增获得含有约1.2 kb的DNA片段,酶切及PCR鉴定证实pLOX-Gfil含有大小正确的正向Gfil cDNA,DNA序列分析的结果 与发表于GenBank上的序列(NM005263)完全一致.结论 成功克隆人Gfil基因并构建用于真核细胞表达的重组慢病毒载体pLOX-Gfil.     

重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。     

小鼠IL-17基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆小鼠IL-17（mIL-17）基因编码区并构建其真核载体。方法将10 ug LPS和等体积的完全福氏乳化后免疫C57BL/6小鼠,7 d后,取小鼠脾脏,提取脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增mIL-17基因全长编码区并将其克隆至pcDNA3.1载体。菌落PCR筛选阳性克隆,限制性内切酶消化和序列分析进行鉴定。结果构建的重组载体中含有mIL-17基因编码区的全长序列,与NCBI公布的序列一致。结论获得mIL-17基因并构建了其真核表达载体,为研究IL-17在自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。