-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌对乳糖细胞毒性的缓解作用

目的体外评价Β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌缓解乳糖对细胞毒性作用的效果。方法建立乳糖细胞毒性作用CACO-2细胞模型,采用形态学观察及细胞增殖活性等指标检测该菌对乳糖细胞毒性的作用效果。结果成功建立乳糖细胞毒性作用CACO-2体外模型,所构建的Β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌能够保护细胞耐受乳糖毒性而呈现正常形态,并能提高乳糖作用下的细胞活性(P<0.01)。结论Β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌在体外可显著的降低乳糖的细胞毒性作用,为进行其食品级改造奠定了基础。     

何首乌饮对Leydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响

目的:探讨何首乌饮对eydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响.方法:采用3 β-HSD特异性染色鉴定体外培养的大鼠睾丸Leydig细胞,分为正常组、Leydig细胞衰老损伤组、何首乌饮预防组和何首乌饮治疗组,用50 μ mol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4处理Leydig细胞建立Leydig细胞衰老模型.观察各组Leydig细胞β-半乳糖苷酶表达的变化.结果:正常组Leydig细胞无β-半乳糖苷酶表达.与正常组比较,衰老组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显升高(P＜0.05);何首乌饮预防组、治疗组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显低于衰老组(P＜0.05),何首乌饮治疗组、预防组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:何首乌饮可通过降低β-半乳糖苷酶的表达保护睾丸Leydig细胞衰老损伤.     

二至丸对D-半乳糖诱导大鼠肾细胞衰老的保护作用

目的 探讨二至丸对D-半乳糖(D-galactose, D-gal)诱导的大鼠肾(NRK)细胞衰老的保护作用。方法 使用不同浓度D-gal（1、5、10、20、40 g/L）作用不同时间（24、48、72 h）诱导NRK细胞衰老,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)染色法鉴定细胞衰老;荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷(Fluorescein di-β-D-galactopyranoside, FDG）法检测衰老相关的β-半乳糖苷酶活性;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力;以GSH-PX、SOD活力与MDA含量检测细胞氧化应激水平;构建体外NRK细胞衰老模型。根据FDG的结果来评估不同浓度二至丸(0.01、0.1、1 g/L)处理对衰老NRK细胞的影响,检测GSH-PX、SOD活力与MDA含量的变化来探讨二至丸对衰老NRK细胞的保护作用。结果 与对照组相比,模型组(20 g/L D-gal处理48 h)β-半乳糖苷酶染色阳性率明显增加,β-半乳糖苷酶活性明显增加;GSH-PX、SOD活力下降,MDA含量增加（P<0.05~0.01）,细胞活性无明显变化。与模型组相比,给药组β-半乳糖苷酶含量明显降低,阳性染色率显著下降,GSH-PX、SOD活力升高,MDA含量明显降低（P<0.05~0.01）。结论 建立D-gal诱导的NRK细胞衰老模型;二至丸能够减轻D-gal诱导的NRK细胞衰老的程度,其保护效应的产生可能与二至丸抗氧化应激效应相关。     

D-半乳糖诱导间充质干细胞衰老的研究

目的 利用D-半乳糖诱导建立间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）体外衰老模型,并探讨其潜在机制。方法 以正常培养的MSCs做对照组,以分别用1、10、100g/L D-半乳糖诱导的MSCs作为处理组,培养48h后,采用免疫蛋白印迹法（Western blot）检测细胞内AKT与mTOR蛋白磷酸化水平以及衰老相关蛋白p16^Ink4a的变化。同时使用β-半乳糖苷酶试剂盒检测MSCs中β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）表达量的变化。最后用AKT抑制剂预处理D-半乳糖诱导组以明确AKT/mTOR信号通路在MSCs衰老中的作用。结果 与对照组相比,10g/L D-半乳糖作用48h后MSCs中β-半乳糖苷酶表达和衰老相关蛋白p16^Ink4a含量明显增加,同时p-AKT与p-mTOR含量也较对照组增加,加入AKT抑制剂后,衰老组β-半乳糖苷酶表达和衰老相关蛋白p16^Ink4a含量皆有所下降。结论 D-半乳糖能成功诱导构建MSCs体外衰老模型,AKT/mTOR信号通路参与了这一过程。     

阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在HepG2及GRC细胞株中的表达

目的：研究阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在不同肿瘤细胞株中的表达。方法：质粒pDCβ-在大肠杆菌DH5a中扩增后用碱裂解法提取，并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析，以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2、人肾癌细胞株GRC，然后用X-gal细胞化学染色法检测β-半乳糖苷酶活性。结果：β-半乳糖苷酶活性在HepG2、GRC中均有表达。结论：阳离子脂质体Lipofectin是有效的细胞基因转染剂。     

成纤维细胞体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化

目的 观察正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的变化规律。方法 取正常人二倍体成纤维细胞进行传代培养，以不同代次的细胞为实验对象，通过细胞生长曲线、群体倍增时间和β-半乳糖苷酶染色等一系列检测方法，对成纤维细胞老化过程进行了观察。结果 随着成纤维细胞的连续传代培养，SA-β-Gal表达呈现从弱(在年轻细胞中占4％)到强(在老化细胞中占60％)的趋势、结论 为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据。     

异常黑胆质成熟剂对D-半乳糖致衰老模型大鼠p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响

目的探讨异常黑胆质成熟剂（ASMq）对D-半乳糖致衰老模型大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响,以此阐明异常黑胆质成熟剂延缓衰老作用的部分机制。方法选取3个月龄雄性 SD 大鼠60只,体质量180～220 g,采用 D-半乳糖制作亚急性衰老模型,随机分为衰老模型组及 ASMq高、中、低剂量组各15只（ASMq高、中、低剂量分别为6．0、3．0、1．5 g·kg-1·d-1）,连续给药21 d。另取15只正常雄性大鼠作为正常对照组。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达。结果各组大鼠心、脑、肝脏组织中 p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达阳性的细胞表现为细胞浆染成黄褐色。与正常对照组比较,衰老模型组心、脑、肝组织中的P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显升高,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）;与衰老模型组比较, ASMq高、中、低剂量组心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显下降,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）。结论 ASMq可降低衰老大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达,从而发挥抗衰老作用。     

四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素（4 mg•L^-1）,利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。     

衰老SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注模型的建立

目的：探讨衰老SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注模型的建立。方法：将SH-SY5Y细胞随机分为对照(D-半乳糖0 mmol/L)、D-半乳糖(25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L)组，分别给予对应浓度的D-半乳糖处理48 h，显微镜观察细胞形态的改变、β-半乳糖苷酶试剂盒检测β-半乳糖苷酶活性、EdU试剂盒检测细胞增殖率以及CCK-8法检测细胞存活率，确定D-半乳糖致衰浓度，建立衰老模型。将衰老SH-SY5Y细胞随机分为对照(氧糖剥夺不处理)、氧糖剥夺处理(0.5 h、1 h、1.5 h、2 h)组，随后复糖复氧24 h,CCK-8检测衰老SH-SY5Y细胞存活率。结果：25 mmol/L、50 mmol/L组的细胞形态、β-gal活性与对照组比较没有明显变化(P>0.05),100 mmol/L组细胞可见胞体肥大，200 mmol/L组细胞染色质固缩，400 mmol/L组细胞出现大量空泡化；(100 mmol/L～400 mmol/L)组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率与对照组比明显升高(P<0.05),1...     

产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株的筛选、鉴定及酶特性研究

目的 筛选新的产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株,为解决目前工业用β-半乳糖苷酶耗能大、pH要求高的难题创造条件.方法 通过含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的筛选培养基在油田附近土壤中分离纯化菌株并进行鉴定,以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物测定酶特性.结果 获得了一株新的产冷活性β-...     

嗜酸乳杆菌推定的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的功能性表达

目的在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β-半乳糖苷酶基因lacZ,为研究其酶学特性做准备。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并构建表达载体pET22b—lacZ-H、pQE31-H-lacZ和pQE31-lacZ,然后在大肠杆菌中诱导表达,并测定表达产物的β-半乳糖苷酶活性。结果无标签的重组嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶LacZ获得了功能性表达,表达量可达2．28kU／L．而融合His-Tag的重组嗜酸乳杆菌LacZ却失去了β-半乳糖苷酶活性,即使复性也不能恢复。结论克隆表达的成功为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。     

非融合表达β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌的构建和性能研究

目的 构建能非融合表达高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,并对其酶活性和分泌性能进行研究.方法 提取能在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶的重组质粒pMG36e-lacZ 1.1480和pMG36e-lacZ wch9901,电转化乳酸乳球菌乳酸亚种MGl363.测定重组菌在不同培养时间和乳糖浓度下的β-半乳糖苷酶活性,及在不同培养条件下的酶分泌率.结果 携带pMG36e-lacZ wch9901的重组乳酸乳球菌(MG1363/pMG36e-lacZ wch9901)具最高酶活性,其β-半乳糖苷酶活性达(16.95±0.09)U/mg pro,为基因初始菌的2.75倍;重组乳酸乳球菌培养24 h产酶达高峰;培养基含乳糖时,重组菌酶活测定结果表现为降低;重组乳酸乳球菌表达的β-半乳糖苷酶可分泌到培养基中,当培养基不含红霉素,而含20 g/L乳糖时,分泌率最高,达(27.09±0.05)%.结论 获得了能非融合表达和分泌高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,可在此基础上进一步研制β-半乳糖苷酶活菌释放体.     

保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的扩增及其影响因素

目的 通过扩增得到保加利亚乳杆菌编码高效β-半乳糖苷酶的基因，并探讨影响扩增的因素。方法 采用溶菌酶加冻融法提取细菌DNA；选取不同的模板浓度、退火温度分别进行扩增。结果 模板浓度60ng／μl、退火温度66℃是保加利亚乳杆菌β-乳糖苷酶基因的较优扩增条件。结论 优化了扩增保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶所需的退火温度、模板浓度等条件，提高了扩增产物的产量。     

靶向包膜蛋白的HIV进入抑制剂非感染性定量筛选方法的研究

目的 HIV包膜蛋白能介导细胞与细胞之间的融合,本项目旨在建立一种靶向包膜蛋白的HIV进入抑制剂非感染性定量筛选方法 .方法 将表达包膜蛋白gp120/gp41和Tat等HIV蛋白的HL2/3细胞与表达CD4和由HIV长末端重复片段(LTR)启动的β-半乳糖苷酶的HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞混合,采用氯酚红β半乳糖苷(CPRG)为显色底物检测β-半乳糖苷酶的表达.用特异性的HIV进入抑制剂对检测方法 进行验证.结果 HL2/3细胞与HeLa-CD4-LTR-β-gal细胞共育不能形成合胞体,但二者能发生膜融合,导致效应细胞表达的Tat蛋白与靶细胞中LTR结合,启动β-半乳糖苷酶的表达.CPRG方法 能灵敏地检测细胞中β-半乳糖苷酶的含量.特异性的HIV进入抑制剂能够抑制β-半乳糖苷酶的表达,且具有剂量依赖性.结论 这一非感染性定量的方法 能客观定量地筛选作用于HIV进入阶段的抗HIV药物,且操作方便、廉价、无感染性,用于天然和合成来源的小分子抗艾滋病药物的筛选.     

德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的非融合表达

目的在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶,为构建能高效表达β-半乳糖苷酶的食品级益生菌株奠定基础。方法选择德氏乳杆菌保加利亚亚种(1.1480和wch9901)β-半乳糖苷酶基因(lacZ)起始密码ATG上游-18bp到ATG下游1bp的一段包含SD位点和ATGA位点的序列为上游引物,PCR扩增lacZ,插入表达质粒pMG36e构建重组表达质粒。转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,提取重组质粒进行酶切鉴定和测序,并测定转化菌β-半乳糖苷酶活性。结果重组质粒酶切鉴定合格;其中插入的外源片段序列与德氏乳杆菌保加利亚亚种lacZ标准序列符合率达99%以上;携带重组质粒pMG36e-lacZ1.1480的大肠杆菌DH5α酶活性为3.074U/mL,酶比活性为6.939U/mgpro;携带重组质粒pMG36e-lacZwch9901的大肠杆菌DH5α酶活性为4.755U/mL,酶比活性为8.537U/mgpro。结论成功在大肠杆菌中非融合表达了德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶;本研究选择的SD位点和ATGA位点能在大肠杆菌中有效地引导蛋白的非融合表达。     

两种恶性疟原虫复合抗原免疫血清对疟原虫体外抑制作用的比较

为了比较恶性疟原虫复合抗原HBsAg/45肽和β-半乳糖苷酶/45肽的免疫效果,我们将这两种含45肽抗原的融合蛋白免疫家兔后进行体外抑制试验。结果表明颗粒状的HBsAg/45肽免疫血清对原虫的抑制作用明显大于线状的β-半乳糖苷酶/45肽免疫血清。提示:恶性疟原虫杂合45肽连于HBsAg颗粒上有助于提高其免疫保护作用。     

应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒的实验研究

组腺病毒Ad-B-gal,病毒滴度达(2.5～4.0)×1011EFU/ml;感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10时对HEK293细胞48 h转染率达70%,并在X-gaJ试剂作用下,细胞旱现蓝色.结论 成功构建了携带β-gal基因的重组腺病毒,能高效感染293细胞.并功能性表达β-半乳糖苷酶.     

α-半乳糖苷酶的医学研究进展

本文综述α-半乳糖苷酶在医学领域的应用,分析α-半乳糖苷酶与Fabry疾病、血型转换和异种器官移植的关系和研究进展.     

玉屏风散对紫外线致人皮肤成纤维细胞光老化的防护作用

目的研究玉屏风散对人皮肤成纤维细胞光老化的保护作用及其作用机制。方法紫外线(UVA+UVB)照射人皮肤成纤维细胞,建立光老化模型,使用三种不同浓度的玉屏风散含药血清进行干预,通过β-半乳糖苷酶染色法检测细胞的衰老情况,ELISA法检测细胞DNA总体甲基化水平,透射电镜观察细胞超微结构的变化。结果与正常组相比,模型组细胞β-半乳糖苷酶染色结果阳性率明显上升,DNA总体甲基化水平降低,细胞形态发生明显改变,胞浆中可见大量空泡形成,线粒体显著肿胀变形,形态不规则。经玉屏风散干预后,人皮肤成纤维细胞的衰老程度有所减轻,β-半乳糖苷酶染色结果细胞阳性率明显下降,细胞的DNA总体甲基化水平有所升高,对成纤维细胞内细胞器尤其是线粒体的破坏明显减轻,细胞形态也有明显的改善。结论玉屏风散可能通过调控细胞DNA总体甲基化水平,保护细胞的形态,进而对于人皮肤成纤维细胞的光老化具有防护作用,其中又以大剂量玉屏风散的抗衰效果为佳。     

金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑损伤的保护作用

目的 研究金莲花中黄酮碳苷单体荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑损伤的保护作用。方法 小鼠ip给予D-半乳糖8周制备亚急性衰老模型,造模成功后将小鼠分成模型组,维生素E（20 mg/kg）阳性对照组,荭草苷和牡荆苷高、中、低剂量（40、20、10 mg/kg）组,各组每日上午ig给予相应药物1次。连续给药8周后小鼠断头取脑,测脑质量,制备脑组织匀浆上清液,检测脑组织中抗氧化酶系、丙二醛（MDA）、脂褐素,并观察脑组织形态学变化。结果 荭草苷和牡荆苷可改善衰老小鼠一般状态,延缓脑组织萎缩,提高脑组织中抗氧化酶的活性和降低MDA、脂褐素的量,改善海马区神经细胞结构的功能。荭草苷中、低剂量的抗氧化活性强于同剂量的牡荆苷,差异显著（P＜0.05、0.01）;而荭草苷和牡荆苷高剂量的抗氧化活性与维生素E的相当。结论 荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑损伤具有一定的保护作用,其作用机制可能与提高脑组织内抗氧化酶系活性,降低MDA、脂褐素的量,改善海马区神经细胞结构功能相关。