核酸检测中两种核酸提取方法的比较

为了提高输血安全，有效缩短EIA的“窗口期”，检出病毒变异株，降低血源性病毒的传播，深圳市血液中心除按献血法要求对血液进行常规检测外，还对常规检测结果合格的血液标本进行核酸检测。     

核酸检测技术新进展

90年代末核酸分析灵敏度达ymol(10^-23摩尔)，从标记物方面提高核酸分析灵敏度的策略有改进标记物、多重标记和降低背景千扰。为满足操作简单、方便的需要，已建立起了荧光偏振分析和氧引导发光分析等非分离的核酸检测技术及床边检验测验片。基因芯片技术实现了一次性分析大量基因和核酸装置的微型化。     

用于新型冠状病毒核酸检测的即时检测方法研究进展

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）在全世界范围内快速传播，截至2020年9月30日全球感染人数已达3 300万人，造成100多万人死亡，给公众的生命健康造成严重威胁。基于实验室的标准化核酸检测方法周转时间长、成本高，因此急需开发便捷检测新冠病毒的方法，实现在资源有限的情况下快速测试以及时控制疫情。本文从提取、扩增、检测3个方面总结了针对新型冠状病毒所开发的核酸即时检测方法（point-of-care testing，POCT），并对整合了这3个步骤的商业化即时检测装置进行简要介绍，以期为COVID-19及其他新兴传染病的紧急应对和快速部署提供参考。     

血液核酸检测技术

核酸检测技术（nucleic acid test．NAT）是一种新兴的献血者血液传染病检测技术．在许多发达国家和地区已普遍应用于献血者血液筛检。本文从NAT检测的必要性、血液NAT检测技术简介、目前已商品化的NAT检测试剂情况等方面进行综述．并探讨我国血液NAT检测的可能发展趋势及需注意的问题．     

仪征市4382份献血者血样核酸检测结果报道

目的探讨缩短病毒检测“窗口期”的检测方法,保证临床输血安全。方法将经常规检测方法检测合格的献血者的血样在加样仪上进行样本汇集,用核酸提取仪提取样本核酸,用核酸扩增仪对HBV、HCV、HIV做扩增检测。结果4382份经常规检测方法检测合格的献血者血样中,发现2份HBV DNA阳性（漏检率为4．65‰）,未发现HCV和HIV RNA阳性。结论经二次ELISA法检测都合格的血液,并非绝对安全,还存在HBV漏检。因此,在献血员筛查中应尽快开展NAT技术以缩短病毒检测的“窗口期”,进一步提高血液安全性。     

核酸荧光定量检测的临床应用

多聚酶链反应（PCR）方法自1989年开始被应用于临床检测以来,以其迅速、简便、灵敏等优点很快成为临床实验诊断学的技术热点。IXJt技术虽然作为一项新的高新技术而成为临床实验诊断学发展的又一里程碑,但它也需要有一个发展和完善的过程。传统PCR技术在临床应用中存在以下难题：①PCR产物需经过琼脂精凝胶电泳和紫外检测（或聚丙烯酸凝胶电泳和银染色检测）,不但需要多种仪器,而且步骤冗长、费时、费力、费资金,还需使用强致癌物（澳化乙锭EB）,威胁使用者的安全,同时电泳法还限制了大规模普查的速度。②传统PCR方法只能做到…     

仙台病毒核酸测序检测方法的建立

目的 建立仙台病毒(SeV)的核酸测序检测方法.方法 根据SeV序列设计覆盖不同毒株的通用引物,然后优化成测序引物并摸索建库条件,进行核酸测序和结果分析.结果 获得1对特异性强的通用引物,序列为:上游引物5’-GCTGCAAAACGCTGTGGG-3’,下游引物5’-TGGRACYTCAGAAAGAATRGG-3’;建库条件优化为:第一轮以cDNA为模板用通用引物扩增,第二轮以第一轮产物为模板用测序引物扩增.测序分析可以有效地将SeV与其他微生物区分开,并且精确到TianJin亚株.结论 建立了SeV核酸测序检测方法,为后续SeV感染实验动物的检验检疫提供依据.     

核酸检测法对血液标本内乙肝病毒的检测价值分析

目的：：研究分析核酸检测法对血液标本内乙肝病毒( HBV)的检测价值。方法：采集中心血站无偿献血的血液标本16214份,同时进行酶联免疫吸附法( ELISA)和核酸检测法,以筛查HBV感染情况,并分析两组检测方法的诊断价值。结果：ELISA、核酸检测HBV 的一致性较好,差异无统计学意义( P>0.05)。核酸检测法的特异性、敏感度明显高于 ELISA 检测法,而漏诊率及窗口期明显低于ELISA检测;A组的HBV－DNA阳性率、含量均高于B 组、C 组。上述差异均有统计学意义( P<0.05)。结论：核酸检测法具有高度的特异性和灵敏度,与 ELISA 检测具有一定的互补性,可有效地减少漏诊率,缩短窗口期,且HBV－DNA的含量能反映HBV的传染性,对输血安全具有重要作用。     

基于核酸保护原理的DNA芯片检测技术

目的：制备出3－末端与载玻片交联,5－末端用32P标记的检测DNA的芯片。方法：以化学法合成了3－末端为尿嘧啶核糖的寡聚脱氧核糖核苷酸片段,用32P标记寡核苷酸的5－末端,经过高碘酸氧化后与玻璃基片表面的脂肪胺基缩合,并用硼氢化钠还原,制成寡核苷酸3－末端与玻片共价交联,5－末端为同位素标记的DNA芯片,将芯片与液相中的核酸片段杂交,再用酸酶S1酶切,结果,当液相中的核酸与玻片上共价交联的寡核苷酸片段产生特异性杂交配对时,核酸酶S1不能酶切玻片上的寡核苷酸片段,且玻片上被保护的寡核苷酸量与液相中的与核酸,由于该法制备的DNA芯片各个位点的DNA探针的含量为已知,待测的核酸样品无需进行同位素或荧光标记,操作简便,适用于对样品的DNA或RNA进行检测。     

核酸检测与抗体检测在艾滋病诊断中的价值

目的 探讨核酸检测、抗体检测在艾滋病诊断中的临床价值。方法 回顾性分析2017 年4 月～2019 年4 月我市收集的100 例艾滋病患者的完整临床资料,100 例患者均接受过抗体检测、核酸检测,对比分析核酸检测、抗体检测诊断早期、中晚期艾滋病感染者的诊断符合率及灵敏度。结果 经核酸、抗体检测,核酸检测早期艾滋病感染者的诊断符合率（93.33%）高于抗体检测（75.00%）;抗体检测诊断中晚期艾滋病感染者的诊断符合率（97.50%）高于核酸检测（75.00%）;核酸检测诊断早期艾滋病感染者的灵敏度（96.55%）高于抗体检测（80.36%）;抗体检测诊断中晚期艾滋病感染者的灵敏度（88.64%）高于核酸检测（71.43%）（P＜0.05）。结论 在艾滋病感染的早期诊断中,核酸检测早期艾滋病感染者的准确率、灵敏度均较高,而在艾滋病感染的中晚期诊断中,抗体检测的准确率、灵敏度则均较高。因此,核酸检测与抗体检测各有优势,临床医师应依据实际情况选择适宜的检测方式,如有必要,可尝试将二者结合应用,进一步提高临床检测艾滋病感染的诊断准确性和灵敏度,帮助医师尽早确诊艾滋病,早期予以患者相应的抗病毒治疗。     

呼吸道病毒核酸检测技术研究进展

急性呼吸道感染是临床最常见的疾病之一。呼吸道病毒作为其最主要的致病病原体,种类繁多,不易区分。因此,建立一种快速、灵敏、特异的检测方法显得尤为重要。近年来,随着分子生物学的不断发展,呼吸道病毒检测方法日新月异,尤其是基于聚合酶链反应的分子诊断技术以其检测速度快、灵敏度高、特异性强等特点在呼吸道病毒检测过程中发挥了重要作用。     

Nucleic Acid Vaccines

Anew method of immunization was discovered in the early 1990s. Several research groups independently demonstrated that direct inoculation of DNA plasmids coding for a specific protein antigen could elicit immune responses against that antigen[1-4].Since in theory the mRNA molecules also have the potential to be translated into the protein antigen, this vaccination approach was officially named by WHO as the nucleic acid vaccination even though the term DNA vaccine has been used more commonly in the literature. This novel approach is considered the fourth generation of vaccines after live attenuated vaccines, killed or inactivated vaccines and recombinant protein based subunit vaccines.     

PCR-核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究

背景　新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球暴发,实验室检测结果是疾病诊断的重要依据,检测方法的灵敏度和特异度是影响实验结果的关键因素,现实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）核酸检测方法是COVID-19确诊的通用方法,但其检测灵敏度有方法局限性,依赖标本病毒含量。通过对PCR-核酸飞行时间质谱检测方法的优化,从而提高对低新型冠状病毒（SARS-CoV-2）含量病例检测的灵敏度,可为现有方法做有效补充。目的　应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）原理,在Clin-ToF Ⅱ飞行时间质谱系统上,建立PCR-核酸飞行时间质谱（PCR-TOF MS）系统检测SARS-CoV-2的方法,并评估其实际应用价值。方法　2020年2-3月于上海市临床检验中心室间质评阳性样本40份、阴性样本7份,国家卫生健康委员会室间质评阳性样本41份、阴性样本33份,本实验室购买阳性质粒及稀释样本32份,健康人样本28份,空白对照超纯水5份,共186份样本作为建立PCR-TOF MS系统数据。于2020年1-2月收集安徽省内临床送检到安徽省疾病预防控制中心的疑似COVID-19患者上呼吸道样本80份（咽拭子样本55份、痰液样本25份）及健康人群样本20份（均为咽拭子样本）作为评估PCR-TOF MS系统效果的数据。建立PCR-TOF MS系统试验体系步骤,包括PCR扩增、虾碱性磷酸酶（SAP）消化、单碱基延伸和质谱检测;并基于阳性质粒优化模版量,根据186份样本检测质谱峰的信噪比（SNP）确定该方法在SARS-CoV-2检测时的判读标准。对80份疑似SARS-CoV-2样本和20份健康人群样本进行检测分析,并与实时荧光定量PCR法进行对比。结果　通过对PCR-TOF MS 模板条件的优化,模版量6 μl时,扩增产物可获得典型的质谱峰图。建立的PCR-TOF MS反应体系可以对SARS-CoV-2核酸的开放读码框1ab（ORF1ab）基因和核壳蛋白（N）基因进行有效扩增检测。本研究PCR-TOF MS方法对临床疑似病例样本的检出率为90.00%,高于实时荧光定量PCR法的75.00%,同时,结果显示,实时荧光定量PCR法检出中含有25.00%的可疑结果,而PCR-TOF MS则无可疑结果。对于痰液和咽拭子两种样本的检出率,PCR-TOF MS法分别为100.00%和85.45%,高于荧光定量PCR法的64.00%和43.64%。阴性样本两种方法均未检出。结论　通过PCR技术与飞行时间质谱技术的结合,使得检测SARS-CoV-2目标片段指数级扩大,从而提高样本的检测灵敏度。MALDI-TOF MS技术通过对离子分子量的检测分析,具有较高的准确性和特异性,同时证实了痰液样本优于咽拭子样本。该方法可作为实时荧光定量PCR法的补充和协同,在一定程度上有利于弥补假阴性的问题,从而降低临床漏诊率,提高检测效率,为疫情的研判缩短时间。     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测尿液中沙眼衣原体的分析

目的评价实时荧光核酸恒温扩增技术（SAT）检测尿液中沙眼衣原体（CT）的特异性和敏感性。方法对175例疑似患者生殖道拭子行CT—SAT、PCR检测和沙眼衣原体培养,同时对对应的175份尿液标本行CT—SAT检测。结果SAT对同一患者的拭子标本和尿液标本的检测结果符合率100％。1例淋球菌培养阴性而SAT阳性,2例PCR阳性而SAT阴性。结论SAT技术检测拭子及尿液中的沙眼衣原体具有很高的灵敏度和特异性,为CT的实验室诊断提供新的检测方法。     

化学发光加强法核酸标记检测系统用于猪DNA指纹分析的研究

目的　探讨化学发光加强法(ECL)核酸直接标记和检测系统应用于猪的DNA指纹分析的可行性。方法　采用人源α-珠蛋白3'HVR探针,应用ECL核酸直接标记和检测系统,对西双版纳小耳猪进行了Southern杂交DNA指纹分析,获得了最适实验条件。结果　取10μg基因组DNA于30μl反应体系中,加入HinfⅠ或HaeⅢ内切酶3～5U/μgDNA,酶切消化4h,消化液在50V电压条件下4℃电泳20h,采用真空转移法进行脱嘌呤、碱变性、中和及转膜,时间分别为15min、15min及20min,转膜采用20×SSC真空转移1h至hybondN+尼龙膜上,大大提高了转膜效率。以HRP标记探针进行管中杂交,以化学发光法进行检测,室温放射自显影30min,获得了清晰可辨的DNA指纹图。结论　该方法可用于猪的DNA指纹分析,其效果与同位素标记探针的效果基本一致。     

用生物素标记CVB_3 cDNA制备探针检测病毒核酸

本文报道用含CVB_3 cDNA PstI酶切片段(530bp)的重组质粒pGP_(51)B转化大肠菌;经扩增后提取,纯化重组质粒DNA;用生物素标记制备探针。通过原位杂交技术检测不同的肠道病毒和非肠道病毒感染的HeLa细胞。实验结果表明,该探针只与肠道病毒RNA杂交,而不与非肠道病毒核酸杂交,且可检测出病毒感染后3h,5h(CPE-)的病毒核酸。可见该探针具有良好的特异性和敏感性,且可用于肠道病毒感染引起的心脏疾病的活检标本诊断。     

利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法

  目的  利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法。  方法  针对新型冠状病毒的特征核壳蛋白N基因和开放阅读框1ab（ORF1ab）基因序列保守区设计引物，获得了 RT-LAMP 检测体系，并评价该体系的特异性、最低检测限、抗干扰能力和最佳反应时间。  结果  经检测新型冠状病毒核酸标准物质，其结果与预期相符，证实了该检测体系的可行性。  结论  利用逆转录环介导恒温扩增技术快速检测新型冠状病毒核酸的反应体系特异性好、灵敏度高，适用于边境条件有限地区。