重组HDV核酶逆转录病毒的生产及对HBV抑制效率的测定

目的:构建含HDV核酶基因的重组逆转录病毒载体，包装出逆转录病毒实现其在HepG2215细胞中稳定表达,并研究其是否抑制HBV的复制。方法:应用PCR方法扩增HDV核酶基因，克隆入逆转录病毒载体pMSCV/U6中，用脂质体法转染逆转录病毒载体包装细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,用PCR和药物抗性水平传播分析检测野生型辅助病毒。收获的病毒感染HepG2215细胞，用酶联免疫实验测定对HBV的抑制率。结果:重组逆转录病毒载体的酶切鉴定片段约为73bp，与预期值一致。脂质体转染包装细胞，嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×10⁶ CFU/ml)的细胞克隆，且未检测到辅助病毒，对HBV的抑制率最高可达61.56 %。结论:成功构建重组逆转录病毒载体，在包装细胞系中能生产出高滴度的逆转录病毒，能有效的抑制HepG2215细胞内HBV的复制，为HBV的基因治疗提供了实验数据。     

HBX基因逆转录病毒载体的构建及在LO2细胞内的稳定表达

目的 构建乙型肝炎病毒X基因(HBX)逆转录病毒载体,并使其在人正常肝细胞LO2内的进行稳定表达.方法 PCR扩增HBX基因,克隆到逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag中,构建表达HBX的重组逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag-HBX,通过通过PCR、酶切、测序验证HBX基因后;体外将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBX基因的重组逆转录病毒,并感染靶细胞人正常肝细胞LO2,稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,获得成功转入HBX的LO2细胞.通过RT-PCR和Western blot进一步验证HBX基因及HBx蛋白在LO2细胞内的表达.结果 (1)成功获得携带HBX基因的阳性重组质粒pSEB-Flag-HBX;(2)HBX基因被逆转录病毒成功地导入靶细胞LO2细胞,并实现稳定表达,RT-PCR检测到HBX mRNA在靶细胞中的表达,Western blot检测到HBx蛋白在靶细胞LO2-HBx细胞中的表达.结论 成功构建了携带HBX基因的重组逆转录病毒载体,感染人正常肝细胞LO2后能够稳定表达HBx蛋白,为进一步探讨HBx在肝癌发生发展中的作用提供了较为理想的实验模型.     

特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1 pSUPER retro RNAi系统的构建

目的 构建并筛选携带针对Epstein-Barr病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将60 bp能转录产生靶向LMP1小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317,G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组逆转录病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7 167 bp和281 bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆.结论 特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建和筛选成功.     

携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

 【目的】 构建携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响｡ 【方法】 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点(MCS)的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况､以及对靶细胞生物特性的影响｡ 【结果】 成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制｡高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP｡ 【结论】 使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础｡     

EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A（LMP2A）的逆转录病毒表达载体，筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）扩增获取目的基因LMP2A，定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro-2A，脂质体法将pMSCVpuro-2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体；筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆；收获病毒的滴度为3．2×10^7CFu／L，且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro-2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒，进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67-LMP2A。     

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的：构建 mIL-12重组逆转录病毒载体。方法：将 mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果：重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论：包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。     

靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建

目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体。方法采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列片断依次克隆入真核表达载体pLXSN中,并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况。以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的RNAi效果。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后,重组病毒感染人Hela细胞24h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1%。重组逆转录病毒感染人Hela细胞48h时,MTT实验测得细胞死亡率为53.2%。结论成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT,并制备了重组逆转录病毒,初步观察了效应,为进一步利用小干扰RNA技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

pLXSN-EGFP逆转录病毒载体的构建及体内外表达的研究

目的构建携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒载体,观察该报告基因在动物体内外表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。方法以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN获得重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后收集具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP作为报告基因在体内外的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。结果成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并在体内外稳定表达,对靶细胞及其所成肿瘤的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30.7%细胞表达GFP。结论该载体可在体内外成功表达,对靶细胞的生长无明显抑制,高表达GFP的靶细胞有一定形态上的变化;使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低。     

人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的 利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将3条60 bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法转染包装细胞系Phoenix A,建立产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功.结论 特异性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤治疗开辟新途径.     

hSALL4基因逆转录病毒载体的构建及在小鼠髓系祖细胞中的表达

目的：构建含人SALL4B基因的逆转录病毒载体并证明其在小鼠髓系祖细胞中的表达。方法：①用PCR方法从质粒pcDNA3-hSALL4B扩增包括有全部编码序列的人SALIABcDNA,将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成含hSALL4的重组逆转录病毒载体;②将重组质粒在包装细胞系PT67中进行包装,用病毒上清感染32D细胞;③RT—PCR分析其mRNA表达;④Westernblotting分析其蛋白质的表达。结果：①限制型内切酶酶切,PCR及DNA测序均证实hSALIAB成功地克隆入pLXSN;②转染的32D细胞在mRNA水平及蛋白水平均有SALIAB表达。结论：成功地构建了含人SALIAB的逆转录病毒表达载体;且表达于32D细胞中,为研究SALIA基因过表达对造血功能的作用及其机制奠定了基础。     

TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立

目的　构建含有鼠酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH,建立 PA317产病毒细胞系。方法　将质粒 p GEM- 2上酶切下的 THc DNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体 N2 A连接 ,克隆出重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH。把 p N2 ATH质粒转入 PA317包装细胞 ,通过 G4 18抗性筛选 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,得到高滴度产毒 PA317/p N2 ATH细胞株 ,免疫组化测定细胞 TH表达。结果　重组质粒 p N2 ATH经酶切鉴定证明 THc DNA正向插入 N2 A表达载体中 ,PA317/p N2 ATH产毒细胞高效表达 TH。结论　成功地构建了重组逆转录病毒表达载体p N2 ATH,建立了 PA317/p N2 A产毒细胞株     

可调控性uPA诱导表达系统的构建及功能鉴定

目的构建可调控性尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,u PA)诱导表达系统并进行相关鉴定,可为进一步构建可诱导型肝脏人源化u PA-SCID动物模型奠定基础。方法可调控性u PA诱导表达系统即在强力霉素(doxycycline,Dox)诱导下通过tet-on系统调控u PA表达。为此,需要构建两个重组质粒,分别为p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA和p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green,前者引入Gaussia荧光素酶(gaussia enzyme fluorescent element,Gluc)与四环素反式激活因子(reverse tetracycline transactivator,rt TA)偶联表达,以便于监测rt TA表达水平;后者同时偶联表达Zs Green,以便于用荧光显微镜观察基因表达。重组逆转录病毒载体进行表达功能鉴定后,将构建质粒与病毒包装衣壳蛋白VSV-G质粒共转染GP2-293包装细胞系后获得具有感染能力的病毒颗粒,利用该病毒感染NIH/3T3细胞,并用G418筛选出阳性细胞;期间各取部分细胞,使用PCR方法鉴定其基因组内是否含有相应基因转录调控本。结果成功构建p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA和p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green克隆。功能鉴定显示,p LNHXO1O2-Alb-GLUC-FMN2A-rt TA克隆可表达rt TA;p LNHXO5O6-TRE2-u PA-IRES-Zs Green克隆转染Hep G-Tet-on细胞,加Dox可诱导u PA表达。包装病毒感染NIH/3T3细胞后通过G418筛选获得单细胞克隆,通过PCR方法鉴定表明其基因组内含有相应转录本,从而成功构建u PA诱导表达稳定细胞株。结论本研究初步建立了可调控性u PA诱导表达系统,从而为可诱导肝损的u PASCID转基因小鼠的构建及在此基础上的肝脏人源化动物模型的建立奠定了基础。     

小鼠BMPRⅠb基因慢病毒载体构建及转染神经干细胞

目的:构建携带小鼠BMPRⅠb基因的慢病毒载体,并转染神经干细胞,为研究BM-PRⅠb在BMPs调控神经干细胞分化中作用奠定基础。方法:利用RT-PCR从小鼠脑组织中获得BMPRⅠb基因,然后定向插入慢病毒表达质粒,进行双酶切及测序鉴定。将鉴定成功的重组慢病毒质粒和另外两种辅助质粒共转染包装细胞,收集、浓缩慢病毒并检测其滴度。利用获得的慢病毒载体转染NSCs,并观察目的基因表达情况。结果:RT-PCR产物经电泳及测序证实克隆成功BM-PRⅠb基因,酶切及测序鉴定成功构建重组慢病毒质粒,共转染293T细胞72h后大部分细胞表达绿色荧光,病毒滴度为5×108 TU/ml。慢病毒感染后的NSCs表达绿色荧光且BMPRⅠb mRNA表达上升。结论:成功构建BMPRⅠb基因慢病毒载体,并成功转染NSCs。     

Constructing retroviral vector carrying green fluorescent protein （GFP） and investigating the expression of GFP in primary rat myoblast

INTRODUCTION Green fluorescent protein ( G FP ) absorbs blue or ultraviolet light , and gives out bright green fluorescence.G FP has been expressed in a variety of species , and extentively used in tissue engineering [1]. M yoblast could fuse w ith host m yofibers , transform - ing the target gene into the host , and expressing corressponding gene product.M yoblast is com patible w ith collagen and could be induced to differentiate by collagen. N ow m yoblast has been used in studies on…     

抗端粒酶M1RNA核酶真核表达载体构建及肝癌细胞转染的研究

目的构建抗人端粒酶RNA(hTR)的M1RNA核酶的真核表达载体,并筛选稳定转染核酶的肝癌细胞株。方法设计并应用PCR技术合成hTR模板的M1RNA核酶,应用pEGFPC1载体构建M1RNA核酶的真核表达质粒,应用脂质体LipofectAMINEAM2000转染肝癌细胞系HepG2,应用G418筛选稳定表达核酶的细胞株。结果测序证实hTR的M1RNA核酶基因被正确克隆入真核表达载体pEGFPC1,应用脂质体成功转染肝癌细胞系HepG2。结论成功构建了hTR的M1RNA核酶,并筛选出了稳定表达核酶的肝癌细胞株。     

人GLUT3基因RNA干扰病毒载体的构建与鉴定

目的：筛选出人GLUT3基因有效的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列,并构建出慢病毒RNAi载体。方法：根据GLUT3基因mRNA序列设计合成siRNA片段4个,分别定向克隆至pLV-shRNA载体上,并将构建的质粒转染HeLa细胞,运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测GLUT3mRNA的表达量验证其干扰效果。筛选出其中有效的质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒,测定病毒颗粒滴度后,将病毒感染U251胶质瘤细胞以测定感染慢病毒干扰载体后胶质瘤细胞内GLUT3的表达情况。结果：重组RNAi质粒pLV-shRNA-GLUT3-1,pLV-shRNA-GLUT3-2,pLV-shRNA-GLUT3-3,pLV-shRNA- GLUT3-4经测序证实质粒载体构建成功;4个干扰质粒在HeLa细胞中均可以明显抑制GLUT3-mRNA的表达。pLV-shRNA-GLUT3可以在293T细胞中成功包装。收集293T细胞分泌的病毒上清浓缩后测定病毒颗粒LV-GLUT3滴度为1.5×109 TU/mL。与感染阴性对照慢病毒颗粒(0.3641±0.044)相比,胶质瘤U251细胞感染慢病毒颗粒LV- GLUT3后,GLUT3蛋白相对表达明显降低(0.108±0.016,t=16.267,P<0.001)。结论：成功构建了人GLUT3基因有效的慢病毒RNAi载体,为进一步研究GLUT3的生物学功能奠定了基础。     

人AQP1-shRN A 表达质粒载体的构建与筛选

目的：构建针对人水通道蛋白1（AQP1）基因的shRNA表达质粒载体,并验证其干扰效果,为进一步探讨AQP1基因对人乳腺癌细胞的作用及机制建立基础。方法设计合成4对针对人AQP1基因不同位点的shRNA片段,通过DNA重组技术将其插入载体GV115中,构建AQP1‐shRNA重组质粒,转染人乳腺癌MCF‐7细胞,并通过实时荧光定量 PCR（RT‐PCR）和Western blot法检测干扰效率。结果 RT‐PCR法证实AQP1在乳腺癌 MCF‐7细胞中有表达。测序验证表明4对靶向AQP1‐shRNA表达载体均构建成功。4组干扰载体能够从基因和蛋白表达水平不同程度抑制 AQP1表达,其中以AQP1‐shRNA 4对AQP1的干扰效率最强。结论成功有效地构建了针对人AQP1基因的shRNA重组质粒,能够有效抑制人乳腺癌细胞MCF‐7中A Q P1的表达。     

丁型肝炎病毒复制包装载体的构建

目的  构建一种可以实现丁型肝炎病毒（HDV）复制包装的HDV转座子载体。方法  采用分子克隆方法构建含HDV复制子和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表达框的转座子（PB）载体PB126I3,将构建好的载体转染HuH-7细胞,转染48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,转染48 h后收集细胞上清用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg的表达,质粒转染细胞8.5 d后提取病毒用逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测HDV核糖核酸（RNA）的含量;同时细胞上清病毒浓缩后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/NTCP）稳定转染的HepG2.N9细胞系并于感染后第7天用免疫荧光检测细胞内HDVδ抗原的表达。结果  HDV复制包装载体PB126I3瞬时转染HuH-7后细胞上清可检测到HBsAg的表达和较高滴度的HDV颗粒,并且该病毒颗粒感染HepG2.N9细胞7 d后细胞内可检测到HDVδ抗原。结论  HDV复制包装转座子载体构建成功,为未来HDV的大规模复制包装以及尝试建立HDV稳定转染细胞系提供前期基础。

     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。