联合应用白介素2和白介素6基因转染瘤苗抗肿瘤的实验研究

为了提高细胞因子基因转染瘤苗治疗肿瘤的效果，本实验观察了联合应用白细胞介素２（ＩＬ－２）基因转染瘤苗和白细胞介素６（ＩＬ－６）基因转染瘤苗治疗黑色素瘤实验性肺转移小鼠的效果，结果表明，联合治疗组荷瘤小鼠的肺转移结节数显著地少于单用瘤苗治疗组，其存活期也显著长于单一瘤苗治疗组，其脾脏细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性、天然杀伤细胞（ＮＫ）活性、淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ）活性以及ＩＬ－２和ＴＮＦ分泌水平均非常显著地高于单一瘤苗治疗组水平。实验结果说明，ＩＬ－２基因转染瘤苗与ＩＬ－６基因转染瘤苗联合应用后，能更有效地激活免疫功能达到更佳的抗肿瘤效果。     

Macrophage activation of lymphoma-bearing mice by liposome-mediated intraperitoneal IL-2 and IL-6 gene therapy

Objective To investigate the antitumor mechanism of interleukin-2 (IL-2) and interleukin-6 (IL-6) gene therapy. Methods Liposome encapsulated IL-2 DNA and IL-6 DNA were intraperitoneally (i.p.) injected into mouse lymphoma cell line (EL-4) lymphoma-bearing mice. Macrophage function (MФ) from the mice was assessed. Results Cytotoxicity, major histocompatibility (MHC) Ⅱ expression and IL-1 and TNF secretion of the macrophages all augmented after i.p. injection of liposome encapsulated IL-2 DNA or IL-6 DNA. More efficient activation of macrophages was observed in mice treated with liposome encapsulated IL-2 DNA than IL-6 DNA. IL-2 gene therapy combined with IL-6 gene therapy showed the maximal activation of macrophages in the lymphoma-bearing mice.Conclusion IL-2 and IL-6 gene therapy can relieve the supression of macrophages of the lymphoma-bearing mice, and efficiently activate the antitumor immune responses.     

成纤维细胞介导的白细胞介素2基因疗法的免疫增强作用及其抗肿瘤效果

为了使白细胞介素２（ＩＬ－２）在体内持续有效地发挥生物学效应，作者探讨了成纤维细胞为介导途径的ＩＬ－２基因疗法以及该疗法在小鼠体内的抗肿瘤作用。将基因转染后、高分泌ＩＬ－２的成纤维细胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＬ－２＋）包裹入胶原后移植入小鼠腹腔内，可使小鼠血清中持续性地存在一定水平的ＩＬ－２，并能非常显著地增强小鼠脾细胞的增殖反应、天然杀伤细胞（ＮＫ）活性和淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ）活性、分泌细胞因子（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、ＩＬ－２）的水平，尤其有意义的是诱导出内源性的ＬＡＫ活性。ＮＩＨ３Ｔ３－ＩＬ－２＋腹腔内移植后对腹水型肝癌小鼠有较显著的治疗效果，当与ＬＡＫ细胞腹腔内注射联合应用后，治疗效果更佳，表明成纤维细胞介导的ＩＬ－２基因疗法能通过增强机体的免疫功能发挥显著的抗肿瘤作用，而且当其与ＬＡＫ细胞过继回输合用后抗肿瘤作用更强。     

腺病毒介导人IL-2基因治疗的抗肿瘤作用及机理分析

目的　观察重组人白介素 2腺病毒 (advh IL- 2 )在小鼠肝癌 H2 2中的转染效率、表达时程、体内抗肿瘤作用及其免疫机理。方法　小鼠皮下接种肝癌 H2 2 ,将肿瘤生长至体积为 10 0～ 2 0 0 mm3的荷瘤小鼠随机分组 ,经肿瘤局部注射给药。用 X- gal染色法检测重组腺病毒载体 adv L ac Z的转染效率 ;用 RT- PCR检测人 IL- 2基因的持续表达时间 ;以 H2 2瘤体生长及荷瘤小鼠存活时间评价 advh IL - 2抗肿瘤作用 ;以 51 Cr 4小时释放法测定治疗小鼠脾细胞的 L AK与 CTL 杀伤活性 ,免疫荧光法分析肿瘤组织内 CD4 +与 CD8+ T细胞浸润情况。结果　肿瘤局部单次注射 1× 10 9pfu重组腺病毒 ,可在肿瘤组织中进行有效的转染及表达 ,人 IL- 2基因的表达时间长于 12 d。AdvhIL- 2的抗肿瘤作用具有剂量依赖性 ,与 PBS组比较 ,2× 10 9pfu advh IL- 2可非常明显地抑制 H2 2皮下瘤的生长、延长荷瘤小鼠的生存时间 (P<0 .0 1) ,同时明显增强脾细胞 L AK与 CTL杀伤活性 (P<0 .0 1) ,增加肿瘤组织内CD4 + 与 CD8+ T细胞的浸润。结论　 Advh IL - 2通过介导人 IL - 2基因在小鼠 H 2 2肿瘤组织中的持续表达 ,产生明显的体内抗肿瘤作用 ,其机理与激活荷瘤小鼠抗肿瘤免疫反应有关     

大豆异黄酮对老龄大鼠雌激素水平和子宫雌激素受体表达的影响

目的将白细胞介素2（IL-2）基因修饰树突状细胞（DC）,观察其和对胰腺癌荷瘤裸鼠的治疗作用。方法将IL-2基因转染单个核细胞来源的DC后,用于激发自体细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,检测其对CTL的增殖和人胰腺癌PC3细胞杀伤性的影响：检测CTL对荷人胰腺癌PC3细胞肿瘤裸鼠肿瘤生长情况影响和对肿瘤细胞分裂指数和端粒酶活性的影响。结果IL-2基因修饰的DC细胞所激发的CTL对胰腺癌PC-3细胞有较强的抑制作用,并能抑制荷瘤裸鼠肿瘤细胞的分裂指数和端粒酶活性。结论IL-2基因修饰DC细胞激活的CTL抗PC-3肿瘤免疫作用明显增强,能明显抑制人胰腺癌PC3细胞种植瘤的生长。     

荷胃癌小鼠自杀基因治疗后宿主免疫功能观察

目的 研究自杀基因疗法是否能诱导肿瘤宿主产免疫应条。方法 将小鼠胃癌细胞株（ＭＦＣ）接种于小鼠背部制作肿瘤模型,以单线疱疹病毒苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）和大肠杆菌胞嘧啶脱氧基酶基因（ＣＤ）注射于瘤体内,并于瘤体周围注射ｍＩＬ－２和ｍＧＭ－ＣＳＦ ＤＮＡ及向腹腔内注射前药９－丙氧乌苷（ＧＶＣ）和５－Ｆｃ。治疗第５周取肿瘤消退小鼠的脾细胞测自然杀伤细胞（ＮＫ）和ＬＡＫ活性;第１２周取ＰＢＬ和脾细胞测Ｎ     

荷胃癌小鼠自杀基因治疗后宿主免疫功能观察

目的 研究自杀基因疗法是否能诱导肿瘤宿主产生免疫应答。方法将小鼠前胃癌细胞株(MFC)接种于小鼠背部制作肿瘤模型,以单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)和大肠杆菌胞嘧啶脱氧基酶基因(CD)注射于瘤体内,并于瘤体周围注射mIL－2和mGM-CSFDNA及向腹腔内注射前药9－丙氧乌苷(GVC)和5－Fc。治疗第5周取肿瘤消退小鼠的脾细胞测自然杀伤细胞(NK)和LAK活性;第12周取PBL和脾细胞测NK和细胞毒细胞(CTL)活性。结果在TK／CD基因联合细胞因子及前药治疗后第5周,实验组脾细胞NK和LAK活性均明显高于荷瘤鼠对照(P<0．01)。12周后,实验组PBL的NK和CTL活性均显著高于正常对照组(P=0．05,P<0．01);而脾细胞NK活性与对照组无显著差异(P>0．05)。结论自杀基因疗法能较长时间提高宿主抗肿瘤免疫反应。     

肿瘤坏死因子对淋巴激活素活化的杀伤细胞抗肿瘤活性的影响

用B_(16)W_(10)黑色素瘤作靶瘤,C_(57)BL/6小鼠为荷瘤动物,小鼠脾细胞经白细胞间介质-2培养3d为效应细胞即LAK细胞,观察了肿瘤坏死因子对LAK细胞抗肿瘤活性的影响。体外实验结果表明:单独肿瘤坏死因子(500U/ml)或低剂量白细胞间介质-2(10U/ml)均不影响LAK细胞的杀瘤活性;肿瘤坏死因子能增强亚适剂量白细胞间介质-2(100U/ml)诱导的LAK细胞活性。而不增强最适剂量白细胞间介质-2(1000U/ml)诱导的LAK细胞活性。体内实验结果表明:对局部肿瘤,瘤内同时注射肿瘤坏死因子和白细胞间介质-2和LAK细胞时,6只荷瘤鼠4只瘤块消失。其中2只存活期超过60d。对全身肺转移癌、肿瘤坏死因子、白细胞间介质-2和LAK细胞联合静脉注射亦显抗瘤作用增强,该组小鼠肺表面瘤结节数和肺结节发生率减少。     

共刺激分子B7.1和葡萄球菌肠毒素A膜表面共修饰瘤苗抗肿瘤作用的研究

目的 观察跨膜型葡萄球菌肠毒素A(SEA-TM)和糖基化磷脂酰肌醇锚定型mB7．1(mB7．1-GPI)二种免疫分子膜表面修饰瘤苗的抗肿瘤作用是否优于单种免疫分子膜表面修饰的瘤苗。方法构建pcDNA3．1( )／mB7．1-GPI真核表达载体,转染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)中,表达和纯化mB7．1-GPI。通过蛋白转染法将SEA-TM、mB7．1-GPI单独或共同锚定到EL-4肿瘤细胞膜上,制成瘤苗,观察这些瘤苗刺激小鼠脾细胞的增殖和分泌白细胞介素(IL)-2和γ干扰素(IFN)-γ的量及抗肿瘤作用。结果mB7．1-GPI。和SEA-TM能单独或共同锚定在肿瘤细胞膜上,具有相当的稳定性;在体外有刺激小鼠脾细胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ的功能。mB7．1-GPI、SEA-TM、mB7,1-GPI SEA-TM锚定肿瘤细胞,制成的瘤苗,能抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的存活时间。mB7．1-GPI和SEA-TM双锚定瘤苗,显示出比单一蛋白锚定瘤苗更强的抗肿瘤作用。结论用蛋白转染法将SEA和mB7.1二种免疫分子同时锚定到肿瘤细胞膜上所制成的瘤苗,其抗肿瘤作用优于单种免疫分子锚定的瘤苗。     

Experimental study on immunomodulation and antitumor effects of melatonin in H22 hepatoma-bearing mice

Recently,itwasdemonstratedthatmelatonin(MLT)whichisreleasedmainlyfromthepinealgland,notonlyplayedanimportantroleintheregulationoftheneuroendocrineandlmmunesys-tems,butalsoaffectedtumorgrowthinvivo[l'2].Withthedevelopmentofneuroimmuno-modula-tion,peoplehavebeenstudyingtherolesofMLT-,.lnlmmunomodulationconcerningtheetiology,di-agnosisandtreatmentofinfection,tumorandau-to-immunediseases.InChina,therehavebeenfewreportsinthisfield.Inthisstudy,weobservedtheimmunomodulationandantitumoreffectofMLT…     

瘤体注射IL-2重组腺病毒基因治疗小鼠胶质母细胞瘤及其免疫机制的初步探讨

目的：观察瘤体直接注射IL－2重组腺病毒对G422皮下荷瘤的治疗作用,对体内基因转染效率及治疗的免疫机制进行初步分析。方法：将LacZ,IL-2重组腺病毒直接注射到皮下接种的G422胶质母细胞瘤瘤体,X－gal染色检测基因转染的效率,观察肿瘤的大小和荷瘤小鼠的存活期,采用4h^51Cr释放法检测荷瘤小鼠脾细胞诱导的NK、LAK、CTL的杀伤活性,对治疗后的肿瘤进行常规病理分析。结果：采用瘤体注射腺病毒具有较高的体内基因转染效率,瘤体注射IL－2重组腺病毒对皮下建立的胶质母细胞瘤有一定的治疗作用,肿瘤的生长受抑制,荷瘤小鼠的存活期显延长,但没有长期存活小鼠。IL－2基因治疗组小鼠脾细胞的LAK、CTL杀伤活性显增强,肿瘤局部出现更多的坏死和炎性浸润细胞。结论：采用瘤体直接注射IL－2重组腺病毒对胶质母细胞瘤皮下荷瘤有治疗,其机制可能是增强了宿主的局部和全身抗肿瘤免疫反应。     

Antitumor effects of interleukin-18 gene-modified hepatocyte cell line on implanted liver carcinoma

Objective To investigate the antitumor effects of intrasplenically transplanted interleukin-18 (IL-18) gene-modified hepatocytes on murine implanted liver carcinoma. Methods Embryonic murine hepatocyte cell line (BNL-CL2) was transfected with a recombinant adenovirus encoding IL-18 and used as delivery cells for IL-18 gene transfer. Two cell lines, BNL-LacZ and BNL-CL2, were used as controls. One week after intrasplenic injection of C26 cells (colon carcinoma line), tumor-bearing syngeneic mice underwent the intrasplenic transplantation of IL-18 gene-modified hepatocyte cell line and were divided into treatment group (BNL IL-18) and control groups (BNL-LacZ and BNL-CL2 ). Two weeks later, the serum levels of IL-18, interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and nitric oxide (NO) in the implanted liver carcinoma-bearing mice were assayed, the cytotoxicity of murine splenic cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) was measured, and the morphology of the hepatic tumors was studied to evaluate the antitumor effects of the approach. Results In the treatment group, the serum levels of IL-18, IFN-γ, TNF-α and NO increased significantly. The splenic CTL activity increased markedly (P&lt;0.01) , accompanied by a substantial decrease in tumor volume and the percentage of tumor area and prolonged survival of liver carcinomo-being mice. Conclusions In vivo IL-18 expression by ex vivo manipulated cells with IL-18 recombinant adenovirus is able to exert potent antitumor effects by inducing a predominantly T-cell-helper type 1 (Th1) immune response. Intrasplenic transplantation of adenovirus-mediated IL-18 gene-modified hepatocytes could be used as a targeting treatment for implanted liver carcinoma.     

Augmentation of antitumor effect of adenovirus-mediated CD suicide gene therapy by cotransfer of interleukin 2 gene in melanoma-bearing mice

Ｓｕｉｃｉｄｅｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｈａｓｂｅｅｎｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙａｎｄｉｎｔｅｎｓｉｖｅｌｙｓｔｕｄｉｅｄｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃａｎｃｅｒｂｏｔｈｉｎａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．１３Ｃｙｔｏｓｉ...     

TNF-α gene-modified dendritic cells act as more potent adjuvants for peptide delivery to induce specific antitumor immunity in mice

Objective To investigate the antitumor immune efficiency of mouse dendritic cells (mDCs) by using adenovirus-mediated tumor necrosis factor-alpha (AdV-TNF-α) gene transfer.Methods MDCs infected with AdV-TNF-α and AdV-pLpA (no gene insert) at 100 multiplicity of infection (MOI) were analyzed by RNase protection assay for their cytokine secretion. Mixed lymphocyte reactions were also performed to analyze their capacity for alloantigen-presentation. C57BL/6 mice were challenged with R3LL tumor cells (Lewis lung carcinoma line) 10 days after vaccination with different engineered DCs and regular DCs as well.Results Compared to AdV-pLpA and mock-infected DCs, AdV-TNF-α-infected DCs displayed up-regulated expression of alpha tumor necrosis factor, interleukin-12 (IL-12), interleukin-18 (IL-18) and granulocyte macrophage colony stimulation factor (GM-CSF), and indicated stronger allogeneic T cell proliferative responses. Furthermore, vaccination of mice with dendritic cell tumor necrosis factor-alpha (DCTNF-α) pulsed with Mut1 peptide induced more efficient tumor-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) cytotoxicity against R3LL tumor cells in vitro and with efficient antitumor immunity in vivo. Conclusion This type of engineered DCs could be applied in clinical settings of DC-based cancer vaccines     

鳞癌瘤体内注射脂质体包裹的人α-干扰素基因的抗肿瘤作用

目的：研究瘤体内直接注射脂质体包裹的人ＩＦＮα基因的抗肿瘤效果。方法：在鳞癌荷瘤裸鼠的瘤体内注射体外已制备好的用脂质体包裹的ＩＦＮα ＤＮＡ,观察肿瘤生长状况及小鼠存活情况。结果：瘤体内注射脂质体包裹的人ＩＦＮα基因后,荷瘤裸鼠肿瘤的生长明显受抑,其中部分荷瘤裸鼠的肿瘤消失;荷瘤裸鼠的存活期明显延长,部分荷瘤裸鼠可长期存活。病理结果显示,治疗后的肿瘤细胞形状不一,有多数细胞质崩解,破坏明显。结论：瘤体内注射脂质体包裹的ＩＦＮα基因后,可在瘤体内原位直接转染肿瘤细胞并破坏该肿瘤细胞,从而达到抑制肿瘤生长的效果。     

黄芪多糖、刺五加多糖和枸杞多糖在体内对LAK细胞抗肿瘤活性的调节作用

黄芪多糖(APS)、刺五加多糖(PAS)和枸杞多糖(LBP)5-10 mg/kg体重分别腹腔注射C57BL/6小鼠,发现3种多糖均可明显促进小鼠脾细胞增殖。将这种脾细胞以2×10~6/ml经125-1000 U/ml IL-2体外诱导4天,用[~(125)I]UdR释放分析测LAK活性,发现注射APS组小鼠脾细胞LAK活性比注射生理盐水(NS)组提高70％-120％。注射PAS组提高20％-90％,注射LBP组提高26％-80％。体外IL-2用量可分别降低75％、50％、50％。LBP注射老龄小鼠可显著促进脾细胞增殖外,LAK活性可提高120％-200％,体外IL-2用量可降低75％以上。     

瘤体内注射G—CSF基因诱导肿瘤细胞凋亡及局部病理分析

探讨瘤体内脂质体直接介导的Ｇ－ＣＳＦ基因治疗的抗肿瘤机制。方法：将脂质体包裹的Ｇ－ＣＳＦ基因直接注射结肠部瘤体内，通过流式细胞仪分析Ｇ－ＣＳＦ基因治疗后肿瘤细胞ＤＮＡ的变化，并对瘤体进行病理分析。结果：瘤体内注射脂质体包裹的Ｇ－ＣＳＦ基因后，可诱导结肠癌细胞凋亡；瘤体中有大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞和中性粒细胞为主。     

GPI-CD80融合蛋白的抗肿瘤作用研究

目的 研究GPI-CD80融合蛋白对肿瘤生长的抑制作用及其机制.方法 将纯化的GPI-CD80蛋白与HepG2细胞共培养后用丝裂霉素灭活,制成肿瘤疫苗.设单纯丝裂霉素灭活的HepG2细胞为对照疫苗.将两组疫苗与裸鼠脾淋巴细胞共培养,MTT法检测淋巴细胞增殖及细胞因子IL-2、IFN-γ量的变化;乳酸脱氢酶法检测CTL的活性变化;将两组疫苗接种于荷瘤裸鼠,测量裸鼠肿瘤体积的变化.结果 脾淋巴细胞经肿瘤疫苗刺激后,OD值、IL-2、IFN-γ的量和CTL的活性均高于对照疫苗组,差异有统计学意义;实验组荷瘤裸鼠平均肿瘤体积小于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义.结论 GPI-CD80融合蛋白能够抑制荷瘤裸鼠瘤体的生长速度,其机制可能与诱导T淋巴细胞增生、刺激细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌、增强CTL活性等有关.     

阳离子脂质体介导细胞因子基因对小鼠肝癌抑制的作用

目的观察阳离子脂质体介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因对小鼠肝癌的抑制作用。方法构建含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒载体,用阳离子脂质体ＬｉｐｏｆeｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导的含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒ＤＮＡ分别体外转染小鼠肝癌细胞株ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,并在荷瘤小鼠体内分别直接注射上述阳离子脂质体－ＤＮＡ复合物,观察瘤体大小及小鼠生存期。结果两种阳离子脂质体介导的细胞因子转染后都具有生物学活性,转染效率为１０％左右,瘤内注射后均能延长荷瘤小鼠的生存期。ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子的治疗效果较佳。结论ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因均具有抑制小鼠肝癌生长、延长荷瘤小鼠生存期的作用,ＤＯＳＰＥＲ的效果较好。     

肺癌患者外周血树突状细胞的体外扩增及生物学特性的观察

目的 从肺癌患者外周血诱导扩增的树突状细胞。观察其形态、表型、抗原递呈功能和对LAK细胞抗肿瘤作用的影响。方法 肺癌患者外周血单个核细胞经GM-CSF、IL-4诱导扩增成为树突状细胞,FACS检测其表型,MLR测定其抗原递呈能力及对LAK细胞增殖的影响。TAA冲击的DC与LAK细胞混合培养诱导的CTL,用MTT法测定其细胞毒,结果 肺癌患乾外周血诱导的树突状细胞具有典型的形态、表型特征和激发MLR的能力,TAA冲击的DC能显著地提高LAK细胞的增殖能力和增强对靶抗原细胞的细胞毒效应。结论 从肺癌患者外周血中可获得典型的树突状细胞,经TAA冲击的DC能从LAK细胞中诱导出特异性CTL细胞,以该DC为基础的疫苗联合LAK细胞,可能在肺癌生物治疗中发挥重要的作用。