甲胎蛋白促人肝癌Bel7402细胞增殖的机制研究

目的:观察甲胎蛋白促肿瘤细胞增殖的信号转导方式。方法:用从人脐带血清中提取的甲胎蛋白,作用于体外培养的人肝癌Bel7402细胞,运用MTT染色计数法,流式细胞仪测定细胞周期和3H-脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)参入法等指标检测细胞增殖状况;放射受体分析细胞膜上甲胎蛋白受体存在和数目;免疫结合法检测细胞内cAMP浓度;Westernblot分析P21ras蛋白的表达。结果:甲胎蛋白(10～80mg·L-1)作用24h后,人肝癌Bel7402细胞有不同程度的促增殖作用;在人肝癌Bel7402细胞膜上存在2种不同的解离平衡常数(Kd)的甲胎蛋白受体,Kd分别为Kd1=1.3×10-9mol·L-1(89400位点/细胞)和Kd2=9.9×10-8mol·L-1(582000位点/细胞)。AFP能显著提高Bel7402细胞内的cAMP浓度,对P21ras的表达也有明显的促进作用。甲胎蛋白的单克隆抗体能阻断这种作用。结论:甲胎蛋白具有促人肝癌Bel7402细胞增殖的作用,这种作用是由受体介导的cAMP信号转导途径实现的。     

甲胎蛋白新功能:调节HeLa细胞生长的信号转导机制

目的:观察甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)调节HeLa细胞生长的细胞内信号转导机制。方法:用从人脐带血中提取的AFP作用于体外培养的HeLa细胞,通过MTT计数、3H-TdR参入法、流式细胞仪等研究细胞增殖;放射免疫结合法检测在AFP作用下,HeLa细胞第二信使物质环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)活性的改变;用共聚焦显微镜观测细胞内Ca2+浓度的变化;用Westernblotting分析法分析P21ras表达。结果:①表明AFP(浓度大于10mg/L)对HeLa细胞增殖有明显的促进作用。②在AFP(20mg/L)作用下,PKA活性升高达122.6%,而Ca2+浓度升高达125.71%;P21ras蛋白表达在作用24h时增高112.6%。③抗甲胎蛋白单克隆抗体能有效地阻断AFP对HeLa细胞信号转导的影响。结论:①AFP能促HeLa细胞生长;②AFP可能通过cAMP-PKA和Ca2+途径调节HeLa细胞生长。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

pEGFP-C3-PENK/NIH3T3表达的脑啡肽对神经细胞PKA表达的影响

目的:观察pEGFP-C3-PENK/NIH3T3表达的脑啡肽对神经细胞疼痛模型兴奋性的抑制作用.方法:取 新生大鼠的皮质神经元细胞培养,以106mL-1的密度种植于培养皿中.细胞分为4组:对照组(神经细胞)、前列腺素刺激组(神经细胞+42 ng/L前列腺素)、脑啡肽组(神经细胞+42 ns/L前列腺素+pEGF-C3-PENK/NIH3T3细胞)和纳洛酮拮抗组(10 mmol/L钠洛酮+神经细胞+42 ng/L前列腺素+pEGF-C3-PENK/NIH3T3细胞).继续培养24 h后收集神经元细胞,提取总蛋白,采用Western blot测定各组神经元细胞中蛋白激酶A(PKA)的量.结果:4组细胞PKA的量比较,差异有统计学意义(F=59.873,P<0.001).与对照组相比,前列腺素刺激组PKA增多(P<0.05);与前列腺素刺激组相比,脑啡肽组PKA减少(P<0.05);与脑啡肽组相比,纳洛酮拮扰组PKA增多(P<0.05).结论:pEGFP-C3-PENK/NIH3T3表达的脑啡肽可以抑制神经细胞PKA系统的活化,其抑制作用可被纳洛酮拮抗.     

DJ-1L166P与DJ-1M26I基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的.     

互隔交链孢酚对NIH3T3细胞PKA-CREB信号通路的影响

目的：探讨互隔交链孢酚（Alternariol,AOH）对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中PKA-CREB信号通路的影响.方法：20μmol/L AOH作用NIH3T3细胞1 h,或用PKA特异性抑制剂10μmol/L H89预处理1 h,再进行20μmol/L AOH刺激实验,同时设溶剂对照组.用免疫荧光和免疫细胞化学染色法检测磷酸化PKA催化亚基表达情况,用免疫细胞化学染色法检测磷酸化CREB表达水平.结果：与溶剂对照组相比,AOH诱导NIH3T3细胞中磷酸化PKA催化亚基和磷酸化CREB水平明显增加（P〈0.05）;用PKA特异性抑制剂H89预处理,降低了AOH激活的PKA催化亚基和CREB的磷酸化水平.结论：AOH能够激活NIH3T3细胞中PKA-CREB信号转导通路,这为探讨AOH致癌的分子机制提供依据.     

体外观察维甲酸对NIH/3T_3细胞的抑制作用

目的　评价维甲酸 (RA)对NIH/3T3 细胞生长的影响。方法　体外观察 5种浓度RA对NIH/3T3 细胞生长的作用。结果　 5种浓度的RA均能抑制NIH/3T3 细胞的生长 ,且随着浓度的升高 ,RA抑制细胞增殖的作用增强。结论　RA能抑制NIH/3T3 细胞的增殖     

cAMP对胰岛素刺激的NIH3T3细胞丝裂原激活蛋白激酶活性的抑制作用

目的 探讨cAMP-PKA信号途径对胰岛素激活的Ras-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号途径的影响。方法 以3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)提高细胞内环腺苷酸(cAMP)浓度，藉四唑蓝比色法(MTT法)和蛋白免疫印迹试验分别观察cAMP对胰岛素刺激的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)的生长增殖和胞内丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)活性的影响。结果 IBMX(0．5mmol/L)抑制静息的和胰岛素(10mU／mL)刺激的NIH3T3细胞的增殖，作用呈时间依赖性。在胰岛素(10mU／mL)刺激的NIH3T3细胞，MAPK出现酪氨酸磷酸化；而以IBMX(0．5mmol/L)预处理细胞30min后，再以胰岛素作用10min，胰岛素刺激的MAPK的酪氨酸磷酸化受抑制。结论：cAMP可通过抑制MAPK磷酸化活化对NIH3T3细胞增殖起抑制作用。     

胃饥饿素通过cAMP/PKA通路对胰高血糖素样肽1促胰岛素分泌功能的影响

目的 探讨胃饥饿素(ghrelin)能否通过调控环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)通路竞争性抑制胰高血糖素样肽1(GLP-1)的促胰岛素分泌效应.方法 取8～10周龄雄性SD大鼠5只,分离、纯化大鼠胰岛,经双硫腙(DTZ)和吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色鉴定后,每只大鼠挑选60个胰岛,将其随机分成6组并接受不同处理:S0组(8.3 mmol/L葡萄糖溶液)、S1组(8.3 mmol/L葡萄糖溶液+10 nmol/L GLP-1)、S2组(8.3 mmol/L葡萄糖溶液+10nmol/L GLP-1+ 10 nmol/L ghrelin)、S3组[8.3mmol/L葡萄糖溶液+10 nmol/L GLP-1+10 nmol/L ghrelin+1 μmol/L生长激素促泌素受体1α(GHSR-1α)拮抗剂生长激素释放肽6(D-Lys3-GHRP-6)]、S4组(8.3mmol/L葡萄糖溶液+ 10 nmol/L GLP-1+ 10 nmol/L ghrelin+5 μmol/L腺苷酸环化酶激动剂毛喉素)、S5组(8.3mmol/L葡萄糖溶液+10 nmol/L GLP-1 +10 nmol/L ghrelin+ 10 μmol/L PKA激动剂6-Phe-cAMP);所有试剂均于前一试剂处理10 min后依次加入后一试剂共同处理,每组胰岛的所有处理时间共3h.采用ELISA法检测各组胰岛培养液中胰岛素和cAMP的浓度.结果 S组胰岛细胞分泌胰岛素和释放cAMP的浓度均高于S0组(P均＜0.05),S2组均低于S1组(P均＜0.05).S3、S4和S5组胰岛细胞分泌胰岛素和释放cAM的浓度均高于S2组(P均＜0.05).结论 Ghrelin能够抑制GLP-1的促胰岛素分泌效应,其作用机制可能是通过cAMP/PKA通路竞争性抑制GLP-1的促分泌效应.     

低浓度MNNG诱发非DNA损伤依赖的细胞信号通路

目的：研究基因组DNA损伤与细胞信号通路激活的关系以及低浓度N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)对细胞膜表面受体的影响。方珐：采用EUSA法来检测蛋白激酶A(PKA)的活性，不连续梯度密度离心法完成细胞脱核，以及免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察细胞表面受体聚集情况。结果：0．2μmol／L MNNG能在脱核细胞中引起PKA活性升高2．3倍，并可在5min内引起vero细胞表面生长因子受体和肿瘤坏死因子α受体的聚集；在脱核细胞中，表面受体聚集现象与在完整细胞中一样。结论：低浓度MNNG对PKA的激活和诱导细胞表面受体聚集均不依赖于基因组DNA的损伤，表明细胞信号转导通路的起源可能位于细胞膜或者细胞质中。     

甲胎蛋白对NIH3T3细胞和人肝癌Bel7402细胞增殖的促进作用

目的:观察甲胎蛋白对细胞增殖的影响。方法:用从人脐带血清中提取的甲胎蛋白,作用于体外培养的NIH3T3细胞和人肝癌Bel7402细胞,运用MTT染色计数法,细胞周期时相测定和3H脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)参入法等指标检测细胞增殖状况。结果:甲胎蛋白(10～80mg·L-1)作用24h后,对NIH3T3细胞、人肝癌Bel7402细胞均有不同程度的促增殖作用,甲胎蛋白的单克隆抗体能阻断这种作用。结论:甲胎蛋白是促进某些新生细胞或肿瘤细胞增殖的内源性物质。     

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

Effects of Panax notoginseng saponins on proliferation and differentiation in NIH3T3 cells

Objective:To investigate the effects of Panax notoginseng saponins(PNS)on the proliferation and differentiation in NIH3T3 cells.Methods:NIH3T3 cells were treated by various concentrations of PNS 0,0.05, 0.10,0.20,and 0.40 g/L.The vitality and proliferation potential of cells were detected by 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)assay,the alkaline phosphatase(ALP)activity was measured by p-nitrophenyl phosphate(pNPP)assay,and the mineralization formation ability was tested for the cellular differentiation toward osteoblast,as well as the expression level of phosphorylated extracellular signal-regulated kinasel/2(P-ERK1/2),extracellular signal-regulated kinasel/2(ERK1/2)protein kinase was analyzed by Western blot with total cell lysate of NIH3T3 cells treated by PNS.Results:Both MTT andρNPP assay showed that optical density(OD)values were increased in response to PNS treatment at a dose-dependent pattern. The mineralization formation ability was enhanced in PNS-treated NIH3T3 cells compared with untreated cells. Meanwhile,the expression level of P-ERK1/2 protein kinase was up-regulated in PNS-treated NIH3T3 cells, while,the expression level of ERK1/2 protein kinase revealed no obvious difference with or without PNS treated cells.Conclusion:PNS could pay a role to promote the proliferation and differentiation in NIH3T3 cells by means of up-regulation of P-ERK1/2 protein kinase.     

丙型肝炎病毒NS3不同末端在COS、NIH3T3细胞中的转录与表达

目的:建立丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的COS和NIH 3T3的细胞系表达系统,以探讨其慢性化及肝癌的发病机理.方法:用脂质体共转录法,将含有丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的重组质粒pSG 5 neo转录至COS和MH 3T3细胞系中表达,并用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和Southern blot法在DNA水平检测.用Western blot法在蛋白水平检测.结果:在转录的COS和MH 3T3的细胞系中,存在有丙型肝炎病毒NS 3在3和5基因片段,并可表达相应的抗原.结论:此表达细胞系的建立,有利于对丙型肝炎病毒的复制,丙型肝炎慢性化及肝癌发病的研究.     

哺乳动物细胞CDK3系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶3（CDK3）在哺乳动物细胞的表达载体,并在真核细胞NIH3T3中进行初步表达。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增CDK3编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK3片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;将获得的表达载体转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,并用蛋白免疫印迹法进行初步的CDK3表达分析。结果：PCR扩增获得约900 bp目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CDK3基因序列,全长915 bp;CDK3目的片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP载体,获得相应表达载体;运用构建的表达载体,可以在真核细胞中表达出CDK3蛋白。结论：成功构建了CDK3系列哺乳动物细胞表达载体,并在NIH3T3中得到表达。     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。