糖尿病大鼠皮肤组织表皮细胞增殖相关事件的研究

目的研究糖尿病大鼠皮肤组织中表皮细胞的增殖改变及其可能机制。方法12只SPF级SD大鼠随机分为糖尿病组(6只)和正常对照组(6只),糖尿病大鼠以STZ诱导。成模后8周,二组同时采集背部皮肤,观察表皮的组织学特征;流式细胞术检测表皮细胞的细胞周期;Westernblot检测细胞增殖调节因子cyclinD1、cyclinB1和cdk4的表达水平,并测定表皮细胞丝裂期促进因子(MPF)的组蛋白激酶活性。结果与正常组相比,糖尿病大鼠表皮结构欠清晰,部分表皮缺乏复层排列,表皮细胞数量明显减少,表皮层厚度明显变薄;S期和G2/M期表皮细胞百分比均显著降低(P<0.01,P<0.05);糖尿病组cdk4的表达水平显著低于正常组(P<0.05),两组间cyclinD1、cyclinB1表达无显著差异(P>0.05);糖尿病组表皮细胞MPF活性显著降低(P<0.01)。结论糖尿病大鼠皮肤表皮细胞处于明显增殖抑制状态,这种增殖抑制可能与cdk4的低表达和MPF活性下降有关。     

沉默Dnmt1基因对结肠癌细胞株HT-29细胞增殖及细胞周期的影响

目的 利用RNA干扰技术研究沉默DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)对结肠癌细胞株HT-29细胞增殖及细胞周期的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 利用LipofectamineTM 2000将Dnmt1 siRNA转染HT-29细胞,实验中将细胞分为3组:未处理组、对照siRNA组和Dnmt1 siRNA组.利用CCK-8试剂盒和流式细胞术分别研究其对HT-29细胞增殖和细胞周期的影响,进一步通过Real-time PCR和Western blotting技术研究与增殖和周期相关基因表达的变化.结果 与未处理组和对照siRNA组相比,Dnmt1 siRNA组中HT-29细胞的增殖受到明显的抑制(P<0.05).Dnmt1 siRNA组中HT-29细胞在G0/G1期的比率高达66.93%,高于未处理组和对照siRNA组中HT-29细胞在G0/G1期的比率(分别为53.45%和54.71%)(P<0.05).此外,与未处理组和对照siRNA组相比,Dnmt1 siRNA组中HT-29细胞的cdk2,cyclin D1和cyclin E基因的mRNA和蛋白的表达明显下调(P<0.05).结论 干扰Dnmt1能明显诱导HT-29细胞周期静止,其可能的机制与cdk2,cyclins D1和cyclin E基因的表达下调密切相关,操纵该基因有可能成为新的结肠癌的分子治疗靶点.     

p16,cyclin D1, cdk4基因在卵巢癌中的表达及其意义

目的探讨p16, cyclin D1, cdk4在卵巢癌中的表达及其意义.方法免疫组织化学检测p16, cyclin D1, cdk4蛋白在卵巢癌中的表达,原位杂交检测p16和cyclin D1在卵巢癌中的存在状况.结果 p16在卵巢癌中低表达,cyclin D1和cdk4过度表达;p16 与 cdk4呈负相关关系(P＜0.05),cyclin D1与cdk4呈正相关关系(P＜0.05).结论卵巢癌发生机制可能涉及p16, cyclin D1, cdk4调节环路中多个基因的异常,p16低表达和cyclin D1高表达一起在卵巢癌发生中起协同作用.     

鼻咽癌CNE-2细胞株胰岛素样生长因子-1受体和表皮生长因子受体沉默的放疗增敏机理

目的:评价RNA干扰(RNAi)同时沉默胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)和表皮生长因子受体(EG-FR)后生物学特性变化及对鼻咽癌CNE2细胞株放疗敏感性的改变。方法:构建荧光标记的靶向IGF-1R及EGFR信使RNA真核表达质粒,质粒转染鼻咽癌CNE2细胞株,共聚焦显微镜观察细胞转染结果,行平板克隆实验检测细胞存活分数;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;Western-blot法检测细胞周期相关蛋白cdk4/6,cyclin D1和c-myc。结果:成功构建真核表达质粒;siRNA-IGF-1R和EGFR组的细胞存活分数显著降低(P<0.05),与对照组相比,凋亡率显著增高(P<0.05),G0/G1期细胞比例明显增多,而S期和G2/M期细胞比例明显减少,细胞周期相关蛋白cdk4/6,cyclin D1和c-myc蛋白表达降低(P<0.05)。结论:RNA同时干扰沉默IGF-1R和EGFR可以引起鼻咽癌细胞周期蛋白表达降低,细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。     

晚期糖基化终产物与其受体相互作用对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响

目的 糖尿病患者结肠癌的发病率显著高于非糖尿病人群,晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)在糖尿病患者体内生成明显增多.文中观察AGEs对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及其机制.方法 体外培养人结肠癌细胞SW-480,以终浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的AGE-BSA处理细胞24h,并设正常对照组和BSA对照组进行比较.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测SW-480细胞活力,利用流式细胞术检测细胞周期的改变,实时荧光定量PCR测定晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)mRNA、细胞周期素D1(cyclin D1)mRNA的表达.结果 ①MTT结果示100μg/ml、200μg/ml、500μg/mlAGE-BSA作用SW-480细胞24h后可以显著促进细胞增殖(P<0.05),并呈浓度依赖性.②流式细胞术结果示200μg/mlAGE-BSA干预组24h后可以减少SW-480细胞G1期百分率,同时增加S期百分率,与正常对照组比较具有统计学差异(P<0.05).③实时荧光定量PCR结果示与正常对照组相比,200μg/mlAGE-BSA干预后可以上调RAGEmRNA和cyclin D1mRNA的表达(P<0.05).结论 AGEs能促进SW-480细胞的增殖,其机制可能与上调RAGEmRNA和cyclin D1mRNA的表达,加速细胞G1期向S期转换相关.     

外膜炎症及炎症因子与大鼠移植物动脉硬化早期发病关系

目的 探讨外膜炎症及血清炎症因子与移植物动脉硬化早期发病的关系.方法 把36只同种异体胸主动脉腹腔移植大鼠及16只同系移植对照大鼠随机分成4组(每组实验组9只,对照组4只):A组,术后1周处死;B组,术后2周处死;C组,术后3周处死;D组,术后4周处死.术前及处死时抽血分离留取血清,使用酶联免疫吸附法检测血清炎症因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)水平,处死后留取血管标本,HE染色观察血管外膜炎症细胞浸润程度及病理改变;用免疫组织化学法检测α-肌动蛋白(α-actin)、周期蛋白依赖性激酶1(cyclin dependent kinase-1,CDK1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在血管壁中的表达.对比各组与术前血清炎症因子水平变化及各组间观察指标的变化.结果 术后7 d,外膜大量炎症细胞浸润;术后14 d,外膜有轻度胶原纤维增生伴炎症浸润;术后28 d,外膜明显增厚,内有大量增生的平滑肌细胞、胶原纤维及炎症细胞,血管中层断裂,可见外膜平滑肌细胞迁移至内膜,内膜亦出现明显纤维化及平滑肌细胞增生.在血管外膜平滑肌细胞中,α-肌动蛋白、PCNA和CDK.表达愈来愈高(均P<0.05),且早于内膜.移植术后A、B、C、D组血清炎症介质水平均高于术前基础水平.IL-6水平,B实验组高于术前(P<0.05),A、C、D实验组显著高于术前(均P<0.01),A、B、C对照组也高于术前基础水平(均P<0.05);A、C、D实验组显著高于对照组(均P<0.01).TNF-α水平,A、B、C实验组高于术前(均P<0.05),D实验组显著高于术前(P<0.01),A、B、C、D对照组与术前无明显变化,各实验组均明显高于对照组(均P<0.01),差异有统计学意义.结论 大鼠同种异体胸主动脉移植模型建立后,随着外膜炎症加重,移植血管外膜及内膜出现明显动脉硬化;血清炎症介质水平呈持续升高,提示外膜炎症细胞浸润及炎症因子均参与移植物动脉硬化的早期发生.     

蒺藜总皂苷对缺血再灌注损伤大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响

目的 观察蒺藜总皂苷对大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响。方法 成年健康雄性SD大鼠25只,分为对照组,缺血再灌注组和蒺藜总皂苷组,建立视网膜缺血再灌注损伤模型。应用免疫印迹法检测细胞周期素D1(cyclin D1)和细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)的表达,采用流式细胞计数法检测细胞凋亡率。结果 与对照组比较,缺血再灌注组cyclin D1、CDK4表达升高,凋亡细胞增多(P<0.01);与缺血再灌注组比较,蒺藜总皂苷组cyclin D1、CDK4表达和凋亡细胞明显减少(P<0.05或0.01)。结论 蒺藜总皂苷对视网膜缺血再灌注损伤有拮抗作用,其机制可能与其调控细胞周期因子从而抑制细胞凋亡有关。     

EGF对真皮成纤维细胞中cyclinD1和CDK-4表达的影响

目的　探讨表皮生长因子 (EGF)对作为皮肤组织工程种子细胞之一的真皮成纤维细胞中 cyclin D1和 CDK- 4表达的影响 ,以从细胞周期探讨 EGF促进真皮成纤维细胞生长的机制 .方法　用含 10 0 m L· L- 1 胎牛血清的 DMEM,加入5 0 mg· L- 1的 EGF培养 SD大鼠的真皮成纤维细胞 ,通过MTT检测、流式细胞仪分析观察细胞的生长状态 ,免疫组化检测 cyclin D1和 CDK- 4的表达 ,结合流式细胞仪分析观察细胞的周期变化 .结果　 MTT检测、流式细胞仪结果都显示 5 0mg· L- 1 的 EGF能显著促进真皮成纤维细胞的生长增殖 ,免疫组化结果显示 ,二者一致 .结论　 5 0 mg· L- 1 的 EGF对真皮成纤维细胞的生长有极大的促进作用 ,促进了细胞周期蛋白 cyclin D1和 CDK- 4的表达 ,使细胞 G1期变短 .     

哮喘小鼠气道平滑肌细胞增殖及细胞周期蛋白D1表达的差异

目的:研究哮喘小鼠气道重建模型中气道平滑肌细胞(ASMC)的细胞增殖、细胞周期及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的变化,探讨cyclin D1对支气管哮喘气道重建中平滑肌细胞增殖过程及细胞周期的影响,进而为哮喘的诊断和治疗提供新的依据.方法:用Balb/c小鼠建立哮喘气道重建模型后进行ASMC原代培养,并以原代培养的正常小鼠ASMC为对照组,以四唑盐比色试验(MTF)检测细胞增殖能力,流式细胞术(FCM)测定细胞周期,FCM检测cyclin D1表达.结果:与对照组比较,哮喘组细胞的细胞增殖显著增快(P＜0.05);细胞周期中S期比例明显增高;cyclin D1在胞质中表达明显增加.结论:在哮喘气道重建过程中ASMC经历了一定程度的过增殖过程,cyclin D1的表达增加参与了细胞增殖,气道重建环境可刺激气道平滑肌细胞增殖能力.     

蛋白激酶在NIH3T3细胞中对促成熟因子的作用

目的:研究蛋白激酶C(PKC)在NIH 3T3细胞中,对G2/M期的关键调节因子促成熟因子(MPF)的调控作用,检测MPF两种亚基p34cdc2和cyclin B在翻译水平的改变.方法:用aphidicolin,流式细胞仪检测细胞周期同步化.Westem blot做蛋白表达水平的检测.结果:50 μmol/L的OAG使3T3细胞周期阻断在G2/M期.OAG对p34cdc2的表达没有影响,但可以使cyclin B的表达减少,对照组与处理组差异显著.结论:PKC激活剂OAG通过降低cyclin B的表达引起p34cdc2的活性改变而调节细胞周期.