Aβ1-42诱导U251细胞趋化因子RANTES的研究

目的 探讨β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)体外诱导人神经胶质瘤细胞(U251)细胞炎性反应的分子学机制. 方法 U251细胞经常规去血清培养,采用终浓度为0.2～4.0 μmol/L Aβ1-42处理U251细胞24 h,以四唑盐比色(MTT)法测定细胞存活率;2 μmol/L Aβ1-42处理U251细胞12、24、36、48 h后,采用硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)含量;采用双抗体夹心ELISA法测定细胞RANTES蛋白表达水平;免疫细胞化学染色法检测NF-κB和STAT1的表达.结果 随着Aβ1-42剂量的增加,细胞的存活率降低(P<0.05);用2 μmol/L Aβ1-42处理U251细胞12、24、36、48 h,结果显示NO的生成于24 h达高峰,此后逐渐下降;同浓度Aβ1-42处理U251细胞24 h后,RANTES的表达增加4倍(P<0.01);2 μmol/L Aβ1-42刺激U251细胞24 h后细胞内NF-κB P65和STAT1从胞浆移至胞核且表达明显. 结论 Aβ1-42降低体外培养的U251细胞存活率,诱导NO和RANTES的释放,提示Aβ1-42诱导的U251细胞趋化因子RANTES产生可能与NF-κB和STAT1的活化有关.     

胶质瘤细胞株U251,SHG-44,BT325中β-catenin的表达及其成瘤性分析

目的：探讨β-catenin在人神经胶质细胞株（HA）、人神经胶质瘤细胞株U251,SHG-44,BT325中的表达及其与恶性程度的相关性.方法：运用实时荧光定量PCR检测β-catenin在HA,U251,SHG-44,BT325细胞内的表达水平,并通过免疫荧光辅助分析β-catenin的表达及细胞内定位情况.建立裸鼠胶质瘤模型,观察肿瘤的生长.结果：β-catenin基因在人神经胶质瘤U251,SHG-44,BT325细胞株内的表达均高于HA细胞株,其中U251细胞表达最高,SHG-44细胞次之,而BT325细胞表达最低.在HA细胞株中,β-catenin蛋白主要在细胞膜表达,而在人神经胶质瘤U251,SHG-44,BT325细胞株中β-catenin蛋白表达出现了明显的胞质和胞核的易位表达.通过对荷瘤鼠模型的观察发现U251细胞所造肿瘤生长速度最快,SHG-44细胞次之,而BT325细胞的肿瘤生长速度最慢.结论：β-catenin基因表达与人神经胶质瘤U251,SHG-44,BT325细胞株恶性程度呈正相关.U251细胞表达β-catenin最高,更适合神经胶质细胞瘤Wnt/β-catenin信号传导通路相关研究.     

CD/5-FC自杀基因治疗系统体外杀伤恶性人脑胶质瘤细胞作用的研究

目的：探讨胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）自杀基因治疗系统对恶性人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法：采用Lipofectamine2000脂质体介导法将CD基因转染U251恶性人脑胶质瘤细胞，G418筛选获得抗性克隆（取名为U251/CD细胞），使用不同浓度的5-FC作用于U251/CD细胞，MTT法测定活性细胞比率。采用高效液相色谱法（HPLC）检测5-FC培养液内5-FU的浓度。结果：U251细胞获得了质粒的成功转染。基因转染使G418抗性细胞（U251/CD细胞）对5-FC高度敏感。未转染的U251细胞对5-FC不敏感，IC50 约为6 500 μmol/L，而转染基因后 IC50 约为10 μmol/L。并且加入不同浓度的5-FC后，U251/CD细胞培养液内均能检测到5-FU。结论：5-FC对CD基因修饰U251细胞具有杀伤作用；为胶质瘤基因治疗的在体研究提供依据。     

抑制泛素特异性蛋白酶9X表达对胶质瘤U251细胞生长及凋亡的影响

目的:研究抑制泛素特异性蛋白酶(USP)9X对胶质瘤U251细胞生长及凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法:CCK-8法检测抑制USP9X表达对U251细胞生长的影响,流式细胞术检测抑制USP9X对U251细胞凋亡的影响,Western Blot法检测USP9X对U251细胞蛋白水平的调控。结果:抑制USP9X表达对U251细胞生长有显著抑制作用;与对照组相比,实验组U251细胞凋亡率上升,实验组β-catenin蛋白的表达较对照组下调。结论:抑制USP9X表达可以抑制胶质瘤U251细胞的生长,促进细胞凋亡,抑制Wnt/β-catenin信号通路,是一个潜在的治疗胶质瘤的分子靶点。     

RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤U251细胞化疗敏感性的影响

目的:采用RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞化疗敏感性的影响。方法:设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blot检测Aurora A mRNA和蛋白表达情况,同时利用MTT试验和流式细胞仪检测在化疗药物尼莫司汀(ACNU)作用下转染Aurora A siRNA前后U251细胞增殖及凋亡情况的变化。结果:转染Aurora A siRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低。ACNU对转染Aurora A siRNA后U251细胞的增殖抑制作用明显增强(P<0.01),同时在ACNU作用下转染后U251细胞的凋亡率也显著增加(P<0.05)。结论:体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功的抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能提高胶质瘤细胞的化疗敏感性。     

Neurotoxicity of Amyloid β Protein Blocked by Free Radical Scavengers

自由基与许多中枢神经系统疾病包括脑缺血、脑肿瘤和阿尔兹海默病等的病因有关。阿尔兹海默病的一个重要的神经病理学特征是脑内淀粉样物质的沉积。该淀粉样物质的主要成分是由４０～４２个氨基酸所组成的多肽—淀粉样β蛋白（Ａβ）。离体和在体实验均显示Ａβ对神经细胞具有毒性作用，其具体的机制尚不十分清楚。最近部分国外研究报道自由基参与Ａβ的毒性作用。本实验结果表明Ａβ能够诱导人类成神经细胞瘤细胞系ＳＫＮＳＨ细胞发生凋亡，而最近发现的一种自由基清除剂褪黑激素和谷氨酸能够有效地阻止这一细胞凋亡过程。本实验证实自由基的确参与了Ａβ的神经毒性机制，并为临床治疗此类疾病提供了一条新途径     

去甲斑蝥素调节Hippo/YAP信号通路对U251胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响

目的 探究去甲斑蝥素（NCTD）对U251胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响及分子机制。方法 用不同浓度的NCTD处理U251细胞后,MTT法检测NCTD对U251细胞的细胞毒性。体外培养U251细胞,分为正常对照（NC）组、MST1/2抑制剂XMU-MP-1组（5μmol/L）、25μmol/L NCTD组、50μmol/L NCTD组、100μmol/L NCTD组、NCTD+XMU-MP-1组（100μmol/L NCTD+5μmol/L XMU-MP-1）。给予相应的干预后,细胞克隆形成实验检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力;Western blot检测Hippo/Yes相关蛋白（YAP）和Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路相关蛋白[哺乳动物Ste-20样激酶（MST）1/2、p-MST1/2、大型肿瘤抑制因子（LATS）1/2、p-LATS1/2、YAP、p-YAP、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、p-GSK-3β、β-catenin]的表达。结果 与NC组相比,25、50、100、200μmol/L N...     

丁苯酞对β淀粉样蛋白诱导的U87细胞自噬性死亡的影响

目的 观察丁苯酞对β淀粉样蛋白(Aβ1-42)处理后U87细胞自噬性死亡的影响.方法 方法将U87细胞分为Aβ组、Aβ+丁苯酞组和对照组(空白对照).Aβ组细胞用Aβ1-42(20 μmol/L)处理24 h;Aβ+丁苯酞组细胞用丁苯酞(10μmol/L)预处理0.5h后再加入Aβ1-42(20 μmol/L)处理24 h.采用MTT法测定细胞活力,检测Caspase 3活性,采用CM-H2 DCFDA检测胞内活性氧(ROS)水平,Western blotting检测LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达.结果 与对照组比较,Aβ组U87细胞活力显著下降(P＜0.01);Aβ+丁苯酞组U87细胞活力显著高于Aβ组(P＜0.05).对照组、Aβ组和Aβ+丁苯酞组之间Caspase 3活性的差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,Aβ组U87细胞ROS水平显著升高(P＜0.01);Aβ+丁苯酞组U87细胞ROS水平显著低于Aβ组(P＜0.01).与对照组比较,Aβ组U87细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高(P＜0.01);Aβ+丁苯酞组U87细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著低于Aβ组(P＜0.01).结论 丁苯酞通过抑制ROS介导的自噬性死亡发挥神经保护作用.     

MGMT介导的人脑胶质瘤耐药细胞系的建立

目的：建立由O^6-甲基鸟嘌呤－DNA甲基转移酶（MGMT）介导的人脑胶质瘤耐药细胞株U251／BCNU。方法：模拟卡氮芥（BCNU）的临床用药程序,采取恒定药物浓度、周期性使用的方式诱导U251的抗药性。检测U251／BCNU的耐药指数及MGMT mRNA的表达;比较U251及U251／BCNU细胞的体外增殖变化。结果：经过反复总共5次的用药过程,历时4个月,成功地建立了对BCNU具有稳定抗药性的U251／BCNU,其对BCNU的耐受程度约为U251的17倍。RT－PCR显示,U251／BCNU细胞有MGMTmRNA的表达。U251及U251／BCNU细胞的体外群体倍增时间差异无显著性。结论：在体外成功地建立了一株由MGMT介导的人脑胶质瘤耐药细胞系,为进一步探讨胶质瘤的耐药机制及逆转方式奠定了基础。     

Survivin反义寡核苷酸增强U251人胶质瘤细胞对顺铂的敏感性研究

目的研究Survivin反义寡核苷酸对U251人胶质瘤细胞顺铂治疗敏感性的影响。方法脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染U251人胶质瘤细胞，Western blot法检测内源性Survivin表达水平的变化，MTT法检测顺铂对细胞生长情况的影响，流式细胞仪（FCM）观察顺铂诱导各组U251细胞的凋亡。结果反义Survivin脂质体复合物能有效下调Survivin表达水平，并且能抑制U251细胞的生长，提高U251细胞对顺铂的敏感性。流式细胞仪检测凋亡率明显提高。结论Survivin反义寡核苷酸能增强顺铂诱导的U251细胞凋亡。Survivin反义寡核苷酸和顺铂联合用药对U251细胞生存具有协同抑制效应，可改善治疗效果。     

下调Pygo2抑制脑胶质瘤U251细胞增殖、侵袭及其cyclin D1的表达

目的构建RNA干扰(RNAi)重组体抑制Pygo2的表达,并探讨其对脑胶质瘤U251细胞增殖、侵袭的影响及其机制。方法针对Pygo2cDNA序列设计并合成一对特异性的含有短发卡的寡核苷酸序列及其阴性对照序列,经退火后插入pSuper中构建重组体。经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序后,用脂质体2000将其转染脑胶质瘤U251细胞,采用实时定量PCR和蛋白质印迹方法检测Pygo2shRNA对U251细胞Pygo2mRNA和蛋白表达的干扰效果,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期分布,BrdU掺入法检测DNA合成,Transwell检测细胞侵袭。采用蛋白质印迹和免疫荧光法检测Pygo2shRNA对U251细胞cyclin D1、β-catenin蛋白水平和亚细胞定位的影响。结果双酶切和测序鉴定证实插入序列完全正确;Pygo2shRNA显著抑制了U251细胞Pygo2mRNA和蛋白的表达;Pygo2shRNA抑制U251细胞Pygo2表达后,细胞增殖显著降低,细胞更多地阻滞在G1期,且BrdU掺入显著减少,侵袭细胞数显著减少。此外,抑制Pygo2表达可显著下调U251细胞cyclin D1的表达但不改变其亚细胞定位。U251细胞β-catenin表达及其亚细胞定位无明显改变。结论成功构建了抑制Pygo2表达的重组载体。抑制Pygo2表达能有效地抑制脑胶质瘤U251细胞DNA合成,可能通过下调Wnt信号靶基因cyclin D1的表达,使细胞阻滞于G1期而抑制细胞增殖和侵袭。     

HOXA4调控Wnt/β-cateni n信号通路对裸鼠移植胶质瘤的抑制作用

目的：建立人胶质瘤荷瘤裸鼠模型,探讨HOXA4对胶质瘤U251细胞体内生长的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及其机制。方法：采用慢病毒转染,建立胶质瘤U251细胞稳转同源异型盒基因A4（HOXA4） siRNA细胞系（si-HOXA4）和稳转空载体阴性对照U251细胞系（si-NC）。取对数生长期U251、si-NC和si-HOXA4细胞接种于BALB/c裸鼠颈背部皮下,建立荷瘤裸鼠模型,命名为对照组、si-NC组和si-HOXA4组。观察各组裸鼠成瘤情况并绘制肿瘤生长曲线;培养21 d处死裸鼠后剥离肿瘤组织,测量肿瘤体积和质量;qRT-PCR法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、CTNNB1和Gsk3β mRNA相对表达量;免疫组织化学（IHC）法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、β-catenin、Gsk3β、CyclinD1和P53蛋白表达水平。结果：si-HOXA4组裸鼠肿瘤体积和质量小于si-NC组和对照组（P<0.05）;si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中HOXA4 mRNA相对表达量和HOXA4蛋白表达水平低于其他2组（P<0.05）;与si-NC组和对照组比较,si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中CTNNB1 mRNA相对表达量降低（P<0.05）,β-catenin和CyclinD1蛋白表达水平亦降低（P<0.05）,但Gsk3β和P53蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：抑制人胶质瘤U251细胞HOXA4表达可在体内通过Wnt/β-catenin信号通路调控CyclinD1和P53蛋白的表达,从而抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长。     

脂肪间充质干细胞培养上清对脑胶质瘤细胞凋亡、侵袭的影响

目的:了解脂肪间充质干细胞(ASC)的培养上清的抗胶质瘤特性。方法:使用ASC培养上清培养胶质瘤细胞U251、U87,采用CCK-8检测ASC的培养上清抑制胶质瘤细胞U251、U87的增殖能力。利用流式细胞仪检测Annexin-Ⅴ的表达分析U251、U87在ASC上清诱导培养后的凋亡程度。划痕试验、Matrigel侵袭试验检测ASC的培养上清降低U251、U87侵袭的能力。结果:脂肪间充质干细胞能抑制胶质瘤U251、U87细胞的增殖,Annxin-V和PI的凋亡检测表明ASC-CM能诱导U251、U87细胞凋亡。划痕实验和Metrigel实验显示U251、U87细胞的迁移性降低和侵袭能力减弱。结论:脂肪间充质干细胞培养上清均能有效诱导胶质瘤U251、U87细胞的凋亡,并且均能降低胶质瘤细胞迁移及侵袭能力。我们的发现提示ASC培养上清有良好的抗肿瘤的特性,并可能用于未来的胶质瘤的治疗。     

siRNA沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响*

目的 探讨沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2（TNFAIP2）表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响。方法 使用Lipofectamine 2000介导siRNA转染胶质瘤细胞U87和U251下调TNFAIP2 mRNA的表达;运用细胞划痕及Transwell实验检测沉默TNFAIP2表达对U87及U251细胞迁移、侵袭的影响;通过CCK-8实验检测沉默TNFAIP2表达对胶质瘤细胞U87及U251增殖的影响。结果 Lipofectamine 2000介导si-TNFAIP2转染U87及U251细胞可下调TNFAIP2 mRNA的表达;沉默TNFAIP2表达可降低胶质瘤细胞U87和U251迁移侵袭的能力;沉默TNFAIP2表达可抑制U87及U251细胞的增殖。结论 siRNA沉默TNFAIP2表达可抑制胶质瘤细胞的侵袭和增殖。     

异芒果苷通过调节PTEN-PI3K-AKt-mTOR通路抑制恶性胶质瘤的恶性行为*

目的 探索异芒果苷对恶性胶质瘤细胞U251的抑制作用及可能机制。方法 常规培养U251细胞，以一定浓度梯度的异芒果苷与U251细胞共孵育，MTT法检测细胞增殖能力，平板克隆形成实验检测集落形成能力，Transwell小室迁移和侵袭实验检测纵向迁移能力，划痕实验检测横向迁移能力，western blot实验检测PTEN-PI3K-AKt-mTOR通路的变化，PTEN-siRNA予以验证。结果 与一定浓度梯度的异芒果苷共孵育后，MTT法检测发现U251细胞的增殖能力以时间依赖性和浓度依赖性下降，平板克隆形成实验检测发现U251细胞的集落形成能力浓度依赖性下降，Transwell小室迁移和侵袭实验检测发现U251细胞的纵向迁移和侵袭能力浓度依赖性下降，划痕实验发现U251细胞的横向迁移能力浓度依赖性下降，免疫印迹检测发现，PTEN表达呈浓度依赖性上调，而磷酸化的PI3K、磷酸化的AKt及磷酸化的mTOR呈浓度依赖性下降。PTEN-siRNA沉默PTEN可抵消异芒果苷的抑制作用。结论 异芒果苷可以抑制恶性胶质瘤U251细胞的恶性生物学行为，作用机制与调控PTEN-PI3K-AKt-mTOR通路有关。     

人类巨细胞病毒感染对U251细胞HOXB1基因表达的影响

目的：通过研究人神经胶质瘤U251细胞株的HOX基因表达状态及人类巨细胞病毒(HCMV)感染对U251细胞HOXBI基因表达的影响，以探讨HCMV致畸的可能机制。方法：应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术。结果：U251细胞表达HOXBI基因；HCMV感染后，U251细胞HOXBI基因表达明显上调；ATRA能显著上调HCMV感染后U251细胞HOXBI基因的表达。结论：HCMV感染能诱导U251细胞HOXBI基因表达上调，HCMV有可能通过调控HOXB基因表达异常引起胚胎发育畸形。     

胶质瘤U251细胞及其干细胞抗凋亡与多重耐药基因的关系

目的利用培养成功的U251胶质瘤干细胞,探讨其抗凋亡和耐药基因的表达差异。方法WST-8法检测胶质瘤干细胞增殖活性,实时荧光定量RT-PCR技术检测Livin、Livinα、Livinβ、Survivin和MRP1、MRP3 mRNA的表达。结果单层培养的U251细胞比胶质瘤干细胞表现出更强的增殖活性;U251胶质瘤干细胞Livin、Livinα、Livinβ、Survivin和MRP-1 mRNA表达量较U251单层培养细胞表达量都有不同程度的升高,而MRP-3 mRNA表达量降低。结论U251胶质瘤干细胞抗凋亡和MRP-1 mRNA表达量较U251单层培养细胞表达量有不同程度的升高,提示胶质瘤干细胞比较其同源的肿瘤细胞具有更强的耐药性,这可能是肿瘤耐药的机制。     

人类疱疹病毒6A亚型潜伏感染人神经胶质瘤细胞系U251

目的:采用人神经胶质瘤细胞系U251作为宿主建立HHV-6A亚型潜伏感染神经系统细胞的体外模型?方法:HHV-6A急性感染U251细胞后随细胞传代,通过观察细胞形态变化?病毒复制及检测病毒基因表达情况等确定其进入潜伏感染阶段?结果:HHV-6A在急性感染U251细胞后随传代数的增加,病毒基因拷贝量逐渐减低至稳定的低水平,而代表处于潜伏感染阶段的HHV-6A病毒U94基因的转录逐渐下降随后维持在稳定水平表达?结论:HHV-6A 在体外感染U251后通过传代使病毒从急性感染期逐渐转入潜伏感染期?     

DNA-PKcs介导多药耐药恶性胶质瘤细胞化疗抗性及分子机制

目的：观察DNA依赖的蛋白激酶的催化亚单位（DNA-PKcs）对多药耐药的恶性胶质瘤细胞化疗抗性的影响,探讨其介导化疗抗性的分子机制。方法：采用siRNA技术构建DNA-PKcs基因表达沉默的人胶质瘤U251细胞株;采用Western blotting法检测U251细胞（U251细胞）、多柔比星（ADM）耐药的U251细胞（U251/ADM细胞）和DNA-PKcs基因表达沉默的多柔比星耐药的U251细胞（U251/ADM/siDNA-PKcs细胞）中DNA-PKcs蛋白表达水平;采用CCK8法检测3组细胞增殖活性;采用Western blotting法检测3组细胞中多药耐药性1（MDR1）、报告基因质粒pNF-κB/p6、总Akt蛋白、pAkt/T308和pAKT/S473蛋白表达水平。结果：U251/ADM细胞DNA-PKcs蛋白表达水平明显高于U251细胞和U251/ADM/siDNA-PKcs细胞（P<0.01）;ADM、紫杉醇（PTX）和吉西他滨（GEM）对U251/ADM/siDNA-PKcs细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）值较U251/ADM细胞明显降低（P<0.01）;U251/ADM/SIDNA-PKcs细胞中pAKT/S473、pNF-κB/p65和MDR1蛋白表达水平均明显低于U251/ADM细胞（P<0.05）,而两者总Akt和pAkt/T308蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：DNA-PKcs能明显增强多重耐药的恶性胶质瘤细胞化疗抗性,其作用机制与pAKT/S473和pNF-κB/p65表达上调,诱导MDR1表达有关。     

银杏提取物(GBE)对人胶质瘤U251细胞增殖凋亡的影响

目的观察利用银杏提取物对人脑胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响。方法将传代的U251细胞随机分为四组,A组加培养液,B、C、D组分别加浓度为50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml的银杏叶提取物;观察倒置显微镜下TrypanBlue染色后各组U251脑胶质瘤细胞形态,用MTT法测算U251细胞增殖率,用流式细胞仪检测U251细胞凋亡率。结果 B、C、D组细胞增殖指数逐渐下降,与A组比较,P均<0.05;A、B、C、D组细胞凋亡率分别为0.3%±0.3%、10.6%±1.7%、21.9%±4.3%、33.5%±2.1%。B、C、D组与A组比较,P均<0.05。结论银杏叶(GBE)可抑制人脑胶质瘤U251细胞增殖,并诱导其凋亡。