假病毒技术在抗H5N1禽流感病毒中药筛选中的应用及评价

目的：建立基于假病毒技术的抗H5N1禽流感病毒中药筛选方法,利用血清药理学的方法系统评价攻下方、解毒方、凉血方和扶正方4类中药复方体外对H5N1禽流感病毒活性的影响及其机制。方法：构建整合H5N1禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白的假病毒,雄性Wistar大鼠25只灌胃不同中药制备复方中药血清。采用犬肾（Madin-Darby canine kidney,MDCK）细胞和人胚肾细胞293T为研究对象,将不同浓度药物血清分别与假病毒或靶细胞体外培养后,观察药物血清对假病毒活性的直接抑制作用,通过流式细胞术检测药物血清对H5N1禽流感病毒HA蛋白表达的影响。结果：HA蛋白特异性中和抗体2B4在50μL（抗体总量500μg）、25μL（抗体总量250μg）及12.5μL（抗体总量125μg）的剂量条件下均可以有效抑制假病毒的感染活性,从而证实利用假病毒技术筛选药物的方法的可行性。与对照血清相比,4种复方中药含药血清体外对假病毒均无明显抑制作用（P〉0.05）,也不能有效预防假病毒感染（P〉0.05）,不能抑制H5N1流感病毒HA蛋白的表达。结论：假病毒技术是一种安全、高效、精确的筛选抗H5N1禽流感病毒中药的方法;4类复方中药含药血清并不含有作用于H5N1假病毒HA蛋白及唾液酸α-2,3半乳糖苷受体的有效成分或单体。     

H274Y突变型H5N1流感病毒神经氨酸酶对奥司他韦的耐药机制研究

【目的】揭示H274Y突变型H5N1流感病毒神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）对奥司他韦（Oseltamivir,OTV）产生耐药的机制。【方法】利用BLAST序列比对工具和MOE软件的蛋白质结构比对模块,对野生型和突变型NA（PDB ID：3TI6和3CL0）的一级结构、二级结构、三级结构以及活性位点进行比对,在分子水平探讨H274Y突变型H5N1流感病毒NA对OTV产生耐药的机制。【结果】3CL0中S1区与OTV羧基形成氢键作用的残基由保守残基Arg292变为了非保守残基Asn347;在S2区增加了OTV与Ile222的疏水作用;由于受到突变后酪氨酸残基较大侧链对羟基苄基的空间位阻作用,3CL0中Glu276的空间形态发生较大变化,影响了活性位点S5疏水口袋的形成。【结论】3CL0活性位点S1区保守残基与OTV的氢键作用被非保守残基取代,S2区突变型NA与OTV之间的疏水作用增加,且突变残基的空间位阻影响了活性位点S5区疏水口袋的形成,均可能是造成H274Y突变型H5N1流感病毒NA对OTV耐药的重要原因。     

中国大陆H7N9禽流感病毒流行病学特征及血凝素和神经氨酸酶的分子进化

摘 要: 【目的】 对中国大陆人感染H7N9禽流感的流行病学特征进行描述分析,并对不同地区?不同时间?不同宿主来源的H7N9禽流感血凝素及神经氨酸酶基因进行分子进化分析,为H7N9禽流感的科学防控提供依据?【方法】 汇总各公开网站发布的人感染H7N9禽流感病例信息,分析人感染H7N9禽流感的流行病学特点;从Genbank筛选H7N9禽流感毒株的核酸序列及氨基酸序列,利用MEGE5.0?Bioedit等软件构建进化树,分析核苷酸及所编码蛋白关键位点的变异情况?【结果】全国共报告451例人感染H7N9禽流感病例,病死率为19.96%,男女性别比约为2.25:1; 60岁以上(含60岁)病例占全部病例的45.76%;浙江,广东,江苏,上海四省市报告病例较多;2013年4月前后和2014年1月至2月为两个发病高峰?进化树显示H7N9禽流感毒株分为美洲来源支和欧亚来源支,分离的时间地点越接近进化关系越近?自韩国2011年野鸟中分离的H7N9毒株的NA基因与中国2013年及2014年分离的H7N9毒株NA基因进化关系较近?广东第一例人H7N9禽流感的NA基因与2013年5月分离自山东环境中的H7N9禽流感的NA基因及2013年4月来自浙江人感染H7N9禽流感的NA基因的同源性较高?所有人感染H7N9毒株NA茎区69~73位缺失了QISNT序列?【结论】 老人及男性是感染H7N9禽流感的高危人群,冬春季是疫情高发期,病例集中分布于东南沿海地区?分子进化分析表明H7N9禽流感毒株有时间和空间的聚集性,时间空间距离越短则进化关系越接近?广东地区H7N9禽流感病毒可能是北方的候鸟迁徙所致,中国H7N9毒株NA片段可能来自韩国禽类携带的毒株?人感染H7N9禽流感病毒的毒力及耐药性尚未发生变异?NA茎区69~73位缺失QISNT序列可能与该病毒具有感染人类的能力有关?     

禽流感病毒H5N1基因突变对神经氨酸酶抑制剂敏感性和神经氨酸酶活性的影响

目的 研究感染人的禽流感病毒H5N1神经氨酸酶突变I117V,I314V,I117V+I314V对神经氨酸酶抑制剂(NAIs)敏感性和神经氨酸酶(NA)活性的影响.方法 定点突变技术将变异位点引入禽流感病毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)(VN1203)的NA基因中,以A/WSN/33(H1N1)为背景,通过反向遗传学方法构建重组流感病毒,鸡胚传代增殖病毒,荧光定量评估病毒对NAIs的敏感性和NA活性(IC50值和Km,Ki值).结果 与野生株VN1203相比,I117V使NA对奥司他韦敏感性降低(IC50值升高了17倍,Ki值升高了20倍),对扎那米韦敏感性无明显影响(IC50值升高了2倍,Ki值升高了3倍),NA活性降低(Km值升高了23倍).I314V对NAIs敏感性和NA活性均无明显影响.结论 初步结果认为NA突变I117V和I314V对感染人的禽流感病毒H5N1并不产生NAIs耐药,临床上仍然可以用奥司他韦或扎那米韦抗病毒治疗.     

甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化分析

【目的】 了解季节性H1N1流感病毒与2009年新型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化关系,探讨甲型H1N1流感病毒的遗传变异规律｡【方法】 分别从2006年和2009年流感病人标本中分离并鉴定出季节性HIN1流感病毒和新型H1N1流感病毒,用RT-PCR技术扩增了病毒NA基因全序列,并对其分子进化和重要功能位点的遗传变异进行了分析｡ 【结果】 2009年新型H1N1流感病毒与2006年季节性HIN1流感病毒比较,NA基因的同源性较低(77.9% ~ 78.8 %),与世界各地不同年代代表株及WHO推荐的1979 ~ 2010年季节性流感疫苗株比较,NA基因的同源性也较低(78.1% ~ 79.3%),但与WHO推荐的2009年新型H1N1流感疫苗株比较同源性则高达99%以上;系统进化分析结果表明,2009年新型H1N1流感病毒NA基因与欧亚猪流感病毒株A/swine/Belgium/1/1983的亲缘关系最近;并发现自2005年以来季节性H1N1流感病毒NA基因的某些抗原位点和神经氨酸酶活性位点已发生了变异｡【结论】 2009年新型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒;接种季节性流感疫苗不能对本次流行的新型流感产生有效的免疫保护作用;季节性H1N1流感病毒在流行过程中NA基因已发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测病毒的变异情况｡     

金刚烷胺和奥司他韦体外抗H5N1亚型禽流感病毒的作用

【目的】 观察体外单用金刚烷胺?奥司他韦及两药联合使用对两株H5N1亚型的禽流感病毒分离株(AIV127?AIV174)的抑制作用,了解广东地区分离的不同H5N1毒株之间药物敏感性的差异,为临床合理应用抗病毒药物提供科学依据?【方法】 建立体外H5N1感染模型,根据药物与病毒?细胞的不同作用,通过3种给药方式,使用细胞病变(CPE)?组织培养半数感染量(TCID50)评估抗病毒药物对H5N1的体外抑制作用? 【结果】 三种给药方式金刚烷胺联合奥司他韦,均比单用金刚烷胺体外抑制AIV127及AIV174效果明显(P < 0.01);而仅在治疗给药方式,两者联合比单用奥司他韦效果明显(P < 0.01)?三种给药方式金刚烷胺?奥司他韦及联合用药对同一亚型H5N1 AIV127比AIV174毒株均较敏感(P < 0.01)? 【结论】 抗病毒药物对不同的禽流感病毒毒株之间敏感性存在差异,应根据不同毒株给予相应的抗病毒治疗     

H10N8禽流感病毒血凝素中和抗体的结合位点鉴定

目的制备并筛选H10N8型禽流感病毒血凝素蛋白的中和抗体,并对其抗原结合位点进行鉴定。方法采用基因工程技术制备H10N8血凝素蛋白单克隆抗体,通过假病毒微量中和实验筛选中和抗体,ELISA和Western blot实验确定抗体结合血凝素蛋白的区域,Discovery Studio 3.5模拟与对接分析软件预测抗原结合位点,进而研究其在H10亚型内的保守性。结果获得1株具有假病毒中和活性的H10N8单克隆抗体,该抗体的结合表位在HA1上,且具有H10亚型内的保守性。结论成功制备1株中和抗体,为H10N8禽流感疫苗和单克隆药物的研究提供了基础。     

禽流感危机

禽流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)均易发生抗原漂移和抗原转换,可突变出快速感染人类并致病的亚型,特别是H5N1型具有从感染其他动物种属的流感病毒中获得基因并迅速转变的能力,威胁人类健康。世界候鸟的迁徙更使全球面临禽流感危急,本文就禽流感的病毒特征、感染机制及其防治和鸟类迁徙对禽流感传播的影响进行综述。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、糖基化位点变异情况。方法:从NCBI基因库检索获得43株不同年代不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA 4.0）软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析。结果:2009年新型甲型H1N1流感病毒与禽H5N1流感病毒NA基因的同源性达到85％,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点高度保守,但糖基化位点有变异。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒的NA基因可能来源于禽H5N1流感病毒;神经氨酸酶抑制剂治疗有效。     

2009H1N1流感病毒神经氨酸酶基因克隆与表达

目的制备2009H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)重组蛋白,为建立H1N1快速检测方法和神经氨酸酶抑制剂筛选模型奠定基础。方法采用MDCK细胞方法分离2009H1N1流感病毒,提取病毒RNA,RT-PCR生成NA基因,构建原核表达载体PET-102/D-TOPO-NA,IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳、WersternBlotting鉴定重组蛋白。结果成功分离2009H1N1流感病毒,NA蛋白119、152、275、292位氨基酸分别为Glu、Arg、His和Cys。SDS-PAGE凝胶电泳蛋白分子相对分子质量约为64000,与预期一致。WesternBlotting证实该蛋白具有神经氨酸酶抗原活性。结论 IPTG诱导原核表达神经氨酸蛋白的最适浓度为0.1mmol/L。实验得到的蛋白尚需进一步纯化。     

蜂房提取物对三种口腔常驻细菌产酸影响的体外研究

目的研究蜂房提取物对三种口腔常驻细菌产酸的影响。方法选用变形链球菌ATCC25175,血链球菌ATCC10556,粘性放线菌ATCC19246,测定蜂房四个化学组分的最低抑菌浓度MIC。再以低于MIC的4个浓度配制含药的TPY液体培养基,测定蜂房各化学组分对上述三种细菌产酸能力的影响,动态监测蜂房化学组分对变形链球菌产酸的影响。结果蜂房各化学组分对上述三种细菌的生长有一定的抑制作用,并且蜂房组分NVE1、NVE3、NVE4对变形链球菌、血液链球菌、粘性放线菌产酸均有显著的抑制作用。而蜂房组分NVE2对变形链球菌和血液链球菌的产酸未见明显的抑制作用,NVE2的高浓度组能够抑制粘性放线菌的产酸,动态pH监测显示,蜂房组分NVE1能够明显抑制变形链球菌的产酸,而NVE2则无此作用。结论蜂房各化学组分对三种口腔常驻细菌的产酸都有一定的抑制作用,其抑龋作用的物质基础及药理作用机制尚待进一步研究。     

中草药提取液对流感病毒诱导细胞凋亡的影响

探讨金银花、黄芩和连翘的提取液对甲3型流感病毒诱导狗肾传代细胞(MDCK细胞)凋亡的影响。方法采用金银花、黄芩和连翘3种中草药的提取液进行抗病毒试验,以细胞病变、姬姆萨染色在光镜下观察细胞形态学变化,Annexin V和PI双染用流式细胞仪测定细胞凋亡率,评价药物对甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡的影响。结果在MDCK细胞上甲3型流感病毒(血凝滴度为1∶64)的TCID50为0.65.100μL-1;实验浓度:金银花为1∶256(1.95g.L-1),黄芩为1∶64(7.81g.L-1),连翘为1∶64(7.81g.L-1)。在光镜下观察甲3型流感病毒对照组的MDCK细胞,可见被感染的MDCK细胞出现了细胞凋亡特有的形态学变化。Annexin V和PI双染经流式细胞仪测定显示3种药物实验组的细胞凋亡率[金银花(28.13±3.30)%、黄芩(13.47±3.04)%、连翘(19.17±6.55)%]均显著低于病毒对照组[(54.10±4.58)%](P<0.001)。结论 7.81g.L-1的黄芩及7.81g.L-1的连翘均能抑制100TCID50的甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡。1.95g.L-1的金银花不能够有效抑制100TCID50的甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡。     

白毛夏枯草提取液抗肝癌体内外实验研究

目的：观察白毛夏枯草提取物对肝癌细胞株HepG2的体外增殖抑制作用及对小鼠移植性肝癌H22实体瘤的体内抑制作用的影响。方法：（1）肝癌细胞增殖抑制观察：采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测药物,观察不同浓度的白毛夏枯草水提液对肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用;（2）小鼠腹水瘤抑制作用观察：小鼠接种H22腹水瘤后,造成移植性小鼠肝癌模型。随机分为阴性对照组（NS组）、阳性对照组（5-FU组）、白毛夏枯草水提物大剂量组、白毛夏枯草水提物小剂量组,分别观察荷瘤小鼠的抑瘤率。结果：（1）白毛夏枯草水提物对HepG2细胞有较强的抑制增殖作用,并呈一定的浓度依赖性。（2）白毛夏枯草水提物大剂量组、小剂量组对小鼠腹水瘤抑制率分别为37.84%、34.82%。结论：白毛夏枯草对肝癌细胞和小鼠腹水瘤有较好的抑制作用。     

中药体外抑制大肠杆菌实验研究

目的:探讨中药提取物对大肠杆菌的体外抑菌作用。方法:选用五倍子、白芷、金钗石斛、丁香、川芎、当归6种中药,采用醇提法和水提法提取其有效成分,并使用平板打孔法和二倍比稀释法测定中药提取物对大肠杆菌的抑菌效果。结果:五倍子和丁香的醇提取物和水提取物都有显著的抑菌效果,最小抑菌浓度分别为0.390 625 g·L~(-1)、0.781 25g·L~(-1),金叉石斛的醇提取物也有显著的抑菌效果,其最低抑菌浓度为6.25 g·L~(-1),而其他3种药物抑菌作用相对较弱。结论:6味中药对大肠杆菌均有不同程度的抑制作用,其中五倍子的作用最强,其次是丁香和金叉石斛,其他3种抑菌效果弱。     

李氏膈食散体外抗肿瘤实验研 究简

目的 研究李氏膈食散体外抗肿瘤作用.方法 采用水提和醇提的方法提取李氏膈食散的复方中的水溶和醇溶性成分.MTT法测定水提物和醇提物对肝癌细胞（HpeG-2）、胃癌细胞（MKN-45）、食道癌细胞（EC-109）的抑制作用.结果 两种提取物对三种肿瘤细胞株均有体外抗肿瘤作用,且以乙醇提取物效果更好.乙醇提取物对HpeG-2、MKN-45、EC-109三种肿瘤细胞株的半数抑制浓度分别为：622.89、173.41和210.17 μg/mL,最大抑制率在90％左右.结论 李氏膈食散提取物在体外具有抑制HpeG-2、MKN-45、EC-109生长的作用.     

12种中药的水及乙醇提取液对酪氨酸酶抑制作用的比较

[目的]比较12种常用美白中药70%乙醇提液与水提液对酪氨酸酶活性的抑制能力。[方法]利用受试物抑制蘑菇酪氨酸酶催化底物(L-多巴)发生反应从而减少黑色素生成的原理,以维生素C作标准对照,用分光光度计测定反应液在475 nm的吸光度,通过吸光度比较各受试物对酪氨酸酶活性的抑制能力。[结果]12种中药均对无细胞系蘑菇酪氨酸酶活性有不同程度的抑制作用,其中甘草等5种中药的70%乙醇提物对酪氨酸酶的抑制作用强于其水提物的抑制作用;桑叶等7种中药的水提物对酪氨酸酶的抑制作用强于其醇提物的抑制作用。[结论]通过对比常用美白中药的醇、水提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用,筛选天然物作为纯天然美白化妆品原料,拥有广阔的发展前景。     

人乳头瘤病毒假病毒体外感染模型的建立及人α防御素5抗病毒作用

目的建立用人乳头瘤病毒16亚型假病毒(HPV-16 Psv)感染宫颈癌细胞模型,并研究3种不同构型人α防御素5(HD-5)抗HPV的作用。方法将表达HPV-16假病毒衣壳蛋白的重组质粒P16L1L2和含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒Pfwb共转染293FT细胞,分离、纯化病毒颗粒后感染宫颈癌细胞株C-33a,同时分别给予20μg/ml的HD-5/N(天然构型)、HD-5/Acm(半胱氨酸被Acm修饰)或HD-5/Abu(半胱氨酸被Abu替换)处理,培养48 h后荧光显微镜观察和流式细胞分析病毒感染率。结果 Pfwb与P16L1L2成功转染293FT细胞并获得滴度达2.5×108TU/ml的HPV-16假病毒液,镜检和流式细胞术检测显示宫颈癌细胞C-33a能够被假病毒感染并表达GFP。HD-5/N、HD-5/Acm和HD-5/Abu对HPV-16感染C-33a细胞的抑制率分别为(96.48±5.67)%、(69.02±7.88)%和(2.71±1.53)%。与HD-5/N相比,HD-5/Acm和HD-5/Abu的抗病毒作用显著降低(P<0.01)。结论建立了基于流式细胞分析的HPV-16假病毒感染模型并将其用于抗病毒药物活性检测。发现HD-5的空间结构和分子中半胱氨酸对其抗HPV感染的活性有重要作用。     

红腺忍冬叶抗氧化作用的实验研究

[目的]研究红腺忍冬叶的抗氧化作用,为红腺忍冬叶的开发利用奠定一定的实验依据.[方法]时红腺忍冬叶不同溶剂提取物进行体内外抗氧化实验研究:(1)以Vc、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)为对照品,通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,-diphenyl-2-picrylhy drazyl,DPPH)法和铁离子还原法考察样品的体外抗氧化活性.(2)以Vc为阳性时照,由D-半乳糖至衰的小鼠为模型,通过测定血清、肝脏组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,考察样品的体内抗氧化活性.[结果](1)在0.5～2mg·mL-1范围内,水提液、50％乙醇提取液和95％乙醇提取液对DPPH自由基的清除效果与Vc无显著性差异或优于Vc,多与BHT尚有差距,三种提取液之间无显著性差异(P＞0.05);在0.1～5mg·mL-1范围内,三种提取液对Fe3+的还原能力随着浓度上升显著增强,但与Vc、BHT尚有差距,三种提取液之间无显著性差异(P＞0.05).(2)综合SOD结果:水提液高剂量组作用优于其他各药物组,且其血清SOD活力与Vc组无显著性差异(P＞0.05),肝脏中SOD活力只有该组与模型组比较有显著性效果.综合GSH-PX活性结果:除50％醇提高低剂量组外,其余各组均具有较好活性;其中水提液高剂量组在血清中的GSH-PX活性显著高于Vc组.综合MDA结果:水提液高低剂量组和50％、95％醇提高剂量组均具有较好的效果,而且这些组在血清和肝脏中的MDA含量与Vc组相比,降低无显著性差异(P＞0.05).[结论]红腺忍冬叶的不同溶剂提取物都具有一定的体内外抗氧化效果,特别是对提高GSH-PX活性和对MDA的清除效果较强.其中水提液抗氧化效果优于醇提物,值得深入研究.     

绵马贯众中间苯三酚类化合物抗H1N1流感病毒神经氨酸酶的活性成分筛选

目的研究绵马贯众中间苯三酚类化合物对H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)的抑制作用。方法通过检索建立了由34个间苯三酚类化合物组成的配体库,从Protein Data Bank中下载的Xray晶体三维结构文件,采用AutoDock Vina软件及LigPlot+软件筛选出与NA结合能较低且与NA形成氢链作用较强的分子;采用荧光法检测化合物对NA活性的作用。结果通过分子对接筛选出4个(绵马酸ABA、绵马酸ABB、绵马酸ABP、绵马贯众素ABBA)与NA有较好结合的化合物,并对这4个化合物进行活性验证,结果表明绵马贯众素ABBA对NA抑制作用最强,IC50值为(26.73±0.57)μmol/L。结论绵马贯众中绵马贯众素ABBA具有较好的抗H1N1流感病毒NA的作用,为开发新的抗流感病毒药物奠定了基础。     

不同温度处理后大蒜水提取液的抑菌效果研究

目的探讨浓度及温度对大蒜水提取液抑菌效果的影响。方法以无菌蒸馏水作为溶剂,制备大蒜水提取液,采用平板法,测量大蒜水提取液在不同浓度和不同温度时抑制几种细菌生长的抑菌圈直径,分析两种因素下的抑菌效果。结果不同浓度的大蒜水提取液抑菌效果不同,浓度越高,抑菌作用越强;质量百分比浓度6.3%及以上浓度的大蒜水提取液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型链球菌均有一定的抑制作用,抑制作用从强到弱依次为:金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>乙型链球菌>大肠埃希菌;温度对大蒜水提取液的抑菌效果有影响,随着温度的升高,大蒜水提取液的抑菌作用逐渐减弱。在80℃及以上温度时,大蒜水提取液只对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌显示出较强的抑制作用。结论大蒜水提取液体外的抑菌效果在不同浓度与不同温度时均存在差异。