人源性抗核抗体Fab片段的筛选及鉴定

目的:制备人源性抗核抗体Fab片段.方法:通过4轮淘筛,富集已构建的人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab片段噬菌体抗体;提取阳性克隆的噬菌粒DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-Blue,以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段;应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达上清进行鉴定.结果:第4轮洗脱的噬菌体滴度较第1轮增加200条倍,从抗核抗体Fab片段噬菌体库中筛选出2株阳性克隆,切除gⅢ基因后自连的噬菌粒DNA经XhoⅠ单酶切证实连接成功.间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性抗核抗体Fab片段均呈现抗dsDNA阳性,具有抗原特异性;免疫荧光法结果显示:Hep2细胞和猴肝脏组织细胞核显示均质型荧光,绿蝇短膜虫的动基体显示均质型荧光.结论:成功制备具有抗原特异性的可溶性、人源性抗核抗体Fab片段,为高亲和力抗核抗体Fab片段的制备奠定了基础.     

噬菌体抗体库的构建及抗肝癌抗体的初步筛选

目的　通过肝癌细胞林 Bel74 0 4 分次免疫 BAL B/ C小鼠后提取脾细胞总 RNA。　方法　采用 RT- PCR的方法扩增免疫球蛋白的 κ链和 Fd段基因 ,择取噬首粒基因克隆区的酶切位点 Xba +Sac 和 Spe +Xho ,使用定向克隆的方法 ,将 κ链和 Fd段基因克隆到原核表达载体噬菌粒p COMB3H- SS中 ,通过噬菌体表面表达技术构建抗人肝癌的噬菌体抗体库。以 Bel74 0 4 活细胞为抗原对该库进行 4轮“吸附 -洗脱 -扩增”的亲和筛选 ,测定噬菌体回收比例并对抗体库进行鉴定。挑取部分含 Fab基因的克隆 ,用内切酶 Spe +Neh 除去基因 后自连环化 ,制备可溶性抗体 Fab分子 ,以 EL ISA法检测与 Bel74 0 4 细胞的结合活性。　结果　共提取脾细胞总 RNA80 0 μg,经 PCR增后 ,先后将 κ链和 Fd段基因克隆到噬菌粒 p COMR3H- SS中 ,建成容量为 2× 10 6CFU的噬菌体抗体库 ,在 4轮的亲和筛选过程。虽然洗涤次数增加 ,但噬菌体的回收比率逐轮提高 ,4轮分别为 (6 .5×10 - 7) % ,(5 .7× 10 - 6 ) % ,(7.5× 10 - 5) %和 (1.6× 10 - 4) % ) ,共增加 2 4 5倍。在洗脱下来的噬菌体中含 Fab基因的克隆比率 ,也得到明显提高 ,即由筛选前的 2 5 %增至 83%。酶切鉴定显示 ,含 Fab基因的载体可分别被限制性核酸内切酶Xba +Sac 和 Spe +Xho     

噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库的构建

目的构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,研究IgA结合分子结构与功能的关系。方法基因合成IgA亲和体ZA1、ZA2片段。片段两端引入Kpn I酶切位点,3′端引入随机连接肽序列,Kpn I酶切,随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S的Kpn I克隆位点上,转化大肠杆菌TGI,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示随机组合文库。结果基因合成IgA亲和体;构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,容量为3·4×107,滴度为1·6×1012TU/L;文库中含79%以上的阳性克隆;序列分析显示组合文库由ZA1、ZA2随机组合而成,连接方式符合随机连接的特点,各亲和体之间连接肽序列也呈随机分布。结论合成IgA亲和体,构建噬菌体展示IgA亲和体随机组合文库,该文库库容量、多样性和随机性可满足体外分子进化研究的要求。     

A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库的构建

目的　构建A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库。　方法　利用全套噬菌体抗体表面展示技术 ,从A型流感病毒核蛋白免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA ,利用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体重、轻链基因的扩增。经重叠延伸反应 ,在体外随机装配成单链抗体。将其克隆到噬菌粒载体PCANTAB5E中 ,电转化TG1细菌 ,以辅助噬菌体M13 K0 7超感染噬菌体文库 ,构建全套ScFv抗体库。　结果　成功利用噬菌体表面展示技术 ,构建了A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,库容量达到 8 2× 10 7。　结论　构建全套A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,为利用亲和富集筛选技术 ,获得具有A型流感病毒核蛋白结合活性的完整重组噬菌体克隆奠定了基础。     

多药耐药性肿瘤细胞相关噬菌体抗体库的构建

利用噬菌体抗体库技术 ,构建了多药耐药性肿瘤细胞相关噬菌体抗体库。以多药耐药性肿瘤细胞 KB- A1为免疫原免疫 Bal B/c小鼠 ,从其脾脏提取总 RNA,并分离出 m RNA。RT- PCR扩增出 VH 和 VL 基因 ,经重叠延伸反应组装成单链抗体 ( Sc Fv)。将其克隆入噬菌粒载体p CANTAB 5 E中 ,电转化 E. coli TG1 ,成功构建了库容为 0 .8× 1 0 6的噬菌体抗体库 ,为获得多药耐药性相关分子及肿瘤细胞特异的噬菌体抗体奠定了基础     

HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建

目的 :为了探讨噬菌体展示技术在筛选和鉴定病毒抗原表位研究中的应用前景。 方法 :利用随机引物 PCR法以HCV核心基因为模板合成随机 DNA片段 ,再经特定引物二次扩增后获得高丰度的 HCV核心蛋白随机 DNA片段 ,将该片段插入噬菌粒载体 p CANTAB5 X的 Xba 位点 ,转化大肠杆菌 TG1,辅助噬菌体拯救 ,建立噬菌体随机肽展示文库。结果 :所构建的随机文库含 1.2 3× 10 5个不同克隆 ,库容噬菌体滴度为 2× 10 1 2 TU/ m l(转导单位 / ml) ,PCR法检测插入阳性为 2 8.1% ,核酸杂交证实 40 %的克隆为 HCV核心基因阳性克隆。 结论 :所建的随机文库有足够大的库容和较好的多样性 ,可以满足HCV C抗原表位的筛选。     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库.方法 利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库.由Linker-primer mix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体.再用RS primer mix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因.以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库.结果 成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库.经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011 pfu.结论 rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础.     

钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建

目的　应用噬菌体展示技术构建钠泵抑制物单链抗体库 .方法　用 OUA- OVA(ouabain- ovalbumin)免疫小鼠 ,取脾脏 ,分离淋巴细胞 ,提取 m RNA,逆转录成 c DNA第一链 ,用简并引物经 PCR分别扩增轻、重链抗体库 ,经重叠延伸PCR由 L inker将轻、重链拼接成 Sc Fv(单链抗体 ) ,用 RS引物以 Sc Fv为模板进行第 2次 PCR,同时在 5 及 3 端分别加上 Sfi I,N ot I酶切位点 .经 Sfi I,N ot I酶切后 ,在 T4连接酶的作用下将 Sc Fv与 p CANTAB 5 E噬菌粒连接 ,电转化进入TG1大肠杆菌 ,挑取 12个单菌落提取质粒用 Eco R 和 H ind 进行酶切鉴定 ,后经 M13KO7辅助噬菌体拯救 ,离心收集上清即为全套 Sc Fv基因的噬菌体表面展示文库 .结果　以OU A- OVA免疫小鼠 ,检测血清中抗体效价可达 (1∶ 2×10 6 ) ,用通用引物分别扩增出轻、重链片段的大小为 32 5 bp和 34 0 bp,将两者拼接得到约 72 0 bp大小的单链抗体库 ,以8× 10 1 1 的转化效率转染 TG1细胞 ,Eco R 和 H ind 酶切后 ,12个单菌落所提噬菌粒 DNA中有 10个切出了约为 2 .1kb的目的条带 ,所构建的噬菌体抗体库库容量约为 1.2× 10 8.经 M13KO7超感染后 ,测噬斑滴度为 9× 10 1 4 pfu· L- 1 .结论　成功地构建了钠泵抑制物噬菌体单链抗体库 .     

随机十肽库的构建及血管形成素结合肽的筛选

将合成的含有随机序列 (NNK) 1 0 的寡核苷酸片段 ,克隆入噬菌体呈现载体噬菌粒 p CANTAB5 E的 Sfi ,N ot 位点 ,即 cp 蛋白信号肽与成熟肽之间 ,电转化 E.coli TG1,构建了噬菌体表面呈现的十肽库 ,实际库容为 3.5 3× 10 7,插入率为 6 6 .7% .经辅助噬菌体 M13KO7超感染后 ,获得滴度为 4.8× 10 1 1 pfu/ m l的噬菌体上清 .经过两轮 panning筛选和富集 ,从构建的随机十肽库中筛选到 2 6个具有血管形成素结合活性的重组噬菌体克隆 ,对其中 12个阳性噬菌体克隆的短肽序列进行了分析 ,EL ISA检测结果显示 12个阳性噬菌体克隆都能够…     

用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。     

人源性大肠癌自然致敏噬菌体抗体Fab呈现库的构建与筛选

目的 构建大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Ｆab段噬菌体呈现库,初步筛选相关抗大肠癌抗体。方法取大肠癌病 人转移淋巴结,提取淋巴结总ＲＮＡ,逆转录ＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和Ｋ轻链ｃＤＮＡ。依次将ＰＣＲ产物插入载体pＣomb３的 相应部位,构建人源性大肠癌噬菌体Ｆab基因库,并应用噬菌体表面呈现技术对该抗体库进行淘选及鉴定。结果所选 ２种Ig亚类的重链 Ｆd片段、２种κ轻链cＤＮＡ得到扩增。 Ｆd片段和κ轻链均插入pＣomb３的重组率为４０％,Ｆab噬菌 体表达库容达１．４８×１０６。经３轮淘选,抗体库得到约１２０倍的富集。３轮抗体库的点印记免疫染色均显示有Ｆab表达;酶 联免疫吸附实验显示其与大肠癌抗原有结合活性。结论成功构建了大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Ｆab段噬菌体呈 现库,利用噬菌体抗体库技术,可筛选相关抗大肠癌抗体。     

SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity

Objective To develop a specific SARS virus-targeted antibody preparation for emergent prophylaxis and treatment of SARS virus infection. Methods By using phage display technology, we constructed a naive antibody library from convalescent SARS patient lymphocytes. To obtain the neutralizing antibody to SARS virus surface proteins, the library panning procedure was performed on purified SARS virions and the specific Fab antibody clones were enriched by four rounds of repeated panning procedure and screened by highthroughput selection. The selected Fab antibodies expressed in the periplasma of E. coli were soluble and further purified and tested for their binding properties and antiviral function to SARS virus. The functional Fab antibodies were converted to full human IgG antibodies with recombinant baculovirus/insect cell systems and their neutralizing activities were further determined. Results After four rounds of the panning, a number of SARS-CoV virus-targeted human recombinant Fab antibodies were isolated from the SARS patient antibody library. Most of these were identified to recognize both natural and recombinant SARS spike （S） proteins, two Fab antibodies were specific for the virus membrane （M） protein, only one bound to SARS-CoV nucleocapsid protein. The SARS-CoV S and M protein-targeted Fab or IgG antibodies showed significant neutralizing activities in cytopathic effect （CPE） inhibition neutralization test, these antibodies were able to completely neutralize the SARS virus and protect the Vero cells from CPE after virus infection. However, the N protein-targeted Fab or IgG antibodies failed to neutralize the virus. In addition, the SARS N protein-targeted human Fab antibody reacted with the denatured N proteins, whereas none of the S and M protein specific neutralizing antibodies did. These results suggested that the S and M protein-specific neutralizing antibodies could recognize conformational epitopes which might be involved in the binding of virions to cellular receptors and the fusion activity of the virus Conclusion The SARS-CoV spike protein and membrane proteins are able to elicite efficient neutralizing antibodies in SARS patients. The neutralizing antibodies we generated in this study may be more promising candidates for prophylaxis and treatment of SARS infection.     

大肠癌相关抗体Fab段噬菌体呈现库的表达和活性鉴定

OBJECTIVE: To express the original human Fab antibody phage display library with positive recombined bacterium XL1-blue-Pcomb3 and identify its specific binding activity with colorectal cancer cells in vitro after screening with human colorectal cancer-related antigens. METHOD: The recombination rate of Fd fragment of the heavy chain and insertion of kappa chain of the antibodies was determined with PCR, and the original Fab library was expressed. The antigens were extracted from 3 sensitized colorectal cancer tissues previously used for construction of the original Fab library and from 13 non-sensitized colorectal cancer tissues, along with the antigens from LoVo, HT-29 and LS-174T cells cultured in vitro. The original Fab antibody library was screened with the 3 groups of mixed antigens derived in preceding procedure and 3 tertiary Fab antibody libraries were obtained, which were then mixed in equal volume for subsequent tests of binding activity with human colorectal cancer tissues and cells in vitro using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunohistochemical staining. Specimens of gastric and esophageal carcinomas and normal intestinal mucosa, together with liver cancer cells and gastric cancer cells were utilized as control. RESULT: The recombination rate of Fd and kappa chain were 40 % and 70 % respectively, and the rate of their simultaneous insertion into Pcomb3 vector was 28%. The capacity of library for Fab fragment genes was 2.1x10(6), and the original antibody libraries screened with the 3 groups of mixed antigens were enriched to varied degrees, which all displayed relatively specific binding activity with human colorectal cancer tissue and cells in vitro. CONCLUSION: Colorectal cancer-related antibody Fab fragments are obtained through screening phage display library, which show relatively specific binding activity with human colorectal cancer tissues and cells.     

人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选

目的：构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体（scFv）库,筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）特异性scFv,为HER2和CXC趋化因子受体4（CXCR4）双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列。 方法：取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA;构建可变区基因的T载体库,将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与pCANTAB连接肽连接,获得pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌TG1;以M13K07辅助噬菌体进行感染,获噬菌体抗体库;利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测筛选后获得的噬菌体抗体活性,以免疫组织化学法检测抗体亲和力,并通过测序进一步鉴定。 结果：成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库,获得的scFv长度为750 bp,VH和VL长度分别为375和330 kb;电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确,得到库容为2.48×108的大容量抗体库;通过噬菌体展示和淘洗筛选,富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库;所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性,对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力;测序结果与人IgG抗体进行对比,所获得的scFv具有高度的人源性。 结论：主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库,并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv,为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体。     

人源噬菌体抗体库中血管内皮细胞生长因子抗体的筛选及活性 …

目的 从人噬菌体Ｆａｂ抗体库中选抗人血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）抗体克隆,并对其特异性及活性进行分析,为后续工作奠定基础。方法 从不同人群外周血淋巴细胞提取总ＲＮＡ,经逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）分别扩增轻、重链抗体Ｆａｂ段,用噬菌体表面呈递技术构建抗体库,经过４轮固相筛选及单克隆差异筛选,获得能结合ＶＥＧＦ的抗体克隆。在此基础上通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和＾３Ｈ－ＴｄＲ     

正常人天然IgG抗体噬菌体呈现库的构建

目的 建立一个正常人天然ＩｇＧ抗体委员长 菌体呈现库。方法：从一献血员取５０ｍＬ新鲜血液,分离淋巴细胞。提取ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和轻链ｃＤＮＡ,依次将ＰＣＲ产物插入载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ相应位点。以点印迹检测噬菌体表面Ｆａｂ的表达,结果 所有４个ＩｇＧ亚类的重链Ｆｄ片段、部分κ轻链和λ轻链ｃＤＮＡ得到扩增。先期插入的重链Ｆｄ的实际库容达１．１×１０＾６,插入率２０％。后期插入的     

大肠癌噬菌体展示肽库的构建及大肠癌早期检测分子的筛选

目的构建大肠癌噬菌体展示肽库,筛选用于大肠癌早期检测的分子标志。方法选取30例第二军医大学长海医院肛肠外科手术后立刻冻存的大肠癌组织标本构建T7噬菌体展示肽库;用结合protein-A/G的琼脂糖珠分别富集大肠癌组及非肿瘤对照组血清中的抗体进行5轮亲和筛选,富集大肠癌相关肽;随机挑取5轮筛选后的2000个噬菌体克隆,用ELISA方法进一步筛选与大肠癌患者血清和对照血清反应性存在差异的大肠癌相关标志物克隆,进行基因序列测定。应用通过Chilibot文献挖掘方法预测各克隆的蛋白功能,反证筛选结果。结果 (1)所建大肠癌噬菌体展示肽库的滴度为3.0×106pfu,经PCR鉴定其重组率为60%,库容为1.8×106pfu。(2)共筛选出18个有意义的噬菌体,测序后,预测其蛋白功能,其中12个与肿瘤的发生相关。结论应用ELISA对肿瘤重组抗原的噬菌体展示肽库进行筛选的方法 ,可以用来发现差异表达的抗原。所筛选出的噬菌体克隆所表达的抗原可用于早期筛检大肠癌。     

噬菌体抗体库技术构建HPV16 E7人源化单克隆抗体

目的：构建抗ＨＰＶ１６Ｅ７的噬菌体抗体库。方法：由感染者抗凝血中分离外周淋巴细胞，提取细胞总ＲＮＡ，以逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ），用人ＩｇＧ　Ｆａｂ基因特异引物，从合成的ｃＤＮＡ中分别扩增出抗体轻链和重链可变区基因，回收纯化ＰＣＲ产物。用ＳｐｅＩ＋ＸｈｏＩ酶切重链可变区基因，ＸｂａＩ＋ＳａｃＩ酶切轻链可变区基因，先后克隆入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３。结果：ＰＣＲ产物经电泳证实分子量大小正确，酶切电泳证实质粒构建正确。结论：成功构建抗体轻链和重链基因克隆，建立抗ＨＰＶ１６Ｅ７噬菌体抗体库。     

抗人卵巢癌单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定

目的：构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现库。方法：利用噬菌体表面呈现技术，构建基因库。经过panning筛选富集后，用ELISA方法检验抗原结合活性。结果：从单个噬菌体克隆中筛选到26个具有抗原结合活性的阳性克隆。结论：噬菌体表面呈现技术为构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现库提供了一条更为有效的新途径。     

肺癌噬菌体展示肽库的构建及肺癌早期检测分子标志的筛选

目的:构建肺癌噬菌体展示肽库,筛选出肺癌早期检测的分子标志群.方珐:取30例第二军医大学长海医院手术后立即冻存的肺癌组织标本构建肺癌噬菌体展示肽库;用结合protein-A/G的琼脂糖珠分别富集肺癌组及非肿瘤对照组血浆中的抗体进行5轮亲和筛选,富集肺癌特异性的相关肽;随机挑取5轮筛选后的500个噬菌体克隆.用ELISA法进一步筛选肺癌/4照D比值大于2.0的肺癌特异标志物克隆.进行基因序列测定和蛋白功能预测.结果:(1)该噬菌体展示肽库的滴度为3.0×106pfu,库容9.0×106pfu,随机挑选20个噬菌斑经PCR鉴定其重组率为60%.(2)共筛选出19个有意义的噬菌体,测序后,预测其蛋白质功能.9个与癌症相关,8个功能未知,2个与癌症不相关.结论:筛选出的噬菌体克隆所表达的抗原很可能是早期诊断肺癌的标志物.