鹿茸多肽对IL-1β诱导的大鼠软骨终板细胞增殖和Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、IL-6mRNA表达的影响

目的:观察不同浓度的鹿茸多肽对IL~(-1)β诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞增殖和Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,CollagenⅠ)、CollagenⅡ、白细胞介素(interleukin-6,IL-6) mRNA表达的影响。方法:选取健康SD大鼠(1个月龄),取其脊柱椎间盘软骨终板细胞,并培养至第3代软骨终板细胞进行实验。空白对照组不做任何处理,诱导组只加入10μg·L~(-1)的IL~(-1)β,给药组在培养基中加入10μg·L~(-1)的IL~(-1)β和不同质量浓度的鹿茸多肽(分别为10 mg·L~(-1)、30 mg·L~(-1)、50 mg·L~(-1))。用MTT比色法检测3个时间点(24 h、48 h、72 h)各组椎间盘软骨终板细胞的增殖情况; qP CR法检测CollagenⅠ、CollagenⅡ及IL-6 mRNA的表达。结果:MTT法检测结果:鹿茸多肽10 mg·L~(-1)组的软骨终板细胞增殖与诱导组比较,差异无统计学意义(P 0. 05);鹿茸多肽30 mg·L~(-1)组和鹿茸多肽50 mg·L~(-1)组能促进软骨终板细胞的增殖,与诱导组比较,差异有统计学意义(P 0. 05,P 0. 01)。qP CR检测结果:IL~(-1)β诱导组的CollagenⅡmRNA的表达降低,CollagenⅠ、CollagenⅡ、IL-6的mRNA的表达升高,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P 0. 05);不同质量浓度的鹿茸多肽均能增强CollagenⅡmRNA的表达,降低CollagenⅠ和IL-6 mRNA的表达,差异均有统计学意义(P 0. 05,P 0. 01),30 mg·L~(-1)、50 mg·L~(-1)鹿茸多肽效果更加显著(P 0. 01)。结论:一定浓度的鹿茸多肽能减轻IL~(-1)β对软骨终板细胞增殖的抑制,升高CollagenⅡmRNA的表达,降低CollaoenⅠ、IL-6 mRNA的表达,从而延缓椎间盘的退变。     

经颅二维彩色多普勒超声在颅外段颈动脉内膜剥除术和支架成形术前后的应用价值

目的:研究胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞的影响.方法:利用机械与酶消化的方法获得均一性的兔关节软骨细胞,在单层培养条件下增殖至P2代;将P2代细胞高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质,进行三维培养,另一组在进行三维培养的同时,在培养液中加入IGF-Ⅰ 50 ng/ml,绘制各组细胞生长曲线,并与单层培养对照组细胞进行比较.将培养细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学检测,H-E染色观察细胞形态.进行不同浓度IGF-Ⅰ作用下的三维培养软骨细胞MTT检测,观察0、25、50、75、100 ng/ml IGF-Ⅰ对三维培养软骨细胞各时间点的促增殖作用.结果:IGF-Ⅰ可明显刺激三维培养条件下关节软骨细胞增殖及集落形成;不同浓度的IGF-Ⅰ均可促进关节软骨细胞增殖,以50 ng/ml浓度时D490值最高.培养6周后从凝胶体系中收获细胞的软骨特异性Ⅱ型胶原表达水平较转入三维体系前未见降低.结论:IGF-Ⅰ可明显刺激藻酸盐三维培养条件下的关节软骨细胞增殖及集落形成,且细胞表型稳定.     

IL-17调控IL-6/IL-6R/JAK1/STAT3信号通路影响喉癌细胞的侵袭和转移

目的 研究白介素(IL)-17通过IL-6/1L-6R/JAK1/STAT3信号通路调控人源性高分化喉癌细胞(Hep-2)侵袭、转移.方法 以Hep-2细胞为研究对象,设IL-17刺激剂0、1、50、100 ng/ml浓度组,Westem blot法检测不同分组在IL-17的刺激下,Hep-2细胞中IL-6、IL-6R、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3的表达变化.迁移、侵袭实验观察IL-17的刺激对Hep-2细胞侵袭、迁移的影响.结果 Western blot实验中,在IL-17刺激下,1、50、100 ng/ml浓度组较0 ng/ml浓度组Hep-2细胞的IL-6、IL-6R、p-JAK1、p-STAT3的表达明显增加(p＜0.01),50、100 ng/ml浓度组较1 ng/ml浓度组Hep-2细胞的IL-6、1L-6R、p-JAK1、p-STAT3的表达明显增加(P＜0.01),100 ng/ml浓度组较50 ng/ml浓度组Hep-2细胞的IL-6R、p-JAK1、p-STAT3的表达明显增加(P＜0.01);各组间JAK1、STAT3的表达无明显变化.侵袭与迁移实验显示IL-17可以促进Hep-2细胞的侵袭和迁移.结论 IL-17可能通过IL-6/IL-6R/JAK1/STAT3信号通路促进Hep-2细胞的侵袭和转移.     

人骨髓间充质干细胞的分离、培养和体外定向诱导成类软骨细胞的实验研究

目的建立一种体外分离培养、纯化扩增人骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,一定条件下诱导人MSCs定向分化成软骨细胞,为组织工程提供软骨种子细胞。方法用单纯的贴壁培养法与密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年人MSCs;体外加自行配制软骨诱导剂,诱导2、4、6代MSCs细胞14d做免疫细胞化学比较;取2代MSCs不同浓度TGF-β1(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml),诱导14d做免疫细胞化学比较。结果软骨诱导后2、4、6代MSCs均表达Ⅱ型胶原,无显著性差异;不同浓度TGF-β1诱导2代MSCs,均表达Ⅱ型胶原,其中10ng/ml组和20ng/ml组Ⅱ型胶原呈强阳性。结论不同代的MSCs诱导率无明显差异;TGF-β1浓度为5ng/ml组Ⅱ型胶原弱阳性,不适合作为组织工程种子细胞;诱导软骨TGF-β1最适浓度为10ng/ml、20ng/ml。     

IL-33参与促进A549细胞上皮-间质转化及作用机制

目的 探讨在上皮来源的A549细胞上皮-间质转化进程中,IL-33/ST2L信号传导系统的作用及其机制.方法 培养A549细胞,RT-PCR检测受体ST2L mRNA;不同浓度白细胞介素-33(IL-33)刺激细胞,在不同时间点以MTT方法检测IL-33对A549细胞增殖的影响;以Real-time PCR法检测不同时间点A549细胞标志性基因E-cad mRNA、α-SMA mRNA以及Vimentin mRNA等的变化和IL-33/ST2L信号通路中关键因子TRAF-6 mRNA的表达改变;Westem blot法检测细胞标志性蛋白E-cad、collagenI、Vimentin 以及TRAF-6的改变.结果 IL-33对A549细胞的增殖没有影响;不同浓度(5、10及50 ng/mL)IL-33刺激A549细胞24 h,E-cad的表达随浓度的升高逐渐下降、α-SMA的表达随浓度的升高逐渐上调,选择10 ng/mLIL-33作为A549细胞的刺激浓度;随着IL-33刺激时间的逐渐延长,E-cad的表达先降低后升高,α-SMA、Vimentin、collagenI以及TRAF-6的表达呈现先升高后降低的趋势.结论 IL-33/ST2L信号通路的激活能促进A549细胞间质变,尤其是在早期炎症反应阶段作用最为明显.     

IL-6下调血管内皮细胞组织因子抑制物表达

目的:观察IL-6对脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达组织因子途径抑制物(TFPI)的影响.方法:应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养,用生长良好的第2、3代细胞进行试验.同时应用CCK-8测定不同浓度的IL-6(0.125～2.0 ng/ml,实验组)刺激后细胞活性变化,对照组给予培养液;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内TFPI mRNA水平.结果:与对照组相比,IL-6(0.125～0.5 ng/ml)对细胞活性没有显著影响(P>0.05);IL-6增加到1 ng/ml后,作用12 h后细胞活力开始下降.IL-6(0.5 ng/ml)作用6～24 h显著下调细胞TFPI mRNA表达(P<0.05),6 h时抑制效果最强(TFPI mRNA/GAPDH mRNA均值仅为0.191),以后抑制效应渐减弱,48 h达到正常水平(TFPI mRNA/GAPDH mRNA均值为0.399).结论:提示IL-6(0.5 ng/ml)对HUVECs的活性不造成直接的影响,同时IL-6(0.5 ng/ml)在6～24 h内可抑制HUVECs的TFPI mRNA表达而诱发凝血系统失衡,这可能与急性炎性反应时相的血液凝固和血栓形成有关.     

骨形态发生蛋白-7对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因的调节作用

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因表达的调节作用.方法 应用逆转录聚合酶链反应检测不同浓度BMP-7对培养的人椎间盘细胞中软骨特异性基因Sox9和Ⅱ型胶原基因表达的影响.结果 在10ng/ml、100ng/ml、1000ng/mlBMP-7作用下,其对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因mRNA可起到显著的正向调控作用.结论 BMP-7可以按照剂量依赖方式正向调节椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因的表达.提示BMP-7对退变早期的椎间盘具有一定的修复功能.     

鹿茸多肽对IL-1β诱导退变的椎间盘终板软骨细胞保护作用

目的:观察不同浓度的鹿茸多肽对IL-1β诱导的大鼠椎间盘终板软骨细胞的影响,分析其对终板软骨细胞保护的作用机制。方法:选取1月龄的健康SD大鼠,并对其椎间盘终板软骨细胞进行分离与培养,诱导组单加入10μg/L的IL-1β,药物处理组分3组,分别在培养基中加入10μg/L的IL-1β和10、30、50μg/mL的鹿茸多肽,MTT比色法检测3个时间节点(24、48、72 h)各组椎间盘终板软骨细胞的增殖情况;流式细胞仪检测大鼠椎间盘终板软骨细胞的凋亡;qPCR法检测Collagen Ⅱ、Collagen X、caspase-3、MMP-13、Bax、Bcl-2基因的表达水平。结果:在24、48、72 h时间点,MTT法检测10μg/mL鹿茸多肽组在各时间点终板软骨细胞增殖情况与IL-1β诱导组比较,差异不具有统计学意义(P0.05);而30μg/mL组和50μg/mL组均能拮抗IL-1β对软骨终板细胞増殖的抑制作用,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01);流式分析结果表明,不同浓度的鹿茸多肽均能够降低IL-1β诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞的凋亡比例(P0.05,P0.01);qPCR检测结果表明,IL-1β诱导组的Cllagen Ⅱ、Bcl-2基因的表达减弱,Collagen X、caspase-3、Bax、MMP-13基因的表达增强,与空白对照组对比差异具有统计学意义(P0.05);各浓度鹿茸多肽组均能够上调Cllagen Ⅱ、Bcl-2基因的表达(P0.05,P0.01),下调Collagen X、caspase-3、Bax、MMP-13基因的表达(P0.05,P0.01),以50μg/mL组效果最为显著(P0.01)。结论:一定浓度的鹿茸多肽通过抑制软骨终板细胞的凋亡,促进其増殖,调控其相关基质蛋白及基质降解酶、凋亡因子等基因的表达,起到了对退变的椎间盘终板软骨细胞的保护作用。     

软骨分化形成蛋白-2体外诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨分化

目的 研究软骨分化形成蛋白-2(CDMP-2)对小鼠骨髓基质干细胞软骨分化的作用.方法 体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,以不同浓度(0、10、20、50、100 ng/ml)CDMP-2因子干预培养14d后,倒置相差显微镜观察细胞形态,RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测不同浓度CDMP-2对Ⅱ型胶原表达的影响,阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖.结果 RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学显示经CDMP-2因子干预后,MSCs有Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达,呈剂量依赖性;Alcian染色结果显示CDMP-2诱导细胞分泌蛋白多糖基质,高浓度组可见细胞小结区域呈明显的异染性.结论 CDMP-2能够在体外定向诱导小鼠骨髓基质于细胞向软骨方向分化,50～100 ng/ml为最佳剂量,为进一步探讨其在软骨发育机制中的作用提供了实验基础.     

慢性炎症和能量代谢因子对乳腺癌细胞系KISS-1表达的影响

目的下丘脑弓状核KISS-1神经元,是调控下丘脑-垂体-性腺轴功能的神经中枢。各种因子可能通过影响下丘脑细胞KISS-1表达而调控性腺轴功能。因此,本研究旨在评价慢性炎症因子脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）,白介素-6（interleukin6,IL-6）、地塞米松和能量代谢相关因子胰岛素、胰高糖素样肽（glucagon-like peptide,GLP-1）对乳腺癌MCF-7细胞系KISS-1表达的影响。方法对MCF-7细胞系进行培养,测定KISS-1 mRNA和蛋白表达水平。在培养液中添加不同浓度LPS、TNF-α、IL-6、地塞米松、胰岛素和GLP-1刺激24 h、48 h和72 h,观察不同浓度的因子对KISS-1表达的影响。用实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）方法定量测定KISS-1 mRNA水平;用Western blotting方法半定量评价KISS-1蛋白表达变化。结果 1LPS（10μg/ml）和地塞米松（10-6 M和10-7 M）可抑制KISS-1 mRNA和蛋白表达;2TNF-α（100ng/ml）、IL-6（10 ng/ml,20 ng/ml）和胰岛素（0.1 mIU/ml,0.01mIU/ml）可增加KISS-1 mRNA和蛋白的表达;3GLP-1类似物（艾塞那肽,1 ng/ml和10 ng/ml）,在6 h一过性增加KISS-1mRNA和蛋白表达。结论慢性炎症和能量代谢相关因子,如LPS、TNF-α、IL-6、地塞米松、胰岛素和GLP-1影响MCF-7细胞系KISS-1表达,可能通过影响下丘脑细胞KISS-1表达,从而调控下丘脑-垂体-性腺轴的功能。     

椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变的相关性研究

目的 探讨椎体软骨终板内软骨细胞凋亡和椎间盘退变之间的关系.方法 40只成年新西兰白兔,随机平均分为实验组和对照组.实验组采用阻断椎体软骨终板营养途径的方法制作椎间盘退变模型,对照组不做任何处理.术后4周和8周,每组各处死10只动物,切取软骨终板和相应的椎间盘组织.TUNEL法检测终板软骨细胞的凋亡数,免疫组织化学方法检测椎间盘内Ⅱ型胶原阳性细胞数,并对两组数据进行相关性分析.结果 实验组软骨终板内凋亡的软骨细胞在4周、8周时分别为9.9±O.88个/视野和12.4±0.71个/视野,较对照组明显增加,4周、8周组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).相关分析显示,术后4周和8周终板软骨细胞凋亡与Ⅱ型胶原表达之间有高度的相关性,相关系数分别为0.86和0.82(均P＜0.05),表明椎体终板软骨细胞凋亡与椎间盘退变之间存在有高度的相关性.结论 阻断椎体软骨终板营养途径可导致椎间盘退变的发生,椎体终板软骨细胞凋亡增加可导致椎问盘内Ⅱ型胶原表达进一步减少.     

人骨关节炎软骨细胞的体外培养

目的:对人骨关节炎软骨细胞的分离、消化和培养进行初步研究,并就其生物学活性同人正常软骨细胞进行比较和评价。方法:以含血清培养液配制的0.05%和0.2%Ⅱ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长、增殖和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化,以及用流式细胞仪检测有或无IL-1β诱导的细胞凋亡和周期变化。结果:①消化后骨关节炎组原代细胞活力平均为82%,少于正常组的95%(P<0.01)。②MTT检测骨关节炎组细胞增殖低于正常组(P<0.01),Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝O异染反应均较弱,传至第4代软骨细胞生物学特性基本消失。③骨关节炎组细胞凋亡率为6.9%,而正常组为0.5%,IL-1β诱导后凋亡率增加了27.4%,正常组只有12.7%。结论:酶二步消化法具有较高细胞存活率、低污染率和操作简便等特点,分离培养的骨关节炎软骨细胞符合人患骨关节炎时软骨细胞退变的表现,能很好的为骨关节炎细胞水平的研究提供最佳实验对象。     

人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型的建立及其意义

目的 建立人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,观察人正常颈椎椎体和退变颈椎椎体终板软骨细胞的形态及表征.方法 选择2010年7月至2011年7月49例颈椎骨折、脱位(19例)及颈椎病(30例)患者术中取出的颈椎终板软骨,用酶消化法分别分离培养人正常颈椎椎体终板软骨细胞(对照组)和退变颈椎椎体终板软骨细胞(颈椎病组);用倒置显微镜和HE染色法观察细胞形态学变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线;甲苯蓝染色及反转录-PCR(RT-PCR)法对终板软骨细胞进行鉴定;RT-PCR法检测终板软骨细胞特征性基因蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原的表达.结果 人颈椎椎体终板软骨细胞表达特征性蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原,其生长情况及细胞表型类似于关节软骨细胞.对照组原代终板软骨细胞以多角形为主,增殖速度较快;而颈椎病组原代终板软骨细胞以梭形为主,细胞增殖速度较慢.颈椎病组原代终板软骨细胞表达的蛋白多糖基因(0.695 ±0.052)和Ⅱ型胶原基因(0.726 ±0.035)均低于对照组(0.950±0.032、0.907±0.078,t=7.263、3.681,P=0.002、0.021),Ⅰ型胶原基因则高于对照组(0.795±0.028比0.552±0.070,t=-5.560,P=0.005).结论 成功建立了人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,为椎间盘退变机制研究提供了较好的细胞学基础,解决了以前一直以动物细胞模型为研究对象的局限性.     

兔实验性骨关节病髁突软骨细胞表达软骨基质分子的变化及白细胞介素1β的影响

目的 :研究外源性炎症因子白细胞介素 1β(interleukin 1β,IL 1β)对颞下颌关节骨关节病与正常髁突软骨细胞代谢活动的影响 ,探讨其在颞下颌关节骨关节病进展过程中所发挥的作用。方法 :采用 2 0 μg·L-1重组白介素1β(recombinedhumaninterleukin 1β ,rhIL 1β)刺激体外贴壁培养条件下的成兔正常成熟髁突软骨细胞与兔实验性颞下颌关节骨关节病模型髁突软骨细胞 ,RT PCR方法检测、比较细胞对软骨基质成分Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚糖体、胶原酶以及内源性生长因子胰岛素样生长因子 1(insulin likegrowthfactor 1,IGF 1)和转移生长因子 β1(trans forminggrowthfactor β1,TGF β1)的mRNA表达变化。结果 :在 2 0 μg·L-1rhIL 1β的刺激下 ,(1)正常成熟髁突软骨细胞Ⅱ型胶原和软骨蛋白多糖聚糖体的表达均明显降低 ,胶原酶表达水平变化不明显 ;(2 )在IL 1β的作用下 ,骨关节病软骨细胞对Ⅱ型胶原和胶原酶的表达水平降低 ,对软骨蛋白多糖聚糖体的表达水平无明显影响 ;(3)IL 1β对正常和骨关节病髁突软骨细胞内源性生长因子IGF 1和TGF β1的表达均无明显影响。 结论 :蛋白多糖聚糖体的合成 ,导致髁突软骨病变发生 ,而且能不断干扰骨关节病髁突软骨细胞代谢 ,导致关节软骨基质环境进一步恶化。     

大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型的建立

目的：建立大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变的机制研究提供载体。方法：酶消化及自然传代法分离培养大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞，观察其形态学变化。采用MTT法测定第Ⅲ代软骨细胞的生长曲线。采用免疫细胞化学法检测其特征性Ⅱ型胶原的表达情况，对该模型进行鉴定。结果：大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞表达特征性Ⅱ型胶原。第Ⅲ代细胞培养在生长第13天后，细胞分裂能力明显下降，核仁不清，细胞变形明显，以梭形为主，折、旋光性弱，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴；Ⅱ型胶原合成明显下降，细胞增殖率显著降低；呈现自然退变过程。结论：建立椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变机制研究提供较好的细胞学基础。     

川芎嗪对IL-1β诱导的兔原代软骨细胞iNOS表达和NO合成的影响

目的观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的兔原代软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达及一氧化氮(NO)合成的影响。方法体外培养兔软骨细胞,用甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖,免疫荧光检测兔原代软骨细胞Ⅱ型胶原;用IL-1β10 ng/ml和(或)不同浓度(5、10、15、20μg/ml)川芎嗪共培养兔原代软骨细胞48 h后,RT-PCR和免疫组化检测iNOS基因及蛋白表达;用硝酸还原法检测细胞培养上清液NO的表达。结果软骨细胞呈三角形或多角形,蛋白多糖表达于细胞质中,Ⅱ型胶原主要表达于细胞质,少见于细胞核。与对照组比较,IL-1β单独作用软骨细胞iNOS和NO的表达显著增加(P<0.01);IL-1β和川芎嗪联合作用后,软骨细胞iNOS和NO的表达较IL-1β单独作用显著降低(P<0.05,P<0.01),但仍显著高于对照组(P<0.01)。结论川芎嗪能有效抑制IL-1β诱导兔软骨细胞iNOS的表达和NO的合成。     

藻酸包埋异体关节软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损

目的 探讨异体关节软骨细胞作为软骨种子细胞修复关节软骨缺损的可行性。方法 无菌取成年新西兰大白兔四肢关节软骨，酶消化法分离细胞，条件培养基体外培养扩增，藻酸钙凝胶包埋培养1周，植入兔膝关节股骨髁间软骨缺损，对照组缺损旷置。术后3、6个月分别取材，观察缺损修复情况；切片特染和免疫组化观察修复组织病理，并Wakitnni评分评估修复质量。结果 7／8缺损为成熟透明软骨组织修复，1／8为纤维软骨修复；Wakitani平均评1．75分；空白对照组评7．65分。实验组3个月组标本未见淋巴细胞或白细胞浸润，6个月组标本未见明显退变；所有标本均未见藻酸残留。结论 用藻酸包埋异体关节软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损的方法是可行的，异体关节软骨细胞在适当的处理后可成为关节软骨组织工程种子细胞。     

环巴胺对佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察Hedgehog(Hh)信号通路抑制剂环巴胺对体外培养的佐剂性关节炎(AA)大鼠关节软骨细胞增殖和凋亡的影响.方法 SD大鼠足趾皮内注射弗氏完全佐剂制备AA模型(模型组),对照组足趾皮内注射等量生理盐水;观察继发侧足肿胀,28 d后,HE染色评价踝关节形态学变化;胰酶-胶原酶消化培养AA大鼠软骨细胞,采用甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色鉴定软骨细胞,CCK-8法检测环巴胺处理对AA大鼠软骨细胞增殖的影响,Hoechst 33258检测环巴胺对AA大鼠软骨细胞凋亡影响,Western blot法检测AA大鼠软骨细胞中Hh信号通路相关蛋白(Shh、Ptch1、Gli1)的表达情况.结果 第12天,AA大鼠继发侧关节肿胀明显,HE染色表明AA大鼠踝关节破坏明显;Ⅱ型胶原和甲苯胺蓝染色证实成功培养AA大鼠软骨细胞;不同剂量的环巴胺可促进AA大鼠软骨细胞增殖,抑制其凋亡,降低Shh、Ptch1、Gli1 蛋白表达.结论 环巴胺可促进AA大鼠软骨细胞的增殖,抑制其凋亡,其机制与抑制AA大鼠软骨细胞Hh信号通路有关.     

Direct protective effect of interleukin-10 on articular chondrocytes in vitro

Objective To assess whether interleukin-10 (IL-10) is chondroprotective in vitro.Methods Chondrocytes were isolated from femoral cartilage of rats (7-10 days) by digesti on with collagenase Ⅱ.The first passage cells were grown in 24- well plates with DMEM, supplemented with 10% fetal bovine serum, for 2-4 days.The ce lls were then cultured in 0.1% fetal bovine serum DMEM medium, and given respec tively interleu kin-1 (IL-1) 100 μ/ml, IL-1 100 μ/ml+recombinant murine interleukin-10 ( rmIL-10) 20 ng/ml, rmIL-10 20 ng/ml, and cultured for 48 hours.Scanning el ectron morphology and immunohistochemical study of nitric oxide synthase 2 and matric metalloproteinase 3 mRNA in situ hybridization were performe d.Cell proliferation and morphology were observed under inverted microscope fr om the beginning of cell culture for three weeks.Results IL-1 stimulated granule production in the cytoplasma of chondrocytes, and the c ells died in the second and third weeks of culture.IL-10 antagonized IL-1, p rotected the cells from death and maintained chondrocyte proliferation.Scannin g electron morphology showed that IL-1 stimulated the formation of numerous mic rovilli on the cell surface, while thin and less numerous microvilli were found in cultures with IL-10.Immunohistochemical study and in situ hybridization sh owed that IL-10 inhibited NOS2 and MMP3 expression.Conclusion IL-10 not only inhibits the synthesis of inflammatory cytokines, but also direc tly protects chondrocytes by antagonizing IL-1.     

体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化的实验观察

目的：探讨骨髓基质干细胞（MSCs）与软骨细胞体外非接触性共培养成软骨的可行性。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞，MSCs以1×10^5个/ml接种于共培养板内孔，第1代软骨细胞以1×10^4个/ml接种于共培养板外空板。48h后将内孔插如外孔中，补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。以相同密度MSC单独培养为空白对照，观察共培养7d和14d流式细胞仪观察MSC的Ⅱ型胶原蛋白变化情况。结果：实验空白组在7d和14d，Ⅱ型胶原蛋白均阴性表达，符合MSC特性。非接触共培养1周后，Ⅱ型胶原蛋白阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，具有统计学意义；非接触共培养2周后，Ⅱ型胶原蛋白也阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，同样具有统计学意义；实验14d组与实验7d组比较，P〈0.01，具有非常显著性差异。结论：软骨微环境在MSCs成软骨分化及体内软骨形成中具有重要作用，软骨细胞能有效地诱导MSCs向软骨细胞分化并促进MSCs体内软骨形成。