大肠杆菌T蛋白PDH结构域的高效表达纯化与活性测定

 目的构建高效表达菌株,以大量表达大肠杆菌T蛋白的预苯酸脱氢酶(PDH),为研究T蛋白双功能结构域CM和PDH的相互协同作用以及T蛋白抑制剂对其影响提供活性蛋白材料。方法利用pGEX高效融合表达系统将PDH与谷光甘肽疏基转移酶(GST)编码序列在表达宿主BL21实现高效表达,并利用对GST具有亲和作用的GlutathioneSepharose4B琼脂糖珠进行亲和层析以对其分离纯化。结果表达产物达菌体总蛋白的40%,可溶性目的产物得量为240mg·L^-1,利用亲和层析法纯化后纯度达92.5%,GSTPDH融合蛋白的PDH的比活为38U·mg^-1。结论本法成功构建高效表达PDH菌株,表达量高,纯化度高,GST-PDH酶活性正常,为进一步研究奠定基础。     

v-Src蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其活性分析

 目的表达高纯度具有激酶活性的Src蛋白,为抗肿瘤药物研究提供蛋白质靶标。方法利用高效表达质粒pGEX-KT克隆v-src全基因,诱导表达得到的GST-Src融合蛋白经GlutationeSepharose4B亲和层析柱纯化后,采用Westernblotting和以polyGlu:Try(4:1)为底物的ELISA法鉴定其免疫原性和酪氨酸激酶活性。结果GST-Src蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%,其中包涵体与可溶性蛋白的表达量分别约13.5和2mg·L^-1,纯度分别约98%和85%,比活约1.13和0.62nmol·min^-1·mg^-1。结论本法表达的GST-Src融合蛋白表达量高、纯化效果好,且具有较高的激酶比活。     

大肠杆菌T蛋白的聚合状态分析

 目的解析大肠杆菌T蛋白的四级结构。方法利用分段克隆法克隆表达了T蛋白及其两个独立结构域分支酸变位酶(CM,T/1-94)和预苯酸脱氢酶(PDH,T/93-373),再利用SDS-PAGE测得变性条件下T蛋白、CM和PDH的M_r分别为42×10³,11×103和32×10³,HPLC测得天然条件下CM和PDH的M_r分别为25×10³和63×10³,再用化学交联法分析聚合状态。结果显示T蛋白、独立结构域CM和PDH均为二聚体。结论说明大肠杆菌T蛋白二聚体是通过CM与CM、PDH与PDH相连的。     

大肠杆菌T蛋白的聚合状态分析

 目的解析大肠杆菌T蛋白的四级结构。方法利用分段克隆法克隆表达了T蛋白及其两个独立结构域分支酸变位酶(CM,T/1-94)和预苯酸脱氢酶(PDH,T/93～373),再利用SDS-PAGE测得变性条件下T蛋白、CM和PDH的M_r分别为42×10³,11×10³和32×10³,HPLC测得天然条件下CM和PDH的M_r分别为25×10³和63×10³,再用化学交联法分析聚合状态。结果T蛋白、独立结构域CM和PDH均为二聚体。结论说明大肠杆菌T蛋白二聚体是通过CM与CM、PDH与PDH相连的。     

重组人成骨蛋白-1在大肠杆菌中的高效表达及复性

 目的研究重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)的发酵、纯化和复性。方法将构建好的重组质粒pBV221转化Escherichia coliBL21,迅速升温至42℃诱导rhOP-1以包涵体的形式高效表达。裂菌后利用6mol·L^-1尿素溶解目的蛋白,经SP-FastFlow离子交换色谱纯化后,利用cysteine/cystine对单体rhOP-1透析复性。结果rhOP-1的表达量占菌体总蛋白质量的33%,纯化后纯度可达98%,活性得到有效恢复。结论建立了rhOP-1发酵、纯化与复性的方法,获得高表达、高纯度、有活性的rhOP-1。     

丹参转录因子SmWRKY1蛋白的表达和纯化条件优化研究

WRKY转录因子是一类含有高度保守的WRKY结构域的锌指蛋白,是植物所特有的转录因子家族。该研究将已克隆的 SmWRKY1 cDNA构建到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约36 kDa,与预测的蛋白相对分子质量一样,说明该基因在大肠杆菌中成功表达。对影响蛋白表达的4个因素：诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及诱导前菌液的浓度进行优化,结果表明在大肠杆菌BL21（DE3）中,当A₆₀₀达到约1.0~1.5时,加入0.2 mol·L^-1的IPTG,在20 ℃诱导培养12 h后SmWRKY1蛋白的表达量较高。原核表达产物SmWRKY1蛋白以包涵体的形式存在,采用尿素提取包涵体蛋白,用Ni²⁺亲和色谱法纯化表达蛋白,纯化后蛋白的质量浓度为2.454 g·L^-1。经蛋白质印迹检测,His-Tag单克隆抗体可以特异性的识别SmWRKY1蛋白,进一步证实丹参SmWRKY1蛋白在大肠杆菌中成功表达。本研究为进一步开展 SmWRKY1 基因的表达与丹参酮类等化合物的生物合成相关研究奠定了工作基础。     

呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究

 目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性。方法PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni⁺螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(>90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性。结论建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础。     

重组人胰岛素样生长因子-1分离纯化工艺的建立

目的：建立重组人胰岛素生长因子－1（rhIGF-1)大肠杆菌表达后的高效分离纯化工艺，以便获得高纯度的重组蛋白。方法：已构建好的表达载体转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导进行表达，将离心收集到的菌体用超声破壁，破壁菌液离心分离，收集上清液，进行阴离子交换层析，疏水层析和分子筛纯化，得到最终纯品，蛋白纯度用SDS－PAGE鉴定，ELISA法检测rhIGF-1含量，检测纯化后重组蛋白的生物学活性。结果：用大肠杆菌BL21表达rhIGF-1以可溶性形式存在胞浆中，经3步rhIGF-1分离纯化工艺，其工艺流程可获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1，为产业化及临床应用奠定基础。     

重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究

 目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu,Zn-SOD),并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25～70℃和pH 5.0～10.5内活性稳定,并可耐受2～10 mol·L^-1的尿素和2%～8%的十二烷基硫酸钠(SDS),对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。     

重组大鼠长链2-羟酸氧化酶的克隆与表达

 目的 克隆表达大鼠长链2-羟酸氧化酶。方法 以鼠肾cDNA为模板,扩增大鼠长链2-羟酸氧化酶基因,连接到pET-28a(+)载体上构建重组质粒pET28a-rHao2,转化表达宿主Rosetta(DE3)。利用IPTG诱导重组蛋白的表达,并通过Ni柱纯化。通过监测DCIP在605 nm处吸光度值的变化来测定其对经典底物的酶动力学参数,验证活性。结果 成功构建了表达质粒pET28a-rHao2(β₁)和pET28a-rHao2(β₂),并诱导表达了大鼠长链2-羟酸氧化酶两种同工酶β₁和β₂,其对2-羟基辛酸的K_m分别为(25.1±1.9)和(24.6±1.2) μmol·L^-1;对2-羟基异己酸的K_m分别为(24.6±2.3)和(22.4±1.6) μmol·L^-1。结论 成功克隆表达了大鼠长链2-羟酸氧化酶两种同工酶β₁和β₂,获得了纯度高,活性好的重组酶,可为其体外底物及抑制剂的筛选提供模型。     

藏花素对膀胱移行细胞癌T24细胞基因表达谱的影响

目的：应用基因表达谱芯片研究藏花素(crocin)对膀胱移行细胞癌T24细胞基因表达谱的影响。方法：MTT法测定藏花素对T24细胞的生长抑制率，选出藏花素最佳作用时间和浓度，运用高通量的基因表达谱芯片检测藏花素作用T24细胞前后基因表达谱的变化，筛选差异表达基因。RT-PCR和免疫细胞化学验证上调基因p21^WAF1和下调基因cyclinD1。结果：MTT实验结果显示3 mmol·L^-1藏花素作用T24细胞48 h的抑制率与对照组相比有显著意义(P<0.05)。基因芯片检测发现3 mmol·L^-1藏花素作用T24细胞48 h引起该细胞系基因表达谱广泛地改变，其中表达差异2倍以上的基因共836个，这些差异表达基因的功能涉及多个方面，最为明显的是与细胞生长调节相关的细胞周期调节基因、细胞凋亡调控基因、DNA复制相关基因等类型。RT-PCR检测其中的细胞周期调节相关基因p21^WAF1和cyclinD1，结果与基因芯片相符。同时免疫细胞化学结果从蛋白表达水平上佐证p21^WAF1和cyclinD1变化与芯片结果一致。结论：藏花素可以诱导T24细胞基因表达谱广泛的改变，并可能通过调控细胞周期相关基因的表达来抑制T24细胞的增殖。     

荚膜红细菌十聚异戊二烯焦磷酸合成酶异源表达及纯化的研究

 目的构建生产辅酶Q₁₀的大肠杆菌基因工程菌并研究相关酶的表达情况。方法将荚膜红细菌(Rhodobacter capsula-tus B10)中十聚异戊二烯焦磷酸合成酶编码基因ddsA分别克隆在Lac,T7和Trc启动子下游,使其在Escherichia coli JM83中表达。同时利用His-tag的表达系统,对该酶的融合表达和镍柱纯化条件进行了研究。结果产物分析发现该基因在E.coli中表达出有活性的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并使宿主产生辅酶Q₁₀。同时,28℃培养过夜,该酶以可溶形式存在于上清液中。在150 mmol·L^-1咪唑的洗涤条件下,从镍柱上解离,并可以达到电泳纯。结论大肠杆菌可以表达 Rhodobacter capsula-tus B10 的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶,并合成辅酶Q₁₀。     

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆、表达、发酵及纯化工艺研究

 目的:用基因工程的方法获得人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)的高产菌,通过发酵培养,最后纯化获得大量廉价的高纯度的hCu,Zn-SOD?方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增了人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)的cDNA,将此正确测定的cDNA重组到分泌型表达载体pET-22b(+)中,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中用5L全自动发酵罐表达hCu,Zn-SOD,表达产物用亲和层析一步法进行纯化?结果:hCu,Zn-SOD表达产物占菌体总蛋白的30%,发酵水平酶活力可达950u·ml^-1培基,比活为1400u·mg^-1,经亲和层析后纯度可达88%,活力回收率大于80%,比活大于5000u·mg^-1?结论:我们开展人重组SOD的研究不仅大大丰富了应用酶学的内容,而且积极开展应用研究,实现产业化,意义重大?     

草珊瑚叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

目的构建草珊瑚Sarcandra glabra叶片全长c DNA文库,进一步发掘与草珊瑚代谢及抗逆相关的基因,为草珊瑚功能基因的发现提供实验基础。方法以草珊瑚的嫩叶为实验材料,利用SMART法(即Clontech公司SMARTer试剂盒)构建草珊瑚全长c DNA文库。利用ABI3730 DNA序列分析测序获得大量的EST序列,利用生物信息分析方法对EST序列进行功能注释。结果构建了草珊瑚叶片的全长c DNA文库,经过鉴定草珊瑚c DNA文库的文库滴度为1.14×107 cfu/m L,平均插入片段为1 000 bp。利用该文库测序了221个单克隆,共获得EST序列177条,拼接出151个单一序列;利用NCBI数据库进行同源比对分析,共有119条(79%)与已知基因有显著的同源性,进行GO功能注释,显示其表达术语涉及了细胞生长,信号转导,蛋白质合成、转录,抗逆反应以及能量代谢等。结论构建了符合要求的草珊瑚叶片全长c DNA文库,并对相关EST序列进行了生物信息学分析,为草珊瑚基因组学研究提供一定的参考。     

Augmentation of immune cell activity against tumor cells by Rauwolfia radix

In this study, we investigated the effect of Rauwolfia radix on heat shock protein (HSP) 70 expression and cytotoxicity against tumor cells in activated human T cells. When activated T cells were cultured with Rauwolfia radix for 18 h, HSP70 expression after heat shock was remarkably increased, and cytotoxicity against T98G tumor cells was augmented. Moreover, Rauwolfia radix also enhanced the cytotoxicity of heat shocked activated T cells against Molt-4 and T98G tumor cells. Secretions of interferon-gamma (IFN-gamma) and tumor necrosis alpha (TNF-alpha), due to Concanavalin A (Con A) stimulation, were increased by Rauwolfia radix in activated T cells. To investigate the antitumor effect in vivo, EL-4 tumor-bearing mice were administered with Rauwolfia radix in drinking water. The survival period of the Rauwolfia radix treatment group was significantly prolonged compared with that of the control group. Reserpine, the major active ingredient of Rauwolfia radix, also enhanced the cytotoxicity of activated T cells against Molt-4 and T98G tumor cells, and prolonged the survival period of EL-4 tumor-bearing mice. Taken together, our results suggest that Rauwolfia radix can enhance the activity of immune cells against tumor cells.     

三叶崖爬藤查耳酮异构酶基因克隆与外源诱导表达及酶活性分析

目的 克隆三叶崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum查耳酮异构酶（chalcone isomerase,CHI）基因,探究CHI基因对三叶崖爬藤黄酮合成途径的调控作用。方法 分析三叶崖爬藤转录组,获得三叶崖爬藤CHI基因序列,并进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定三叶崖爬藤根、茎、块茎、老叶、幼叶及吲哚-3-乙酸（3-indoleacetic acid,IAA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）、水杨酸（salicylic acid,SA）和酵母提取物（yeast extract,YE）等诱导条件下CHI基因的表达量,利用分光光度法测定黄酮含量和CHI酶活性变化,并对其进行相关性分析。结果 转录组数据分析结果表明,三叶崖爬藤CHI基因全长为1 096 bp(GenBank序号：OQ588006),含有1个长为714 bp的开放阅读框,编码237个氨基酸。三叶崖爬藤CHI蛋白分子式为C1148H1819N285O348S5,等电点（PI）为5.28,相对分子质量为25 340,...