利用高分辨液相质谱综合表征抗CTLA4单克隆抗体的研究

目的研究建立抗CTLA4单抗质谱表征方法。方法以抗CTLA4单抗为研究对象,利用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS),通过优化液相条件与质谱参数,应用液质联用技术从完整蛋白相对分子质量、亚基相对分子质量、氨基酸序列覆盖率、二硫键、糖基化位点、W糖基化修饰等方面对抗CTLA4单抗进行全面的表征。结果抗CTLA4单抗完整相对分子质量(主要糖型,A2G0F/A2G0F)约为147992;去糖完整相对分子质量为145103;轻链相对分子质量为23450,重链相对分子质量(主要糖塑,A2G0F)为50548;重链Fd段相对分子质量为25355,重链sFc段(A2G0F,lxK_Loss)25189。使用Trypsin&Chymotrypsin分别进行蛋白酶解,单抗氛基酸序列覆盖率为100%;16对二硫键全部得到鉴定,与理论二硫键连接方式一致;N糖基化修饰所在的肽段序列为EEQYNSTYR,N-糖基化修饰位点位于重链的第298位天冬酰胺残基上,有13种主要糖塑,包括A2G0F(59.8%)、A2GlFa(18.66%)、A2GlFb(7.28%)、A2G2F(3.2%)、M5(1.66%)、A2S1G0F(1.17%)、A1G0F(1.16%)、A3G1F(0.95%)、A2G0(0.94%)、A2S2F(0.78%)、A2S1G1F(0.67%)、A3G0F(0.53%)和A1G1F(0.51%)。结论建立了基于质谱技术对CTLA4单抗系统的表征分析方法。     

首批HPLC-SEC系统适用性免疫球蛋白国家对照品研制

目的 研制一种高效液相分子排阻色谱(HPLC-SEC)系统适用性免疫球蛋白国家对照品,用于免疫球蛋白类产品等分子大小分布系统适用性确认。方法 制备符合技术指标要求的静注人免疫球蛋白产品作为对照品原料,合并后进行除菌过滤,最后分装。按照《中国药典》2020年版三部附录中“人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定方法”,在8家实验室进行协作标定,同时进行稳定性监测。结果 8家实验室测定本批对照品单体与裂解物分离度(R)均＞1.5(均值为2.3),实验条件均符合《中国药典》2020年版三部中相关要求;8家实验室对照品裂解物峰面积百分比均值为3.83%,95%置信区间(3.48,4.19)%,均＞2.0%,满足预期技术要求。在2~8 ℃下持续对该对照品进行14个月稳定性监测,分离度(R)符合《中国药典》要求,裂解物峰面积百分比未发生趋势性变化,建议对照品按2~8 ℃保存和运输。结论 HPLC-SEC系统适用性免疫球蛋白国家对照品可以用于《中国药典》2020年版要求的系统适用性测试,有助于提升免疫球蛋白等产品分子大小分布检测结果可靠性。     

首批肝素相对分子质量国家对照品的建立

目的《中国药典》2015年版二部肝素钠、肝素钙新增相对分子质量与相对分子质量检查项,需建立首批肝素相对分子质量国家对照品及系统适用性对照品。方法以《美国药典》肝素相对分子质量测定用对照品(USP heparin sodium molecular weight calibrant,批号:F0L483)为肝素相对分子质量对照品,以《美国药典》肝素相对分子质量系统适用性对照品(USP heparin sodium identification,批号:G1L413)为肝素相对分子质量系统适用性对照品,采用《中国药典》2015年版二部肝素钠“相对分子质量与相对分子质量分布”检查法,对肝素相对分子质量国家对照品待标品(批号:140819-201501)及肝素国家对照品待标品(批号:140818-201501)进行相对分子质量与相对分子质量分布测定,由全国12个药检所及肝素生产厂家实验室协作标定。结果对肝素相对分子质量国家对照品待标品(批号:140819-201501)相对分子质量5000~42000的20个点的百分面积进行标定,对实验室内误差进行考察,12个实验室中有2个实验室(2号、7号)部分点的标准差(standard deviation,SD)为1%~2%,其余10个实验室的SD值均小于1%,对实验室间误差进行考察,20个数据点的SD值均小于1%。相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于10%。肝素国家对照品待标品重均相对分子质量实验室内SD值除2号实验室外,其余实验室SD小于180,实验室间SD为180,实验室间RSD为1.1%。结论经国家药品标准物质委员会审定后批准,肝素相对分子质量国家对照品待标品(批号:140819-201501),附带宽分布标样表,及肝素国家对照品待标品(批号:140818-201501),重均相对分子质量16200,可以用于《中国药典》2015年版二部肝素钠、肝素钙相对分子质量与相对分子质量分布检查使用。     

丹参水溶性成分HPLC指纹图谱指纹对照品对照法的研究

目的　建立HPL C法测定丹参药材水溶性成分的指纹图谱标准,确定指纹对照品对照法的作用,实现丹参药材指纹图谱标准的重现与易控。方法　采用C1 8色谱柱,甲醇- 1.0 %冰醋酸溶液梯度程序洗脱,体积流量为1.0m L /m in。以丹参对照药材制备指纹对照品进行色谱系统适用性试验,考察梯度洗脱程序、流动相酸度以及色谱柱填充剂对指纹图谱重现性的影响。结果　建立的指纹图谱测定系统,对丹参水溶性成分分离良好,选择色谱图中15个特征峰作为指纹峰。将不同产地的10批药材的指纹图谱与同时测定的指纹对照品图谱进行比较,结果即使改变色谱柱填充剂也可以获得一致的相似性评价结论。结论　色谱指纹图谱可以体现药材中多个成分的信息,但色谱系统的变化对指纹图谱的重现性有很大的影响,而且在不同的色谱柱条件下所得的指纹图谱结果不尽相同。因而为了实现指纹图谱标准的重复可控,应同时规定指纹图谱测定的色谱系统适用性条件和指纹对照品。     

齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物HPLC指纹图谱研究

目的:建立齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物的指纹图谱。方法:采用高效液相色谱法进行测定,用国家药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价》(2004年A版)软件,对10批不同批次的齿叶白鹃梅叶总黄酮提取物中黄酮类成分指纹图谱进行相似度计算。结果:测定10批齿叶白鹃梅叶总黄酮的HPLC图谱,建立标准指纹图谱,有19个共有峰,通过与对照品的对照,指认了其中8个化合物色谱峰,各共有峰之间分离度较好;用中药指纹图谱相似度评价系统计算其相似度,各批总黄酮的相似度均>0.90。结论:该方法精密度、稳定性及重复性较好,特征性及专属性强,为齿叶白鹃梅综合利用开发提供了科学依据。     

冬虫夏草蛋白LC-MS指纹图谱研究

目的采用高效液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)研究冬虫夏草蛋白指纹图谱,为冬虫夏草质量研究提供科学依据。方法色谱柱:Sepax bio-C4 (4. 6 mm×250 mm,3μm),流动相:0. 1%甲酸-水(A),0. 1%甲酸-乙腈(B),梯度洗脱,流速0. 6 m L/min,柱温30℃,检测器MSD。采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"(2004 A版)对12批冬虫夏草指纹图谱进行分析,确定共有峰并进行相似度评价。结果建立了冬虫夏草蛋白LC-MS对照图谱,标示出了9个共有峰,12批冬虫夏草样品指纹图谱与对照图谱的相似度均0. 90,而6种其他虫草样品指纹图谱与对照图谱的相似度均0. 10,说明建立的指纹图谱方法专属性强。结论建立的分析方法专属性强,重复性及稳定性良好,可用于冬虫夏草的真伪鉴别。     

中药对照制剂自身对照法用于桂枝茯苓胶囊的质量评价

以桂枝茯苓胶囊(GZFL)为例,提出以中药对照制剂作为标准物质随行生成指纹图谱代替对照指纹图谱对中药复方制剂进行质量评价,消除因仪器和色谱柱等实验条件不同引入的误差,同时解决无对照指纹图谱不能拟合的问题。采用2010年版《中国药典》收录的GZFL质量标准(指纹图谱和多成分含量测定)对所制成的对照制剂进行质量合格性评价;在不同仪器、色谱柱等实验条件下,分别以对照制剂随行生成指纹图谱和对照指纹图谱为指标对多批出厂检验合格的GZFL样品进行质量评价对比研究,考察对照制剂评价复方药物的可行性;以稳定性试验考察结果为参考,确定GZFL对照制剂作为标准物质的包装和保质期。结果发现,以GZFL对照制剂随行生成指纹图谱评价样品较对照指纹图谱评价可消除因仪器和色谱柱等实验条件不同引入的误差;0~6月的加速和长期稳定性实验研究结果显示,对照制剂在双层铝塑包装条件下质量稳定,说明对照制剂可采用该包装条件进行储存。研究表明,GZFL对照制剂可以作为标准物质代替对照指纹图谱随行生成指纹图谱对GZFL进行质量评价。     

大黄虫丸两项薄层色谱鉴别方法的改进

本着精简、高效、合理、准确的实验原则 ,笔者对《中国药典》2 0 0 0年版一部 (以下简称药典 )大黄广廿灬虫 虫丸条下的两项薄层色谱 (TLC)鉴别实验尝试了方法改进 ,取得了满意效果 ,现报道于下。1　材料与试药仪器 :CQ - 5 0超声波清洗器 (上海超声波仪器厂 ) ,ZF -I型三用紫外分析仪 (上海顾村电光仪器厂 )。薄层板 :含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶H板 ,10cm× 10cm(自制 ) ,含 4 %醋酸钠的羧甲基纤维素纳溶液为粘合剂的硅胶G板 ,10cm× 10cm (自制 ) ,硅胶G板 (商品板 10cm× 10cm) (青岛海洋化工厂分厂 )。供试品与对照品 :大黄广…     

不同剂型夏桑菊颗粒HPLC指纹图谱及其模式识别分析

建立夏桑菊有糖和无糖颗粒的HPLC指纹图谱,为其鉴别与有效控制质量提供参考。采用高效液相法采集20批无糖型和34批有糖型夏桑菊颗粒指纹图谱,通过模式识别方法(主成分分析,正交最小二乘法判别分析)分类并筛选其主要差异组分;通过对照品对照的方法鉴定其主要的组分。成功建立夏桑菊有糖和无糖颗粒指纹图谱;主成分分析不能完全分类2种颗粒,而正交最小二乘法判别分析可明显的分为2类;2种颗粒之间差异最大的组分主要有6个,其中3个分别为异迷迭香酸苷、木犀草苷和蒙花苷。该研究建立的模式识别方法有助于夏桑菊颗粒整体质量控制,同时为其质量评价提供一种有效手段。     

当玛-5胶囊含量测定方法的研究

当玛 - 5系蒙古族验方 ,收载于《中国药典》2 0 0 0年版一部第 389页 ,汉语名为五味清浊散。本文采用薄层扫描测定熊果酸的含量 ,方法准确 ,可行。1　实验部分1.1　仪器与试药 :岛津 CS- 930 1型双波长薄层扫描仪 ;自动薄层铺板器 (CAMAG) ;硅胶 G(青岛海洋化工厂 ) ;熊果酸对照品 (中国药品生物制品检定所 ) ;当玛 - 5胶囊样品 :内蒙古药品检验所当玛 - 5胶囊课题组提供 ;其他试剂均为分析纯。1.2　供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液的制备 :精密称取本品 6 g,置索氏提取器中 ,加乙醚 ,回流提取 4小时 ,提取液回收乙醚至干 ,残渣加…     

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??OBJECTIVE To analyze the N-glycan profile of therapeutic antibodies by UPLC-Qda MS. METHODS The N-linked glycan in Fc region was released by PNGase F digestion and labeled by RapiFluor-MS, and labeled glycans were analyzed by UPLC-Qda MS. RESULTS The UPLC-Qda MS method showed good accuracy in N-glycan quantitaion and qualification, and the ??m/z value of individual N-glycan was in a range of ??0.5. Three similar biotherapeutic products (SBP) showed a nearly same N-glycan profile with the reference biotherapeutic products (RBP) and the total percentage of fucosylated glycans was comparable, only one fraction of N-glycans had some difference. The major N-glycans of antibodies expressed by CHO cells, NS0 cells and SP2/0 cells were G0F-N, G0F, Man5, G1Fa, G1Fb and G2F, accounting for above 80% of total glycans. Eleven glycoforms were detected in CHO cell expressed antibodies, 22 and 26 glycoforms were detected in NS0 cell and SP2/0 cell expressed antibodies respectively. The N-glycans of NS0 cell and SP2/0 cell expressed antibodies contained more sialylated and galactosylated complex glycoforms, which was related to the antibody half-life in vivo and immunogenicity. CONCLUSION The HILIC UPLC-Qda MS, as a fast and accurate analytical method, can be used in the quality control of N-glycan profile of antibody.     

红花药材的HPLC指纹图谱及质量研究

目的:建立红花药材的HPLC标准指纹图谱,为科学评价和有效控制其质量提供可靠的方法。方法:用HPLC方法测定了46批市售红花药材,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统,建立红花的标准指纹图谱并计算了每批药材的相似度。结果:46批市售红花药材的HPLC指纹图谱主要有12个共有峰,其中10个共有峰得到确认,相似度在0.8以上占76%。结论:红花药材可通过与标准指纹图谱比较评价质量,本方法可用于红花药材质量评价。     

藤梨根药材HPLC指纹图谱及质量研究

目的:建立藤梨根药材的HPLC-UV特征指纹图谱,为其品质评价提供参考.方法:以乙腈-0.25％甲酸水为流动相梯度洗脱,测定波长280 nm,指纹图谱相似度评价软件确定共有峰后,建立藤梨根的标准指纹图谱并计算了每批药材的相似度,利用聚类分析方法对指纹图谱数据进行分析.结果:建立了含有15个共有指纹峰的藤梨根HPLC-UV特征指纹图谱,并标定熊果酸、油酸、阿魏酸、槲皮素等7种共有成分.结论:该方法快速、准确,可用于评价藤梨根药材质量.     

3种市售中药复方制剂消炎利胆片的HPLC指纹图谱研究

 目的 建立3种市售中药复方制剂消炎利胆片的HPLC指纹图谱，并对多批次产品的质量进行初步评价。方法 采用C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-水（分别含体积分数0.1%的甲酸）为流动相进行梯度洗脱，流速1.00 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温25 ℃；建立消炎利胆片的HPLC指纹图谱，通过比对各组方中药提取物的HPLC图谱，确定消炎利胆片HPLC指纹图谱中主要色谱峰的组方中药来源；通过比对化学分离制得的对照品的保留时间，对部分主要色谱峰进行明确化学指认；利用中药指纹图谱相似度评价系统对3个厂家的24批市售产品进行相似度评价。结果 所建立的消炎利胆片指纹图谱具有较好的精密度、重现性和稳定性，在可检出的40个色谱峰中，31个色谱峰的组方中药来源得到明确，7个色谱峰得到化学指认。相同厂家不同批次市售消炎利胆片指纹图谱的相似度不低于0.954；3个厂家的24批市售消炎利胆片指纹图谱的相似度为0.845~0.987，然而，剪切图谱（脱水穿心莲内酯出峰前的指纹图谱，即0~69 min）的相似度仅为0.478~0.896。结论 所建立的HPLC指纹图谱表达了上述3种市售消炎利胆片中多组分的整体特征，为评价市售消炎利胆片的质量提供了可靠的实验数据。     

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??OBJECTIVE To establish a evaluation method of microbial identification technology by comparing four different microbial identification METHODS. METHODS A total of 50 tests by API microbial identification system, VITEK 2 compact system, Riboprinter system, and MicroSeq ID DNA sequencing system were performed against 19 standard strains and 10 wild strains. The accuracy and reproducibility of these METHODS were evaluated. RESULTS All the four identification technologies could be used to identify specified micro-organisms, but they had difference in other strains. Molecular biotechnology was better than biochemical identification in accuracy and reproducibility. CONCLUSION The users should establish suitable acceptance criteria for accuracy and reproducibility, taking into account method capability.     

基于小波变换和分形表达的绞股蓝药材质量评价方法研究

目的:建立绞股蓝药材的HPLC指纹图谱,采用分形理论与小波变换的方法进行指纹图谱的特征提取,利用相似度计算对绞股蓝药材进行质量评价。方法:用甲醇回流提取绞股蓝药材中的黄酮类成分,建立HPLC指纹图谱。将色谱响应信号进行小波分解,并用分形维数描述各小波基参量。以小波基分形参量为特征变量,对不同产地的绞股蓝药材进行相似度比较。结果:采用优化的提取与分析条件建立了绞股蓝药材的指纹图谱。各样品相对于参照品的相似度可有效的评价各种绞股蓝样品。结论:以小波基分形参量表达的色谱指纹图谱用于中药材的质量评价,相对于人工选择特征峰更具客观性。以小波基分形参量计算的相似度可以定性评价绞股蓝样品;浙江产绞股蓝药材可以作为陕西安康绞股蓝的替代药材。     

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??OBJECTIVE To assess a panel of 9 human monoclonal antibodies against human erythropoietin (EPO) with defined characteristics (non-neutralizing, neutralizing, affinities) for suitability for EPO antibody assays. METHODS A multi-center collaborative study involving three different laboratories and different assay platforms was carried out. Direct ELISA was used to test the affinities of the samples by Shenyang Sunshine pharmaceutical Co., Ltd and National Institutes for Food and Drug control,while indirect ELISA was used by Xiamen amoytop biotech Co., Ltd. The neutralizing assays were performed using UT-7 cell line by all the three laboratories. RESULTS The properties of the 9 human monoclonal antibodies against human erythropoietin were assessed efficiently by all the three laboratories using different METHODS.CONCLUSION It is suggested that the EPO antibody panel is established to enable the evaluation of the performance of different EPO antibody assays and thus the selection of appropriate assay for clinical use.     

不同来源瓜子金药材的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱和主成分分析

目的：研究瓜子金药材的高效液相色谱指纹图谱,为科学评价和有效控制其质量提供可靠方法。方法：瓜子金药材指纹图谱的建立采用高效液相色谱-二极管阵列-蒸发光散射检测方法,分析条件采用DiscoveryC18色谱柱、流动相为乙腈-甲醇-0.05%三氟乙酸梯度洗脱。二极管阵列检测波长为350nm,蒸发光散射检测漂移管温度为105°C,载气流速为2.6L·min^-1。结果：应用二极管阵列检测-蒸发光散射检测联用可有效的互补,二极管阵列检测可显示出黄酮醇类化合物的特征吸收,蒸发光散射检测显示出皂苷类化合物的吸收信息。主成分分析可准确的对不同来源的瓜子金药材进行分类。结论：高效液相色谱-二极管阵列-蒸发光散射检测方法建立的指纹图谱可作为瓜子金药材质量控制的有效方法。