甜橙中UDP-鼠李糖合成酶基因CsRHM的克隆与鉴定北大核心CSCD

UDP-鼠李糖是一种由鼠李糖合成酶(rhamnose synthase,RHM)催化合成的糖苷供体,是合成各种鼠李糖糖苷类次生代谢产物的重要组成之一。该研究从甜橙中首次克隆得到一个RHM基因(CsRHM),并进行生物学信息分析,体外功能鉴定等特异性分析。结果显示CsRHM的开放阅读框为2007 bp,编码668个氨基酸,推测相对分子质量为75.27 kDa,理论等电点为6.97,具有RHM酶家族的特征信号序列(GxxGxxG/A和YxxxK)。多序列对比与系统进化树显示,CsRHM与其他物种的RHM具有同源性。体外酶促反应结果证实CsRHM重组蛋白具有将UDP-葡萄糖转化为UDP-鼠李糖的催化活性,并且明确了其催化的酶动力学参数V_(max)=0.3737μmol·L^(-1)·min^(-1),K_(m)=21.29μmol·L^(-1),K_(cat)=0.24 s^(-1),K_(cat)/K_(m)=1.13×10^(4)s^(-1)·L·mol^(-1)。该研究首次报道了CsRHM,并验证了其体外催化功能,为进一步研究生物合成UDP-鼠李糖奠定基础。     

珊瑚菜GlPS1、GlPS2基因克隆及表达分析

目的克隆珊瑚菜Glehnia littoralis补骨脂素合成酶(psoralen synthase,PS)基因全长cDNA序列,并进行生物信息学和表达量分析。方法在前期珊瑚菜转录组测序的基础上,筛选出表达量较高的2条PS基因GlPS1和GlPS2序列。利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法对2个基因cDNA序列3’端进行克隆,DNAMAN拼接后得到基因全长cDNA序列,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测GlPS1和GlPS2基因的组织特异性表达。结果 GlPS1和GlPS2基因cDNA序列全长分别为1 885 bp和1 971 bp,编码495和502个氨基酸残基,蛋白相对分子质量分别为55 740.7和56 363.9,等电点为8.28和6.62,均属于细胞色素P450超家族,含有1个跨膜区,为亲水性蛋白。系统进化分析表明,GlPS1和GlPS2与伞形科欧防风Pastinaca sativa、旱芹Apium graveolens、大阿米芹Ammi majus PS蛋白亲缘关系较近。RT-qPCR结果显示GlPS1基因在根中表达量较高,在叶中表达量较低,而GlPS2基因在花中表达量较高,在根中表达量较低。结论首次获得珊瑚菜GlPS1和GlPS2基因的全长cDNA序列并进行了表达分析,为进一步开展珊瑚菜补骨脂素合成酶基因的功能和遗传调控机制研究奠定基础。     

红树林植物杯萼海桑法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的 对杯萼海桑Sonneratia alba萜类化合物生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因的编码cDNA序列进行克隆,为研究杯萼海桑萜类化合物生物合成与基因调控奠定基础.方法 结合杯萼海桑根的转录组注释,根据编码区序列设计引物,通过PCR方法克隆杯萼海桑FPS (SaFPS)基因的编码区cDNA.结果 PCR扩增了一个长1 029 bp的基因片段,该片段编码由342个氨基酸组成的SaFPS.同源性比对结果显示基因编码蛋白与甘草的FPS具有氨基酸一致性达86％.其具有异戊烯基转移酶的2个典型保守功能域.进化树分析结果显示,与甘草Glycyrrhiza uralensis、苜蓿Medicago truncatula、羽扇豆Lupinus albu具有较近的亲缘关系.实时荧光定量PCR结果显示SaFPS基因在花中表达量较高,果实、茎、叶中表达量相对较低.结论 首次从红树林植物杯萼海桑中克隆FPS基因获得其编码区序列,SaFPS基因具有组织表达特异性.本研究为分析基因表达特性及其在生物合成中的功能奠定基础.     

鱼腥草HMGR基因cDNA克隆、差异表达及蛋白质结构分析

目的克隆鱼腥草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法获得HMGR基因cDNA序列并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用RT-PCR方法检测HMGR基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因cDNA全长为1 626 bp,编码541个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在鱼腥草的花中表达,其他器官中表达相对较低,地下茎中表达量最低。结论首次从鱼腥草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的作用奠定基础。     

西洋参β-香树脂合成酶基因的克隆和生物信息学分析

目的 克隆西洋参三萜皂苷生物合成途径关键酶β-香树脂合成酶(bAS)全长cDNA,为研究西洋参皂苷生物合成与次生代谢调控奠定基础.方法 采用大规模ESTs测序和cDNA末端扩增(RACE)技术克隆西洋参bAS基因.结果 获得了西洋参bAS基因全长cDNA,命名为PqbAS(GenBank注册号:JX185490),其核苷酸序列长度为2 309 bp,含有1个开放阅读框,编码631个氨基酸多肽.保守结构域搜索显示PqbAS含有环氧角鲨烯环化酶(OSCs)共有的活性位点和保守基序.Singal P4.0分析表明PqbAS属于非分泌型蛋白,Tmhmm 2.0分析表明其为非跨膜蛋白.实时荧光定量PCR显示PqbAS基因在各个器官中均有表达,在花和幼茎中高表达,根和叶中表达量相对较低.结论 首次克隆了PqbAS基因全长序列,为研究其表达特性以及在三萜皂苷生物合成中的功能奠定了基础.     

高良姜查尔酮合成酶基因的生物信息学和表达分析

目的获取高良姜查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）编码基因cDNA 序列,明确其序列和功能特征 以及在高良姜中的表达模式。方法在前期高良姜转录组测序数据中挖掘CHS 的cDNA 全长及其编码区,利 用生物信息学方法对该基因蛋白的特征和功能进行分析,运用ClustalX1.83 和MEGA4.0 软件进行同源性比对 和系统进化树构建,采用实时荧光定量PCR（qPCR）分析CHS 在高良姜不同组织中的表达差异。结果高良姜 CHS 编码区为1 173 bp,编码391 个氨基酸。其编码蛋白是分子量为94.5 kDa 的亲水性蛋白,不含有信号 肽、转运肽、靶肽和跨膜结构域,具有CHS 保守功能域并归属于CHS 超级家族。CHS 在高良姜不同组织中的 表达模式为：根茎> 茎> 叶。结论成功获得高良姜CHS 序列,并分析其特征和表达模式,可为高良姜黄酮 类有效成分的生物合成研究提供参考。     

蛇足石杉HsCAS1基因克隆及序列分析

本研究对蛇足石杉(Huperzia serrata)环阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)基因HsCAS1编码区进行克隆及序列分析。根据本实验室已获得的蛇足石杉转录组数据,从中获得1条具有环氧角鲨烯环化酶保守结构域的编码CAS的转录本,采用RT-PCR方法获得该基因的编码区序列,并对HsCAS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。利用实时荧光定量PCR方法检测HsCAS1基因在蛇足石杉的根、茎、叶中的表达情况。序列分析表明,所克隆的HsCAS1基因编码区长为2,271 bp,编码756个氨基酸残基,HsCAS1与紫果冷杉(Abies magnifica)的CAS具有61%的序列相似性。生物信息学预测HsCAS1蛋白含有3个跨膜区,具有萜类环化酶等保守结构域,不含信号肽。HsCAS1在蛇足石杉的根中表达丰度高于茎和叶。本研究在国内外首次获得蛇足石杉HsCAS1基因的编码区序列,为进一步研究HsCAS1在石杉科植物甾醇合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定基础。     

雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0~72 h TwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。     

冬凌草AACT基因的克隆与表达分析

目的:克隆冬凌草乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因并分析其在冬凌草不同组织中的表达模式。方法:在冬凌草转录组测序的基础上设计特异引物,采用逆转录PCR技术克隆冬凌草IrAACT基因全长,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR法分析其组织表达模式。结果:克隆得到的IrAACT基因全长1 254 bp,编码417个氨基酸,该序列与丹参等植物中的AACT基因有较高的同源性。生物信息学预测IrAACT具有Ⅱ型硫解酶催化作用的活性中心结构域。实时荧光定量PCR表明,IrAACT在冬凌草花和叶中的表达量明显高于根、茎和愈伤组织。结论:该研究获得了IrAACT基因的全长cDNA序列,并揭示了其在不同组织中的表达差异,为进一步阐述该基因在冬凌草二萜类成分合成途径中的功能奠定了基础。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

灰毡毛忍冬LmPAL1基因的克隆及表达分析

目的克隆灰毡毛忍冬苯丙氨酸解氨酶(LmPAL1)基因全长序列,并进行生物信息学和表达模式分析。方法提取灰毡毛忍冬花总RNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和RACE技术克隆LmPAL1基因的全长cDNA序列;运用相关软件对该基因序列进行生物信息学分析;利用qRT-PCR测定灰毡毛忍冬茎、叶和不同花期花中该基因的相对表达量。结果克隆的LmPAL1基因开放阅读框(ORF)长度为2 145 bp,编码714个氨基酸,生物信息学分析预测为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,包含PAL shielding结构域(527～641 aa),并且含有PAL/HAL活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG(196～212aa),与其他LmPAL1具有较高的相似度;LmPAL1基因q RT-PCR结果显示,7个花期材料以金黄色开花期相对表达量较高;与茎、叶比,白色花蕾期花的相对表达量最高,叶的最低。结论成功克隆了LmPAL1基因,为进一步研究该基因的功能以及遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定基础,同时为探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。     

翼首草鲨烯合酶（PhSQS2）全长克隆、表达特性分析及蛋白功能验证

目的 从匙叶翼首草Pterocephalus hookeri转录组中挖掘参与三萜合成的鲨烯合酶（squalene synthase,SQS）并研究其作用机制。方法 以翼首草基原植物匙叶翼首草为研究对象,基于前期转录组数据筛选克隆PhSQS2基因,并进行生物信息学分析;通过烟草瞬时转化实验观察PhSQS2亚细胞定位情况,利用实时荧光定量PCR分析PhSQS2在不同器官中的表达特征;构建原核表达载体经体外酶促反应鉴定PhSQS2功能。结果 PhSQS2基因开放阅读框（open reading frame,ORF）区域全长1242 bp编码414个氨基酸,蛋白相对分子质量为47 400,理论等电点为6.57,总平均疏水性为-0.075,为不稳定蛋白。PhSQS2主要定位在细胞核和细胞质中;组织分布具有特异性,在根和叶中均有表达,叶中表达量显著高于根中。体外酶促实验证明PhSQS2催化法尼基焦磷酸生成鲨烯。结论 PhSQS2的功能鉴定为解析翼首草中萜类物质生物合成途径,提高三萜皂苷类成分含量及优质种质资源筛选培育提供了前期理论基础。     

马蓝色氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

目的 克隆马蓝Baphicacanthus cusia吲哚类生物碱合成途径的色氨酸合成酶（tryptophan synthase，TSB）基因，命名为BcTSB（GenBank登录号AYM45644.1），对其生物信息学和表达进行分析。方法 基于前期马蓝转录组数据库，获得BcTSB基因开放阅读框（ORF），运用生物信息学手段对基因功能做出初步预测，构建pET32a-BcTSB原核表达载体，并转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测马蓝不同组织（根、茎、叶）中TSB表达水平。结果 克隆的BcTSB基因ORF长度为1 452 bp，编码483个氨基酸，生物信息学预测为亲水性蛋白，定位于叶绿体，该蛋白相对分子质量为51 665.89，pET-32a载体包含18 000的标签。SDS-PAGE分析在70 000处出现目的蛋白条带，与理论预期值大小一致。qRT-PCR分析显示BcTSB基因在马蓝不同组织中均有表达，且在茎中的表达量最高。结论 通过对BcTSB基因的克隆及表达分析，为进一步研究该基因功能及调控奠定了实验基础。     

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究.方法 采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性.结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性.结论 首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达.     

人参质体ATP/ADP转运蛋白基因PgAATP1的克隆及表达分析

目的克隆人参Panax ginseng中质体ATP/ADP转运蛋白基因(ATP/ADP transporter protein,AATP),为深入研究其在人参中的生物学功能奠定基础。方法利用人参14个组织部位转录组测序的转录组数据库,通过与NCBI下载的其他植物中AATP的m RNA序列进行本地Blast比对,从中筛选出质体ATP/ADP转运蛋白基因。利用PCR技术克隆获得该基因的全长,通过生物信息学软件分析该基因编码蛋白的信息。利用人参14个组织部位的转录组数据库分析该基因在人参不同组织中的表达模式,并利用实时荧光定量PCR检测茉莉酸甲酯处理条件下该基因的表达模式。结果获得人参AATP1基因全长c DNA,命名为Pg AATP1,该基因长度为1 866 bp,编码621个氨基酸,蛋白质相对分子质量为67 897.23,等电点为9.58。该蛋白与其他物种中的质体ATP/ADP转运蛋白比较类似,分析发现Pg AATP1在人参中所有组织中表达量均比较高,在果肉和叶片中表达量最高。实时荧光定量PCR检测发现Pg AATP1基因在茉莉酸甲酯处理条件下表达持续上调。结论获得Pg AATP1基因全长cDNA序列,该基因在淀粉合成旺盛的组织中表达量较高,且响应茉莉酸甲酯处理。     

白花丹参丙酮酸脱羧酶基因的克隆和表达分析

目的 获得白花丹参丙酮酸脱羧酶(SmPDC)全长基因,分析该基因在白花丹参不同组织部位,以及缺氧胁迫处理后的该基因表达差异.方法 利用cDNA文库筛选获得SmPDC基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmPDC基因在白花丹参不同部位的表达情况,及缺氧处理条件下的表达情况.结果 获得的SmPDC基因由2 190个核苷酸组成,编码605个氨基酸,蛋白相对分子质量药6.485×104,等电点pI 5.49;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎和叶;缺氧胁迫处理会诱导该基因的表达,随胁迫时间延长表达量逐渐增加.结论 白花丹参SmPDC基因是PDC家族新成员,其功能与植物耐缺氧代谢途径有关.     

三七香叶基香叶基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

基于三七转录组测序结果,选择萜类代谢骨架上香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(GGPPS),结合RACE技术,克隆得到全长1 203 bp的cDNA序列,最长开放阅读框为1 035 bp,命名为PnGGPPS,GeneBank登录号为KM486564,PnGGPPS基因全长2 370 bp,包含1个内含子和2个外显子,该基因编码344个氨基酸,与蓖麻Ricinus communis、丹参Salvia miltiorrhiza等植物GGPPS的同源性达到73%以上,具有富天冬氨酸区等多个结构域,属于类异戊二烯合成酶超家族。实时荧光定量PCR结果显示,PnGGPPS在一至三年生三七的根、茎、叶和三年生的花等不同器官组织中均有表达,但以三年生叶中具有显著水平的高表达量,暗示其既具有调节三七生长发育的基本功能,也与三七叶绿素和类胡萝卜素的合成、叶绿体的发育、阴生适应性,以及品质的形成有关。     

浙贝母FPS基因的克隆及其在生物碱代谢中的调控作用研究

目的克隆出浙贝母法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因,并对其表达量与生物碱积累量之间的相关性进行分析,以探究FPS基因在浙贝母生物碱合成代谢过程中的调控作用。方法本研究采用RACE技术克隆出浙贝母FPS基因的全长序列;以浙贝母狭叶、宽叶和新梅园3个品种6个组织及10个不同发育时期的新鳞茎为材料,采用RT-qPCR和HPLC-ELSD技术分别测定了FPS基因的表达量与生物碱(浙贝甲素和浙贝乙素)的量,并对其进行相关性分析。结果 FPS基因cDNA序列全长1 629 bp,开放阅读框为1 056 bp,编码351个氨基酸;3个不同浙贝母品种中FPS基因组织特异性表达趋势相同,花中的表达量最高,其次为新鳞茎;不同发育时期新鳞茎FPS基因表达量与生物碱量相关性分析显示,在宽叶和新梅园品种中,FPS基因表达量与浙贝甲素、浙贝乙素量均具有明显的正相关性(相关系数分别为0.289、0.613,0.427、0.622),但在狭叶品种中,该相关性相对较低(0.054、0.236);狭叶、宽叶和新梅园3个品种不同组织中FPS基因表达量与生物碱量具有正相关性(相关系数分别为0.057、0.476,0.085、0.495,0.375、0.432)。结论本研究成功克隆出浙贝母FPS基因的全长序列,FPS基因参与了浙贝母生物碱的合成代谢调控。