丹参转录因子SmbHLH1基因的克隆和表达分析

目的:获得丹参转录因子SmbHLH1全长基因,分析SmbHLH1基因在丹参不同组织部位,以及不同诱导子处理后的表达差异.方法:利用RT-PCR等技术获得SmbHLH1基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmbHLH1基因在丹参不同部位的表达情况,及在不同处理条件下的表达情况.结果:获得的SmbHLH1基因由999个核苷酸组成,编码332个氨基酸,蛋白相对分子质量约36 kDa;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎,在叶和花中有微量表达;茉莉酸甲酯,以及酵母提取物和Ag+共同诱导,会抑制该基因的表达,水杨酸和脱落酸对该基因的影响不大.结论:丹参SmbHLH1基因是bHLH家族新成员,其功能可能与油菜素内酯信号途径有关.     

白花丹参Cu/Zn SOD基因的克隆和表达分析

目的:获取白花丹参Cu/Zn SOD基因的全长cDNA序列,并分析其序列特征和不同外源胁迫下的表达特征。方法:利用已有白花丹参cDNA全长文库,随机测序获得SmCu/Zn SOD全长序列。BLAST进行序列比对,Motif Scan软件分析氨基酸序列的功能区段,RT-PCR技术分析基因表达特征。结果:获得ORF为459 bp的SmCu/Zn SOD全长cDNA序列,编码氨基酸152个,氨基酸序列分析发现其具有典型的Cu/Zn SOD PROSITE pattern,RT-PCR分析其在叶片中表达量最高。水分亏缺、盐胁迫、低温和ABA处理均能较强的诱导该基因的表达。结论:本研究首次获得白花丹参Cu/Zn SOD全长基因序列,该基因可能参与对干旱、盐碱和低温等非生物胁迫的抵抗。     

白花丹参顺式还原酮加双氧酶基因的克隆、 分子特征和表达调控分析

目的:获得白花丹参参与乙烯和多胺合成的顺式还原酮加双氧酶(acireductone dioxygenase,ARD)基因(命名为SmARD)序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究.方法:利用全长cDNA文库技术,从两年生白花丹参根中获得目的基因SmARD序列.利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找该基因的开放读码框,prosite分析蛋白质的基本结构域.用半定量RT-PCR检测其在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花中的表达情况.结果:得到688 bp的SmARD基因全长序列.具有一个591 bp的开放读码框,编码196个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量23.27 kDa.使用预测的SmARD蛋白序列在NCBI中进行蛋白保守域分析,发现SmARD与ARD/ARD'家族具有很高的同源性.半定量RT-PCR表明,SmARD在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花等组织中均有转录水平的表达,但是在根部表达最强.水分亏缺处理3 d,150 mmol·L-1 NaCl处理1 d,4℃低温处理1 d和100 μmol·L-1 ABA处理1 d均抑制SmARD的表达,100 μmol·L-1茉莉酸甲脂(MJ)和10 μmol·L-1乙烯利(ETH)处理1 d诱导SmARD的表达.结论:首次得到白花丹参的顺式还原酮加双氧酶(ARD)基因序列,为其参与白花丹参响应逆境和次生代谢产物合成的信号调节功能研究奠定了基础.     

丹参功能基因组学研究Ⅳ——丹参乙烯应答因子(ERF)基因的分析

目的:获得丹参乙烯应答因子结合蛋白基因序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究.方法:利用cDNA芯片技术,从不同时期毛状根中获得目的基因.利用BLAST进行序列比对,ORF finder寻找开放读码框,Pmsite分析蛋白质的基本结构域.用半定量RT-PCR检测其在丹参组培苗根、茎、叶中的表达情况.结果:得到1个乙烯应答因子结合蛋白基因全长序列,全长952 bp,具有1个699 bp的开放读码框和87 bp的5'非编码区、166 bp的3'非编码区,推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的AP2/ERF DNA结合域,GenBank EF667000,命名为SmERF.半定量RT-PCR表明,SmERF基因在丹参组培苗根、茎、叶中均有转录水平的表达,根中表达量高于茎和叶中的.结论:首次得到丹参乙烯应答因子结合蛋白基因,为其功能研究提供了基础.     

丹参功能基因组学研究Ⅲ——丹参金属硫蛋白MT-2基因的分析

目的：获得丹参金属硫蛋白基因序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究。方法：利用cDNA芯片技术,从不同时期毛状根中获得目的基因。利用BLAST进行序列比对,ORF finder寻找开放读码框,Prosite分析蛋白质的基本结构域。用半定量RT-PCR检测其在丹参组培苗根、茎、叶中的表达情况。结果：得到2个MT基因全长序列,分别编码80和79个氨基酸,具有Type 2型金属硫蛋白的典型特征,分别命名为SmMT-2a和SmMT-2b,两者具有71.25%的同源性。半定量RT-PCR表明,MT基因在丹参组培苗根、茎、叶中均有转录水平的表达,叶中表达量高于根和茎。结论：首次得到丹参金属硫蛋白基因,为其功能研究提供了基础。     

丹参功能基因组学研究Ⅳ.丹参乙烯应答因子(ERF)基因的分析

目的：获得丹参乙烯应答因子结合蛋白基因序列，并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究。方法：利用cDNA芯片技术，从不同时期毛状根中获得目的基因。利用BLAST进行序列比对，ORF finder寻找开放读码框，Prosite分析蛋白质的基本结构域。用半定量RT-PCR检测其在丹参组培苗根、茎、叶中的表达情况。结果：得到一个乙烯应答因子结合蛋白基因全长序列，全长952 bp，具有一个699 bp的开放读码框和87 bp的5′非编码区、166 bp的3′非编码区，推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的AP2/ERF DNA结合域，GenBank EF667000，命名为SmERF。半定量RT-PCR表明，SmERF基因在丹参组培苗根、茎、叶中均有转录水平的表达，根中表达量高于茎和叶中的。结论：首次得到丹参乙烯应答因子结合蛋白基因，为其功能研究提供了基础。     

丹参F3'5'H基因克隆及其序列分析

目的:为了验证丹参类黄酮-3′,5′-羟基化酶(Flavonoid 3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)基因与丹参花色表型的相关性,本研究克隆并分析了紫花丹参99-3株系和一些白花丹参中的F3′5′H基因。方法:本研究通过提取紫花丹参和白花丹参中的总RNA,再将其反转录得到cDNA,以此cDNA为模板,利用PCR方法扩增获得F3′5′H基因全长序列。再利用生物信息学分析方法,分析了该基因编码蛋白质的理化性状、结构域、系统进化等特点,并预测了该蛋白质的亚细胞定位、跨膜区等;利用实时定量PCR方法检测了该基因的表达特异性;利用毛状根遗传转化方法获得了该基因的过表达阳性毛状根株系。结果:F3′5′H基因全长1551 bp,编码516个氨基酸,相对分子质量为57.4 kDa。该基因在丹参花中高丰度表达。在42份(紫花25份;白花17份)丹参样品中发现一个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)位点在紫花和白花丹参中呈现与花色相关的稳定变化。系统发育分析表明丹参F3′5′H与美女樱的F3′5′H具有较高序列同源性。获得了过表达F3′5′H的毛状根株系。结论:本研究在丹参中克隆到F3′5′H基因,对其序列进行了分析,为进一步研究丹参F3′5′H基因的功能奠定基础。     

丹参ERF转录因子SmERF1基因的表达分析和亚细胞定位

目的:对前期已经克隆的丹参SmERF1基因进行聚类分析,分析SmERFI基因在不同诱导子处理后不同时间的表达情况;并对其进行亚细胞定位分析.方法:利用MEGA5软件对SmERF1基因及拟南芥ERF基因家族进行聚类分析;利用半定量RT-PCR方法,分析SmERF1基因在不同诱导子处理后不同时间的表达情况;将SmERF1与GFP融合,在洋葱表皮瞬时表达,以确定SmERF1蛋白表达部位.结果:丹参SmERF1属于ERF家族第Ⅶ亚族;YE+ Ag+诱导对SmERF1基因的表达没有影响,ABA和MeJA可以抑制该基因的表达,而水杨酸诱导会出现先抑制,后随处理时间加长,SmERF1基因表达又恢复;亚细胞定位确定SmERFI基因在细胞核内特异表达.结论:SmE RF是一个AP2/ERF转录因子,属于AP2/ERF家族第Ⅶ亚族,其表达受ABA,SA,MeJA等激素调节控制.     

丹参晚期胚胎富集蛋白基因的克隆及表达模式分析

目的克隆丹参晚期胚胎富集蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法对丹参转录组数据库进行BLAST同源性比对,发现一条新的与LEA基因家族同源性较高的序列,命名为Sm LEA2,Gen Bank登录号为HQ676610。进一步利用PCR和RT-PCR技术从丹参g DNA以及c DNA水平克隆得到了Sm LEA2基因全长。采用软件分析蛋白质结构性质和系统进化关系。利用实时荧光定量PCR的方法对不同部位、不同发育时期以及不同处理丹参的Sm LEA2表达量进行检测。结果获得Sm LEA2 g DNA长1 961 bp,由1个外显子和1个内含子组成,并且内含子位于ATG的上游;开放阅读框长为960 bp,共编码319个氨基酸。生物信息学分析显示,Sm LEA2是存在于细胞质中的亲水蛋白,无跨膜结构域和信号肽,其相对分子质量为35 340,等电点为4.77。该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达,并且在茎中的表达量最高。随着花的成熟和种子的发育,该基因表达量逐渐升高,并且该基因的表达受茉莉酸甲酯(Me JA)以及脱落酸(ABA)的诱导作用影响。结论克隆得到的丹参Sm LEA2可能参与种子发育过程,并在丹参防御反应中发挥作用。     

人参质体ATP/ADP转运蛋白基因PgAATP1的克隆及表达分析

目的克隆人参Panax ginseng中质体ATP/ADP转运蛋白基因(ATP/ADP transporter protein,AATP),为深入研究其在人参中的生物学功能奠定基础。方法利用人参14个组织部位转录组测序的转录组数据库,通过与NCBI下载的其他植物中AATP的m RNA序列进行本地Blast比对,从中筛选出质体ATP/ADP转运蛋白基因。利用PCR技术克隆获得该基因的全长,通过生物信息学软件分析该基因编码蛋白的信息。利用人参14个组织部位的转录组数据库分析该基因在人参不同组织中的表达模式,并利用实时荧光定量PCR检测茉莉酸甲酯处理条件下该基因的表达模式。结果获得人参AATP1基因全长c DNA,命名为Pg AATP1,该基因长度为1 866 bp,编码621个氨基酸,蛋白质相对分子质量为67 897.23,等电点为9.58。该蛋白与其他物种中的质体ATP/ADP转运蛋白比较类似,分析发现Pg AATP1在人参中所有组织中表达量均比较高,在果肉和叶片中表达量最高。实时荧光定量PCR检测发现Pg AATP1基因在茉莉酸甲酯处理条件下表达持续上调。结论获得Pg AATP1基因全长cDNA序列,该基因在淀粉合成旺盛的组织中表达量较高,且响应茉莉酸甲酯处理。     

丹参中转录因子SmMYB87基因的克隆、亚细胞定位和表达分析

目的克隆丹参Salvia miltiorrhiza中第14亚群R2R3 MYB转录因子基因SmMYB87的全长序列,并对其进行生物信息学和表达分析。方法以丹参总RNA为模板,利用同源克隆和c DNA快速扩增(RACE)技术获得SmMYB87 cDNA全长序列。运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析,利用q RT-PCR测定SmMYB87在各器官中的表达并构建融合表达载体pTF-486-SmMYB87分析SmMYB87蛋白的亚细胞定位。结果 SmMYB87基因含有2个内含子和1个732 bp的开放阅读框(ORF),编码243个氨基酸。该基因在根、茎、叶和花中均有表达,且4个器官中的表达量没有显著差异。SmMYB87蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布。结论 SmMYB87的序列结构和表达分析为进一步研究其在丹参中的生物学作用奠定了理论基础。     

丹参转录因子SmbHLH93的克隆及表达模式分析

目的 克隆丹参碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子SmbHLH93,并初步探究该基因的功能.方法 采用PCR和RT-PCR技术分别从DNA和cDNA水平克隆得到了SmbHLH93基因,进一步通过BD Walking获得了该基因的5'启动子区.生物信息学分析SmbHLH93蛋白的理化性质、结构特点和系统进化关系.结合启动子区分析软件和qPCR,研究SmbHLH93在丹参不同部位和环境诱导下的表达模式.结果 获得SmbHLH93基因序列954 bp和5'启动子区1 583 bp,其中开放阅读框(ORF)657 bp,有3个内含子和4个外显子,编码218个氨基酸,含有bHLH和ACT_UUR-ACR-like结构域,无跨膜区域,可能定位于细胞核.表达模式分析结果显示该基因的表达量在根中最高,茎中最低,且随着花的形成逐渐降低.光和低温诱导SmbHLH93的高表达,而水杨酸(SA)抑制其表达.结论 克隆得到丹参bHLH类转录因子新成员SmbHLH93,初步预测其参与了丹参花的发育过程和丹参次生代谢途径的调控.     

丹参转录因子SmWRKY14基因的克隆及表达分析

目的 克隆丹参Salvia miltiorrhiza转录因子基因SmWRKY14，分析其在不同组织及应答环境因子和植物激素过程中的表达特征。方法 以丹参转录组数据中Unigene（c50007_g1）序列为参考，利用PCR扩增获得SmWRKY14基因序列。通过生物信息软件及在线工具预测基因编码蛋白的理化性质、蛋白质结构等分子特征，采用DNAMAN和MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建，运用实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式。结果 克隆得到SmWRKY14基因cDNA全长1 103 bp，编码244个氨基酸，相对分子质量27 600，等电点8.19。该蛋白含有WRKY特征基序，不含信号肽及跨膜结构域，其高级结构主要由无规卷曲构成。进化树分析表明SmWRKY14蛋白与柿WRKY14蛋白的亲缘关系最近。SmWRKY14基因在丹参中各器官中为组成型表达，且该基因与丹参酮合成关键酶基因DXS、GGPPS、CPS的表达模式相似，且受茉莉酸甲酯、脱落酸、赤霉素等植物激素及机械损伤的强烈诱导。结论 获得丹参SmWRKY14基因序列、生物信息及表达特征，为研究WRKY家族成员调控丹参酮类化合物的合成、应答植物激素及参与防御反应的分子机制提供理论依据。     

2个丹参鲨烯合酶基因的克隆和鉴定

目的 克隆与鉴定丹参Salvia miltiorrhiza鲨烯合酶基因。方法 基于丹参基因组的基因预测结果设计引物,通过RT-PCR方法,克隆丹参鲨烯合酶基因。利用生物信息软件对基因序列进行了结构分析,对基因编码多肽进行了序列同源性比较和保守结构域分析,利用实时定量RT-PCR方法对基因进行表达模式研究。结果 通过RT-PCR方法扩增得到2个丹参鲨烯合酶基因（SmSQS1和SmSQS2）,它们编码的多肽具有鲨烯合酶相关结构域和保守基序。这2个基因具有不同的外显子/内含子结构特征,具有不同的组织特异性表达模式和时间表达模式。结论 丹参基因组中存在2个鲨烯合酶基因,它们具有不同的基因结构特征和表达模式,可能在丹参甾体类和三萜类化合物生物合成中起不同作用。     

一个新的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶3基因的克隆及其表达分析

目的:对丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR3)基因的cDNA克隆并进行序列分析。方法:利用丹参转录组文库克隆一种新的丹参次生代谢途径上的功能基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Clustal W比对丹参中已有的3条HMGR的氨基酸序列,构建系统进化树,QRT-PCR检测丹参HMGR3基因在根、茎、叶中的mRNA水平,并检测Ag+诱导子诱导后丹参毛状根中该基因的转录水平。结果:克隆得到一个新的丹参HMGR3基因,该基因ORF全长1 692 bp,编码563个氨基酸,具有HMGR基因家族的特征序列,与SmHMGR1和SmH-MGR2分别具有75.04%,80.64%的同源性,QRT-PCR分析表明该基因在丹参根茎叶中均有表达,在叶中表达量最高,Ag+诱导24 h时mRNA水平达到最高值。结论:首次克隆得到了1条新的丹参HMGR家族基因SmHMGR3,这一结果为进一步研究丹参次生代谢途径提供了新的思路和靶点。     

丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析

目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析.方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平.结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53;实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到最高值.结论:从丹参毛状根中克降得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因.     

丹参NAC基因家族全基因组鉴定及表达研究

目的 基于基因组数据鉴定丹参NAC家族转录因子（SmNACs）基因,并对其进行生物信息学与表达模式分析,为进一步深入阐明其基因功能提供依据。方法 从丹参基因组数据库中鉴定出SmNACs基因,运用生物信息学方法及在线工具分析其结构特征,启动子顺式作用元件,编码蛋白的理化性质、亚细胞定位等,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定SmNACs基因在丹参受到茉莉酸甲酯（MeJA）胁迫时的表达模式。结果 从丹参的基因组中共确定了84个SmNACs基因（SmNAC01~SmNAC84）,不均等分布于8条染色体上,编码蛋白的氨基酸长度为120~794 aa,等电点为4.27~10.28;基因结构显示SmNACs基因基本都含有1~10个内含子;上游启动子含有与激素、逆境胁迫应激相关的ABRE、MBS、ARE、LTR、CGTCA-motif、TGACG-motif等顺式作用元件;构建丹参、南丹参与拟南芥的NAC家族成员的系统发育树,将84个SmNACs基因分为23个亚族。转录组数据显示SmNACs基因在丹参不同组织中差异表达,其中7个SmNACs基因在根中的表达水平较高;MeJA处理后,17个SmNACs基因表达水平明显上调,20个SmNACs基因表达水平明显下调。qRT-PCR表达分析发现,MeJA处理后,12个SmNACs基因的表达模式随着激素处理时间的增加呈现上调或下调的趋势,SmNAC09、SmNAC15、SmNAC16受MeJA诱导后48 h表达水平显著上调,SmNAC20、SmNAC77、SmNAC78受MeJA诱导表达水平下调。结论 研究结果为进一步解析SmNACs基因在丹参逆境响应及次生代谢产物生物合成中的调控机制提供了参考。     

基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对丹参基因表达的调控

目的对丹参进行转录组测序,分析丹参不同组织响应适度干旱胁迫的分子机制。方法以栽培4个月的丹参为材料,设置适度干旱胁迫组(土壤相对含水量55%～60%)和对照组(土壤相对含水量75%～80%),应用IlluminaHi Seq2000分别对根和叶进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)筛选和共表达网络分析等。结果转录组测序共获得58085条Unigene。其中28846条被注释,根和叶中的DEGs分别有1853、1457个。GO富集结果表明,丹参根和叶中的DEGs在GO功能部位中的分布基本一致,均在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。KEGG途径富集分析表明,根中DEGs显著富集在DNA复制、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用、胡萝卜素合成等途径,叶中DEGs则主要富集在氨基酸、生物碱、苯丙烷类生物合成等途径。适度干旱胁迫能促进丹参叶中苯丙烷类、根中萜类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进丹参有效成分累积的基础。AP2/ERF、b HLH、b ZIP、WRKY、MYB类转录因子在根和叶中差异表达均较显著,基因共表达网络分析预测了在适度干旱胁迫下可能参与调控萜类基因表达的转录因子。结论通过高通量转录组测序,揭示了适度干旱胁迫对丹参不同组织基因表达的调控特征,可为深入研究丹参药效成分的生物合成机制和在栽培中的合理灌溉提供科学依据。