丹参酮生物合成相关SmERF108转录因子的鉴定及其靶基因分析＊

目的 鉴定与丹参酮合成相关转录因子AP2/ERF家族中SmERF108转录因子，并分析转录因子SmERF108的靶基因。方法 利用生物信息学在线分析平台如NCBI、PFAM等分析SmERF108的序列特征；MEGA-X软件用于构建SmERF108与不同功能转录因子的系统进化树；拟南芥原生质体转化法鉴定SmERF108蛋白的亚细胞定位；通过实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）对SmERF108基因在丹参不同器官和组织差异表达进行检测；利用酵母体系对SmERF108的转录激活活性进行探究并用酵母单杂技术确定其靶基因。结果 SmERF108具有典型的AP2/ERF保守结构域，属于ERF-B3亚组，系统进化树和保守基序分析显示SmERF108与丹参中SmERF128、青蒿中AaERF2亲缘关系较近且保守基序分布一致；亚细胞定位显示SmERF108蛋白定位于细胞核；SmERF108基因在周皮中表达最高，且呈现周皮（R1）>韧皮部（R2）>木质部（R3）的规律；酵母自激活验证SmERF108具有转录激活活性，同时酵母单杂交确认其能与关键酶基因SmCPS1启动子结合。结论 鉴定到丹参中一个新转录因子SmERF108，生物信息学分析及差异表达分析预测与丹参酮合成相关，分子互作初步证实靶基因为SmCPS1二萜环化酶。     

北细辛AhWRKY33基因的克隆及其拟南芥遗传转化

根据北细辛全长转录组测序数据,选择在植物形态发生及应对逆境胁迫中发挥重要作用的WRKY家族基因,用在模式植物拟南芥中调控抗毒素camalexin合成的AtWRKY33比对同源基因,设计引物,以北细辛叶总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增得到AhWRKY33基因开放阅读框(ORF)片段,实时荧光定量PCR结果表明其在北细辛地上和地下部分有显著的表达差异,AhWRKY33在毒性成分马兜铃酸含量较根中高的叶片中有较高的表达量。经验证,北细辛WRKY33基因ORF全长1 686 bp,编码561个氨基酸。北细辛WRKY33有2个保守的WRKYGQK结构域,按经典的分类方法来说,属于Ⅰ组WRKY转录因子,与其他物种氨基酸具有一定的同源性。该研究成功构建植物真核表达载体PHG-AhWRKY33并转化拟南芥,经过PCR检测和潮霉素(Hyg)抗性平板的筛选获得了转基因拟南芥。发现加快了转基因拟南芥种子的萌发,提高了植株的抗逆性。这为继续深入分析WRKY转录因子在北细辛生长发育和次生代谢产物合成中的功能奠定了基础。     

红花查耳酮异构酶基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

目的构建红花查耳酮异构酶(CHI)基因的植物表达载体并在拟南芥中进行超表达验证该基因的功能。方法将已经分离的红花CHI基因作为目的基因,在其两端引入Bam H I和Eco R I酶切位点,构建含有35S启动子的植物超表达载体p BASTA-CHI,通过Flora-dip法将其转化到拟南芥中,并对转基因拟南芥T2代植株进行PCR和总黄酮量检测。结果转基因拟南芥T2代植株的PCR检测,红花CHI基因已经初步整合到拟南芥基因组中,黄酮量检测表明,转红花CHI基因的拟南芥比野生型拟南芥中的黄酮量有所提高,最高提高到2.3倍。结论成功构建了含有红花CHI基因的植物表达载体,并在拟南芥中进行超表达,获得了转基因拟南芥T2植株。     

球松素查尔酮对C3H10T1/2细胞成脂分化的影响

查尔酮类化合物是一种广泛存在于多种药用植物中的黄酮类化合物,具有抑制细胞成脂分化的作用。为研究山核桃叶中提取分离得到的球松素查尔酮对小鼠胚胎间充质干细胞(C3H10T1/2)成脂分化的影响,该实验利用MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,内盐]法检测细胞增殖情况;油红O染色和异丙醇萃取法检测细胞成脂分化情况;GAP-PAP酶法检测细胞中甘油三酯含量;分别采用荧光RT-PCR和Western blot检测成脂分化关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ),CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)和分化标志物脂肪型脂肪酸结合蛋白(FABP4)mRNA和蛋白表达。结果显示当球松素查尔酮浓度小于等于50μmol·L~(-1),对C3H10T1/2细胞的增殖活性无影响;油红O染色和异丙醇萃取法及GAP-PAP酶法检测结果表明球松素查尔酮能明显减少C3H10T1/2细胞成脂分化和甘油三酯含量;荧光RT-PCR和Western blot检测表明球松素查尔酮能下调FABP4,PPARγ和C/EBPαmRNA和蛋白的表达(P0.05或P0.01)。结果提示,球松素查尔酮能够明显抑制C3H10T1/2细胞成脂分化。     

虎杖查耳酮合酶基因RNAi载体的构建及其遗传转化

目的构建虎杖查耳酮合酶(Pc CHS1)基因的RNA干涉(RNAi)表达载体,获得Pc CHS1表达下调的转基因虎杖植株。方法根据Gen Bank中已知的Pc CHS1基因序列(EF090604),设计相应引物,克隆Pc CHS1基因核心保守序列。以Pc CHS1基因为靶基因,将长度574 bp保守序列片段通过正、反2个方向插入表达载体p YLRNAi中,构建RNAi表达载体p YLRNAi-Pc CHS1。通过根癌农杆菌介导法将其导入虎杖茎尖组织。对获得的转基因植株,利用Northern blotting检测Pc CHS1基因表达水平,并应用HPLC法测定虎杖中白藜芦醇苷的量。结果成功构建Pc CHS1基因RNA干涉表达载体,获得了5株转Pc CHS1基因干涉载体的阳性植株。转基因虎杖Pc CHS1基因表达水平显著下调,并且转基因植株中白藜芦醇苷量均得到显著提高,其中最高量是对照植株的3.8倍(P0.05)。结论成功获得了干涉Pc CHS1基因表达下调的转化植株,抑制Pc CHS1基因的表达显著增加了转基因虎杖中白藜芦醇苷的量,为有效利用该基因提高虎杖白藜芦醇苷量奠定基础。     

茯苓基因组中MYB转录因子基因家族鉴定及表达分析

目的 从全基因组水平挖掘茯苓Poria cocos MYB转录因子基因家族成员,并分析其在菌丝、菌核等部位及茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）诱导后菌丝中的表达模式,以期发现与茯苓发育及次生代谢物生物合成调控相关的MYB转录因子。方法 基于茯苓基因组数据,通过序列比对及保守结构域分析挖掘MYB转录因子基因,利用ExPASy在线工具预测分析MYB蛋白质理化性质,利用MEGA7.0软件构建茯苓MYB蛋白进化树,利用MEME在线工具分析保守基序,利用Plant CARE进行启动子区顺式作用元件分析,通过MeJA诱导菌丝并采用qRT-PCR方法检测基因相对表达量。结果 在茯苓基因组中共鉴定到10个含有特征性保守结构域的MYB转录因子,其中4个属于1R类型,4个属于2R类型,2个属于4R类型。进化树及保守基序显示,相同进化枝的MYB蛋白所含基序类型相似。启动子区预测分析发现了多类激素及逆境响应顺式作用元件。基因表达谱分析显示有2个基因（PcMYB7和PcMYB8）在菌丝中的表达量高于菌核中的表达量,而PcMYB9则是在菌核中表达量相对较高。MeJA诱导后,有3个基因（PcM...     

珍珠水解液的美白作用机理研究

目的:通过人的黑色素细胞实验研究珍珠水解液的美白作用机理。方法:NaOH法测定黑色素细胞黑色素含量,实时荧光定量PCR法(RT-PCR)测定珍珠水解液对影响黑色素合成的相关基因酪氨酸酶基因(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)及影响黑色素转运的相关基因小眼畸形相关转录因子(MITF)。结果:浓度为0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液可以抑制黑色素细胞的黑色素合成,3种浓度下的珍珠水解液均可抑制相关基因TRP1mRNA的表达,0.25%浓度下可抑制TYR、TRP1及MITF的mRNA的表达。结论 :珍珠水解液主要通过抑制黑色素合成过程中TRP1 mRNA的表达,从而抑制黑色素合成而发挥美白功效。     

荆芥StHD1与StHD8基因克隆与调控腺毛的功能分析北大核心CSCD

HD-Zip是植物界一类特有的转录因子,影响植物的生长发育及次生代谢。其中的HD-ZipⅣ被认为在毛状体的发育中具有重要的调控作用。为了探究荆芥HD-ZipⅣ亚家族的2个基因StHD1与StHD8在荆芥腺鳞中的调控作用,利用转录组测序技术、酵母双杂技术等对2个基因的表达模式、蛋白之间的互作进行了分析,并对基因进行了亚细胞定位、在烟草体内和荆芥体内的功能验证。结果表明:荆芥的StHD1与StHD8与其他植物的HD-ZipⅣ亚家族蛋白序列相似性较高,具有HD-ZipⅣ亚家族特征保守结构域,亚细胞定位显示被定位于细胞核;以上2个基因主要在幼嫩组织和花穗中表达;酵母双杂结果表明StHD1与StHD8蛋白之间存在互作。StHD1与StHD8过表达的转基因烟草腺毛密度和长度明显增加。通过VIGS(virus-induced gene silencing)技术在荆芥体内抑制StHD1与StHD8表达会导致腺鳞密度、单萜合成关键基因表达量下降,单萜主要成分柠檬烯和胡薄荷酮相对含量降低。以上结果表明,荆芥的StHD1与StHD8通过形成复合体对荆芥的腺毛具有调控作用,同时影响单萜的生物合成。     

人参PgMYB4基因表达载体构建及其对拟南芥的抗旱性分析

目的构建人参Pg MYB4基因表达载体,并研究该基因对拟南芥的抗旱功能。方法采用RT-PCR技术克隆人参Pg MYB4基因,构建表达载体,通过农杆菌介导的花序浸蘸法将其转化到拟南芥中,获得转基因拟南芥,以野生型拟南芥作对照,检测植株与抗旱相关的生理指标。结果获得的人参Pg MYB4基因全长为735 bp,编码245个氨基酸,预测其相对分子质量为27 914;在干旱胁迫条件下,转基因拟南芥的生长状态明显优于野生型拟南芥,与野生型相比,转基因拟南芥叶片相对叶绿素量降低幅度小、脯氨酸量显著升高、水丢失率较低。结论人参Pg MYB4基因具有抗干旱胁迫的能力。     

丹参酮合成相关的SmCYP81C16基因克隆和功能研究

目的:丹参(Salvia miltiorrhiza)根中所含的丹参酮为二萜醌类化合物,而鉴定参与丹参酮合成的CYP450基因成为解析丹参酮生物合成途径分子机制的关键步骤。方法:本实验从丹参基因组和转录组数据中筛选到SmCYP81C16基因,采用RT-PCR方法克隆获得基因cDNA全长序列,利用生物信息学分析方法分析其所编码蛋白质的理化性质,预测该蛋白质二级结构、保守结构域等,建立系统发育进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测了该基因的组织/器官表达特异性;通过遗传转化方法获得了该基因的过表达转基因毛状根株系,通过化学检测及代谢组学分析丹参酮类化合物在对照株系和过表达株系中的含量变化。利用实时荧光定量PCR方法检测了毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因中的相对表达量。结果:SmCYP81C16基因全长1497 bp,编码498个氨基酸残基,该蛋白质相对分子质量为55.8 kDa;SmCYP81C16在丹参茎和根的周皮部高表达;通过化学检测及代谢组学分析发现,与对照株系比较,在SmCYP81C16过表达阳性株系中,丹参酮类化合物的含量升高;过表达毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因的表达量显著上升。结论:本研究结果表明SmCYP81C16具有正向调控丹参酮生物合成的功能。本研究为利用生物技术方法提高丹参酮类化合物含量奠定基础。     

基于《黄帝内经》与《难经》论述“调腹通络”的理论基础

“调腹通络”技术是中医基础理论指导下，基于临床五迟、五软病康复实践的总结，分为“调腹”与“通络”两部分。通过对《黄帝内经》《难经》经典整理、溯本求源，从发育迟缓病症、痿软无力病症等，以及对冲脉理论、神阙理论、从阴引阳及从阳引阴理论、解结理论的整理，深入认识五迟、五软与肾、肝、脾的关系，进一步优化“调腹通络”思路与技术的奠定基础，进而科学、合理的指导临床康复治疗。     

“秦药”的现代研究概况

陕西历史悠久,文化底蕴深厚,在历史上较长时期一直简称为"秦"。陕西药用植物资源丰富,秦皮、秦艽、"十大秦药"[子州黄芪、宝鸡柴胡、洋县元胡、商洛丹参、汉中附子、略阳杜仲、宁陕天麻、宁陕猪苓、澄城黄芩、佛坪山茱萸和略阳黄精(并列第10名)]及"太白七药"等大宗品种和特色草药均是"秦药"的代表性品种。"秦药"为陕西及其周边地区所产的道地药材,是陕西具有潜在发展价值与优势的产业之一,也是支撑我国医疗卫生事业和健康服务业的重要组成部分。对"秦药"的种质资源、人工栽培、基地建设、品种选育、化学成分、质量控制等研究进展进行整理与论述,并对"秦药"的发展进行展望。     

星点设计-效应面法优化芷芎散温敏凝胶的处方及其鼻黏膜渗透特性研究

目的 制备并优化芷芎散鼻用温敏凝胶的处方,并考察其体外释放机制和鼻黏膜渗透特性。方法 利用星点设计-效应面法优化泊洛沙姆温敏凝胶基质处方,然后经Franz扩散池法考察欧前胡素、阿魏酸的体外释放机制及其离体家兔鼻黏膜渗透特性。结果 最优处方为泊洛沙姆407（P407）20%、泊洛沙姆188（P188）6.5%,欧前胡素接近零级释放模型,阿魏酸接近Higuchi模型,处方对欧前胡素和阿魏酸的透过鼻黏膜均具有促进作用。结论 优化所得的处方为芷芎散新给药途径制剂的开发提供基础。     

气相色谱-串联质谱法结合QuEChERS法快速检测中药中50种农药残留

目的 建立运用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法快速筛查460份中药材及其中药饮片（43份）中常用的50种农药残留。方法 通过对比《中国药典》2020版中药中农药残留的前处理方法,优选中药中50种农药残留的适配性前处理方法。中药样品经乙腈溶剂提取,以Qu ECh ERS法处理,采用GC-MS/MS测定,内标法定量。结果 在460份检测样品中共检出农药残留66份,总检出率为14.3%,检出禁用农药6份,检出率为1.3%,43份中药饮片中农药残留检出率为11.6%,未检出禁用农药。农残的检出是季节性分布集中出现在第3、4季度,农贸市场和种植地的农残检出率明显高于医院和药店,并且存在农残超标情况。中药中根类和叶类受污染最重,中药材全草类中农药残留最多,检出率为20.4%,其次为叶类18.3%和根茎类16.3%,中药饮片中农残最高为叶类,检出率为15.4%,全草类检出率为11.1%、根茎类检出率为6.2%,全草类、根茎类和叶类存在样品中检出多种农药残留的现象。结论 该方法简单快速、灵敏度高、重现性好、准确度高,可快速筛查中药中农药残留,为保障中药质量提供参考。     

不同比例甘草配伍祖师麻抗大鼠佐剂性关节炎的实验研究

目的 观察不同比例甘草配伍祖师麻对大鼠佐剂性关节炎（AA）模型的治疗作用,筛选两者配伍比例,探讨其配伍意义。方法 采用足跖皮内注射弗氏完全佐剂制备AA模型,将140只模型大鼠随机分成14组：模型组,雷公藤多苷片组,祖师麻低、中、高剂量组,甘草低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：1）低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：2）低、中、高剂量组,另取10只正常大鼠为对照组,给药组大鼠造模前2 d开始ig给药,连续给药31 d,观察各组大鼠体质量变化,计算足肿胀度、关节炎指数（AI）,采用ELISA法检测大鼠血清炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平,观察大鼠膝关节组织病理变化,通过免疫组化法测定大鼠膝关节滑膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）、巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的表达。结果 与模型组比较,祖师麻组、祖师麻甘草配伍组能够明显抑制AA大鼠体质量减轻的趋势,对抗AA大鼠足肿胀度及AI的增加,降低异常升高的血清TNF-α、IL-1β水平,改善关节病理组织变化,减少滑膜组织VEGF、MIF的表达,其中以祖师麻-甘草（3：2）配伍组效果最优。结论 祖师麻甘草配伍后,对AA大鼠各项指标改善作用显著,作用优于单用祖师麻,其最佳配伍比例为祖师麻-甘草（3：2）。调节血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β及滑膜组织VEGF、MIF的表达,可能是祖师麻甘草配伍治疗类风湿性关节炎机制之一。     

千金子制霜前后提取物对大鼠肠道菌群的影响

目的研究千金子制霜前后提取物对正常大鼠肠道菌群的影响,为进一步阐明千金子制霜减毒机制提供参考。方法大鼠ig高、中、低剂量的千金子生品和霜品提取物,采用平板菌落计数法考察千金子制霜前后大鼠粪便中4类代表性肠道菌群双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌的数量变化。结果平板菌落计数实验结果表明,ig千金子生品与霜品提取物后大鼠出现菌群失调现象,且千金子霜品较生品引起的菌群紊乱程度低,在低剂量给药时可使条件致病菌肠球菌和大肠杆菌的数量减少。结论千金子制霜前后提取物均会影响肠道菌群的生物多样性,影响肠道菌群平衡,且千金子制霜后对4类肠道菌群的作用减弱,引起肠道菌群紊乱程度减小,这与千金子霜品泻下作用缓和的研究结果相一致,表明从肠道微生态角度考察千金子制霜前后对肠道菌群的干预作用,可揭示制霜与肠道菌群数量变化可能存在相关性。     

冷冻干燥技术在中药领域的研究进展

中药是中华民族的瑰宝,中药的质量成为制约其发展的重要因素,而干燥技术的现代化是中药发展的重要环节。冷冻干燥技术可较好地保持物料的原有形态及其中含有的营养物质,获得较高质量的干燥物。介绍了冷冻干燥技术的原理及发展,着重总结冷冻干燥技术在中药领域的研究进展,包括冷冻干燥技术应用于中药加工的目的、影响因素,以及冷冻干燥对药材组织成分的影响,以期为中药冷冻干燥的系统研究提供新思路。     

罂粟属植物核心DNA条形码的筛选

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种准确、高效且对操作人员要求不高的物种鉴定技术。为了筛选出适合罂粟属的DNA条形码,从GenBank上获得罂粟属植物共69条序列,包括21条ITS序列,10条matK序列,8条psbA-trnH序列,14条rbcL序列和16条trnL-trnF序列。应用Mega 6.0软件分析了罂粟属的ITS,matK,psbA-trnH,rbcL,trnL-trnF序列的特征,通过计算序列的种内、种间距离,评估序列的Barcoding Gap和构建NJ,UPGMA系统发育树进行分析。分析结果表明:trnL-trnF不仅种内变异和种间变异差别最大,而且有明显的barcoding gap,种内变异和种间变异重合较少,能较好地区分不同种类的罂粟;所构建的NJ和UPGMA系统发育树,也能将全部物种区分开。综合考虑,建议把trnL-trnF作为鉴定罂粟属植物的核心条形码,结合其他片段作为组合条形码。     

华山参中2个新酰胺类化合物

目的研究华山参(漏斗泡囊草Physochlaina infundibularis干燥根)的化学成分。方法采用正相硅胶、Sephadex LH-20、HPLC等色谱手段,对华山参药材进行分离纯化,并利用质谱、核磁共振等方法进行化合物结构鉴定。结果从华山参正丁醇部位初步分离得到3个酰胺类化合物,分别鉴定为N-甲酰基-N-阿魏酰基-1,4-丁二胺(1)、N-乙酰基-N-顺式阿魏酰基-1,4-丁二胺(2)、N-乙酰基-N-阿魏酰基-1,4-丁二胺(3)。结论化合物1、2为新化合物,分别命名为华山参丁二胺A、华山参丁二胺B;化合物3为首次从泡囊草属植物中分离得到。     

半夏曲炮制中4种优势微生物的生理生化特性及黄色素含量测定

目的研究半夏曲中4种优势微生物的生理生化特性,测定炮制过程中不同时间点各样本的黄色素含量,为揭示半夏曲炮制机制奠定基础。方法以半夏曲中筛选出的4株优势菌枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、宛氏拟青霉Paecilomyces variotii、丝衣霉菌Byssochlamys spectabilis、黑曲霉Aspergillus niger为研究对象,分别测定它们的最适宜生长温度、pH值,利用糖类的产酸能力以及产淀粉酶、蛋白酶、黄色素的能力,同时测定半夏曲炮制过程中5个不同时间点样本的黄色素含量。结果枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉生长的最适温度分别为35℃、29℃、29～31℃、39℃,最适pH值分别为7.0、7.0、7.5、7.0。4种菌均具有产淀粉酶和蛋白酶的能力,宛氏拟青霉、丝衣霉菌具有产黄色素能力。5个不同时间点样品的黄色素质量分数分别为69.875、69.875、71.750、119.500、137.875μg/g。结论 4种优势微生物在半夏曲炮制中可能起重要作用。