大黄䗪丸对TGF-β1干预后A549细胞增殖的影响

目的基于"特发性肺纤维化(IPF)患者存在肺络干血"假说,观察大黄?虫丸含药血清对TGF-β1干预后A549细胞增殖的影响,探讨其防治特发性肺纤维化的作用机制。方法正常培养并取对数生长期A549细胞,5 ng/mL的TGF-β1对其干预后,Masson染色观察上皮-间充质转化(EMT)过程;选择吡非尼酮作为阳性对照药,采用血清药理学和cck-8法观察不同浓度大黄?虫丸含药血清对TGF-β1干预后A549细胞增殖的影响。结果成功获取发生EMT的A549细胞;24 h,OD值从高到低依次为:空白对照组(K组)、大黄?虫丸含药血清中剂量组(Z组)、大黄?虫丸含药血清小剂量组(X组)、模型组(M组)、大黄?虫丸含药血清大剂量组(D组)、西药组(P组);48 h,OD值从高到低依次为:K组、M组、Z组、X组、P组、D组;72 h,OD值从高到低依次为:K组、M组、D组、Z组、P组、X组。结论大黄?虫丸含药血清对TGF-β1干预后A549细胞增殖率有影响,推测大黄?虫丸对IPF的保护机制可能与不同程度阻断或逆转了TGF-β1诱导的EMT有关。     

大黄䗪虫丸对TGF-β1诱导A549细胞Rho/ROCK信号通路表达的影响

目的:观察大黄?虫丸含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导后A549细胞RhoA/ROCK信号通路表达情况的影响,探讨其防治特发性肺纤维化(IPF)的作用机制.方法:正常培养并取对数生长期A549细胞,TGF-β1对其诱导48 h,电子显微镜下观察A549细胞的形态学变化;选择吡非尼酮作为阳性对照药,RT-P...     

扶正祛邪方对肺癌A549细胞发生上皮间质转化的抑制作用研究

目的:研究中药复方扶正祛邪方对肺癌A549细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的抑制作用及机制研究。方法:采用MTT方法观察扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用;Western blot方法观察A549细胞EMT过程中上皮细胞、间质细胞标志物E-cadherin、N-cadherin的表达,以及信号分子P-Smad2/3的表达;RT-PCR检测扶正祛邪方对I型胶原诱导人腺癌A549细胞EMT过程中TGF-β3mRNA的影响。结果:(1)MTT结果显示:扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖。(2)Western blot结果显示:与模型组相比,扶正祛邪方上调E-cadherin蛋白表达,下调N-cadherin、P-Smad2/3的蛋白表达(P<0.05);RT-PCR结果显示:扶正祛邪方下调TGF-β3mRNA的表达,呈浓度依赖性。结论:(1)扶正祛邪方对A549细胞有直接的抑制作用;(2)扶正祛邪方对TGF-β1诱导人腺癌A549细胞EMT有抑制作用,其机制与抑制I型胶原诱导TGF-β3mRNA表达,进而抑制Smad2/3的磷酸化,上调E-cadherin蛋白表达,下调N-cadherin蛋白表达有关。     

加减乌梅丸颗粒对哮喘大鼠激素干预模型气道重塑及转化生长因子-β1/Smad信号通路的影响

目的:观察加减乌梅丸颗粒对哮喘大鼠激素干预模型气道重塑及转化生长因子(TGF)-β1/Smad信号通路的影响。方法:选取30只雄性SD大鼠并随机分为正常组、哮喘组、地塞米松组、布地奈德组及中药组,除正常组外其余组以卵蛋白致敏、雾化激发方法建立哮喘大鼠模型,除正常组和哮喘组外其余均予地塞米松干预并逐步撤减,布地奈德组予以普米克令舒雾化,中药组予以加减乌梅丸颗粒灌胃。光镜下观察各组大鼠肺组织病理形态学改变,测定气道壁面积百分比(Wat%)、气道平滑肌面积百分比(Wam%),免疫组织化学法比较各组Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)表达水平,蛋白质印迹法和荧光定量PCR法比较TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白及基因表达水平。结果:与正常组比较,哮喘组大鼠气道壁及平滑肌层明显增厚,管腔变窄,Wat%、Wam%升高,差异有统计学意义(P<0.05),CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及基因表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05),Smad7表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与哮喘组比较,地塞米松组Wat%降低,差异有统计学意义(P<0.05),CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),TGF-β1、Smad3蛋白及基因表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与地塞米松组比较,中药组Wat%降低,差异有统计学意义(P<0.05),CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及基因表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:加减乌梅丸颗粒可通过调控TGF-β1/Smad信号通路从而减少气道平滑肌增生以及CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白沉积,抑制气道壁增厚,延缓气道重塑的发展。     

软肝颗粒对肝纤维化大鼠转化生长因子-β1/Smads信号通路的影响

目的：探讨软肝颗粒对肝纤维化大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smads 信号通路的影响。方法105只Wistar大鼠,按随机数字表法随机分为正常对照组,模型组,秋水仙碱组,大黄?虫丸组,软肝颗粒高、中、低剂量组,每组15只。采用四氯化碳和高胆固醇饮食诱导肝纤维化。模型制作后,软肝颗粒低、中、高剂量组分别灌胃软肝颗粒混悬液3.600、7.200、14.400 g/(kg?d);大黄?虫丸组灌胃大黄?虫丸混悬液0.180 g/(kg?d);秋水仙碱组灌胃秋水仙碱混悬液0.108 mg/(kg?d);正常对照组和模型组以等体积蒸馏水灌胃。均连续灌胃8周。采用免疫组化染色法检测肝组织TGF-β1、Smad3、Smad7表达,运用 RT-PCR 技术检测肝组织 TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA 表达。结果与正常对照组比较,模型组TGF-β1[(2.59±0.99)比(0.43±0.21)]、Smad3[(2.56±0.67)比(0.41±0.18)]蛋白及 TGF-β1 mRNA[(2.25±0.21)比(0.71±0.09)]、Smad3 mRNA[(2.34±0.03)比(0.78±0.12)]表达显著升高（P均＜0.01）。与模型组比较,软肝颗粒高剂量组TGF-β1[(1.12±0.27)比(2.59±0.99)]、Smad3蛋白[(1.05±0.34)比(2.56±0.67)]表达下降,Smad7蛋白表达[(2.33±0.62)比(0.36±0.18)]升高（P＜0.01）,TGF-β1 mRNA[(1.09±0.11)比(2.25±0.21)]、Smad3 mRNA[(1.10±0.02)比(2.34±0.03)]表达下降,Smad7 mRNA[(1.18±0.13)比(0.38±0.11)]表达升高（P＜0.05）。结论软肝颗粒可通过下调TGF-β1、Smad3,上调Smad7调节肝纤维化大鼠TGF-β1/Smads信号通路。     

12种中药醇提取物对TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化的干预作用

目的对茯苓、蒲黄、白及、鸡血藤、郁金、红花、牛膝、何首乌、黄芪、仙茅、鹿衔草、白化参共12种中药的醇提取物进行筛选,探讨12种中药醇提取物对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的非小细胞肺癌A549细胞上皮间质转化(EMT)的干预作用。方法10 ng/ml TGF-β1诱导A549细胞;采用MTT法检测12种中药醇提取物对A549细胞增殖的影响;观察醇提取物对TGF-β1诱导的A549细胞形态变化的影响;采用Western blot方法检测醇提取物对TGF-β1诱导的EMT相关标志蛋白的表达,以及对EMT相关信号转导的影响。结果 10 ng/ml的TGF-β1诱导A549细胞48 h后使其发生EMT过程;何首乌醇提取物不影响A549细胞增殖;与TGF-β1组相比较,100μg/ml的何首乌醇提取物能逆转A549细胞形态变化过程;与TGF-β1组相比较,100μg/ml的何首乌醇提取物降低vimentin蛋白表达水平(P0.05),上调E-cadherin蛋白表达水平(P0.05);与TGF-β1组比较,100μg/ml的何首乌醇提取物降低pSmad2和p-Erk蛋白表达水平(P0.05)。结论何首乌醇提取物具有抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化过程的作用,这可能与Smad2和Erk1/2信号通路有关。     

益气除痰方干预TGF-β信号途径逆转A549细胞上皮间质转化研究

目的:观察益气除痰方是否能通过干预TGF-β信号途径,逆转肺癌A549细胞上皮间质转化(EMT)。方法:通过暴露于TGF-β_1环境中,诱导肺腺癌细胞株A549发生EMT,并以益气除痰方含药血清进行干预,相差显微镜下观察各组细胞形态变化;划痕实验、Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测各组细胞EMT相关蛋白及TGF-β信号通路蛋白Smad2/3的表达。结果:镜下可见经TGF-β_1孵育的A549细胞呈现明显的间质细胞形态,益气除痰方含药血清作用24 h后细胞A549细胞出现凋亡且间质化程度较低;划痕实验结果显示:与空白血清组比较,TGF-β_1+空白血清组A549细胞迁移及侵袭能力显著升高,益气除痰方可降低TGF-β_1所升高的细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测显示TGF-β_1可以激活Smad2/3通路下调E-cadherin的表达,上调Vimentin的表达,而益气除痰方含药血清可抑制该过程。结论:益气除痰方可能通过干预TGF-β/Smad信号通路上调E-cadherin表达,下调Vimentin表达,从而逆转肺癌A549细胞上皮间质转化,抑制肿瘤细胞的侵袭迁移。     

扶正祛风方通过TGF-β1/Smad信号通路抑制膜性肾病大鼠足细胞转分化的机制

目的:研究扶正祛风方对膜性肾病(MN)模型大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路及足细胞上皮间充质转化(EMT)的影响,探讨其保护足细胞的分子机制。方法:大鼠随机分为正常组和造模组,造模组经阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)诱导构建MN模型后分为模型组、氯沙坦钾组(0.05 g·kg^-1)及扶正祛风方高、中、低剂量(41,20.5,10.25 g·kg^-1)组,给药4周。给药0,2,4周检测24 h尿蛋白(24 h-Upro)水平;给药4周后检测尿素氮(BUN)及血肌酐(SCr)水平,肾组织经苏木素-伊红(HE),马松(Masson),过碘酸-六胺银(PASM)染色后光镜观察病理改变,透射电镜观察肾小球基底膜(GBM),足突改变;免疫组化(IHC)观察足细胞EMT标志物结蛋白(Desmin)的分布及表达强度;蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别检测肾组织TGF-β1,Smad2/3,磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3),Smad7,Desmin mRNA及蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组24 h-Upro,BUN,SCr水平显著升高(P<0.01),免疫复合物沉积升高,GBM增厚和足突融合明显,Desmin mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01),TGF-β1,Smad2,Smad3 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Smad3 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,扶正祛风方各组及氯沙坦钾组24 h-Upro,BUN水平降低(P<0.05),扶正祛风方中剂量组血SCr水平降低(P<0.05),扶正祛风方各组及氯沙坦钾组肾小球上皮下免疫复合物沉积减少,GBM增厚和足突融合减轻,扶正祛风方高、中剂量组和氯沙坦钾组Desmin在基底膜的表达强度降低;扶正祛风方中剂量组肾组织TGF-β1和p-Smad2/Smad2 mRNA及蛋白表达降低,Smad7 mRNA及蛋白表达升高(P<0.05),扶正祛风方高剂量组p-Smad3/Smad3 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05),扶正祛风方高、中剂量组及氯沙坦钾组肾组织Desmin mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。结论:扶正祛风方可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路激活介导的足细胞EMT实现MN足细胞保护的作用。     

加味茵陈四逆汤含药血清对TGF-β1干预的大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通道及胶原蛋白的影响

目的:探讨加味茵陈四逆汤含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)干预的大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smad通道相关蛋白及胶原蛋白3(Collagen3)生成量的影响。方法:以大鼠肝星状细胞HSC-T6为研究对象,将细胞分为空白组,模型组,阳性药物组(甲强龙,10%含药血清),加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组(10%含药血清),共6组。除空白组外,其余均给予TGF-β1(10 g·L-1)并采用相应10%的含药血清培养,并采用蛋白质免疫印迹(Western blot)的方法检测各研究组含药血清对大鼠肝星状细胞HSC-T6 Smad3,Smad7,Collagen3蛋白表达的影响。结果:与空白组比较,模型组HSC-T6细胞Smad3,Smad7,Collagen3蛋白表达升高,Collagen3蛋白表达升高较为明显(P0.05);与模型组比较,加味茵陈四逆汤低剂量明显降低Smad3蛋白表达(P0.05),加味茵陈四逆汤中剂量明显降低Collagen3蛋白表达(P0.05)。结论:加味茵陈四逆汤含药血清使Smad3,Collagen3蛋白表达下调,Smad7未见明显变化,提示本药在离体条件下可以延缓肝纤维化的进程。     

止消通脉宁对TGF-β1诱导的HK-2细胞Smad 2、3、7 mRNA表达的影响

目的：探讨止消通脉宁对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)Smad 2、Smad 3、Smad 7的影响。方法：将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1：1)培养基培养;实验分为6组：空白对照组、单纯TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL+10%空白血清)、中药含药血清低剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清中剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清高剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁含药血清)。药物干预24小时后,荧光定量PCR检测Smad 2、smad 3、Smad 7的mRNA表达。结果：HK-2细胞经TGF-β1诱导后, Smad 2、smad 3的mRNA表达显著上升,Smad 7的mRNA表达下降,与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05),但经止消通脉宁含药血清干预后, Smad 2、smad 3的mRNA表达逐步下降,Smad 7的mRNA表达上调,与单纯TGF-β1诱导组相比有显著性差异(P＜0.05)。而空白血清无此作用。结论：止消通脉宁能够调控TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化Smad信号通路mRNA表达的作用,在一定程度上具有抑制肾间质纤维化的作用。     

半夏泻心汤人含药血清对HP感染GES-1细胞TGF-β/Smad信号通路的影响

目的:探讨半夏泻心汤人含药血清对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染人胃黏膜上皮GES-1细胞转化生长因子-β(TGF-β)/信号转导蛋白(Smad)信号通路的影响,以揭示该方治疗消化性溃疡可能的作用机制。方法:GES-1细胞分为空白组,HP感染模型组,健康人血清组,雷贝拉唑血清组,用药前血清组,10%半夏泻心汤血清组,20%半夏泻心汤血清组。除空白组外,其余各组均接种HP造成幽门螺杆菌感染模型,采用雷贝拉唑、半夏泻心汤含药血清及用药前、健康人血清进行干预,24 h后收集细胞及其上清液,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测Smad2/3,Smad7,TGF-β1及磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3),磷酸化Smad7(p-Smad7)蛋白的表达。结果:与空白组比较,HP可明显抑制GES-1细胞的增殖,降低GES-1细胞内Smad2/3,TGF-β1及p-Smad2/3蛋白表达,增加Smad7及p-Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01);与HP感染模型组比较,雷贝拉唑血清组及10%,20%半夏泻心汤血清组可明显降低HP对GES-1细胞增殖的抑制,增加GES-1细胞内Smad2/3,TGF-β1,p-Smad2/3蛋白表达,并明显降低Smad7,p-Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01);与用药前血清组比较,加入雷贝拉唑、半夏泻心汤含药血清后均可降低HP对GES-1细胞增殖的抑制,其中雷贝拉唑血清组及20%半夏泻心汤血清组可增加GES-1细胞内Smad2/3,TGF-β1,p-Smad2/3蛋白表达,降低Smad7,p-Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01)。结论:半夏泻心汤能够减轻HP诱导GES-1细胞的损伤,促进GES-1细胞增殖,治疗HP相关性消化性溃疡,提高溃疡愈合质量,其机制可能与其调控TGF-β/Smad信号通路有关。     

三棱丸方对肠上皮细胞上皮间质转化TGFβ1/Smads信号通路的影响

目的:研究三棱丸(Sparganii Pill SP)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的间质化肠上皮细胞(IEC-6)钙黏蛋白E(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actinα-SMA)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达的影响及其对IEC-6细胞TGFβ1/Smads信号转导途径的影响及可能机制。方法:以IEC-6细胞为研究对象,用Western blot法检测高、中、低剂量的SP及罗格列酮含药血清作用后的PPARγ、Smad2/3及p-Smad3蛋白的表达,RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA mRNA的表达,观察SP及罗格列酮对PPARγ、pSmad3入核水平的影响。结果:与10%正常大鼠血清组比较,SP含药血清组能够抑制α-SMA mRNA表达水平;提高E-cadherin、PPARγ,降低pSmad3、α-SMA的蛋白表达,尤以20%SP含药血清组作用明显;10%SP含药血清组促进PPARγ入核,抑制pSmad3的入核。结论:在体外,SP抑制TGFβ1/Smads信号通路途径转导IEC-6细胞EMT的机制可能与激活PPARγ的表达有关。     

虎杖苷对TGF-β1诱导的人类肺泡上皮A549细胞EMT的影响

目的探讨虎杖苷对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人类肺泡上皮A549细胞生长及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程的作用机制。方法体外培养A549细胞,随机分成5组:空白组、对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,分别加入普通培养液、含5ng/mL TGF-β1的培养液、含浓度为50μmol/mL的虎杖苷加TGF-β1的培养液、含浓度为100μmol/mL的虎杖苷加TGF-β1的培养液、含浓度为150μmol/mL的虎杖苷加TGF-β1的培养液进行干预,观察并记录不同时间段细胞形态变化;MTT法检测虎杖苷最佳药物浓度;蛋白质印迹法(Western blot)、实时PCR(Real-time PCR)检测上皮标志物E-cad、间质标志物Vimentin蛋白及mRNA表达水平。结果倒置相差显微镜观察到虎杖苷和TGF-β1干预后A549细胞由原来的鹅卵石状上皮形态转变成梭形,且细胞间隙变大,细胞间的连接变得松散,对照组较为明显,低、中、高剂量组比对照组细胞形态稍饱满;48h中剂量组虎杖苷对TGF-β1诱导的A549细胞EMT抑制作用最明显。在虎杖苷和TGF-β1作用下,E-cad蛋白及mRNA表达总体呈下调趋势(P0.05),与对照组比较,各药物组E-cad蛋白及mRNA表达下调幅度较小,且48h比24h明显。而Vimentin蛋白及mRNA表达总体呈上调趋势,与对照组比较,各药物组Vimentin蛋白及mRNA表达上调的幅度较小,且48h比24h明显,差异有统计学意义(P0.05)。结论虎杖苷能抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT过程,并存在时间和剂量依赖性,具有抑制肺纤维化的作用。     

芪连扶正胶囊调控TGF-β/smad信号通路抑制肺癌转移的研究

目的:观察芪连扶正胶囊对TGF-β/smad通路相关分子表达的影响,探讨其相关机制。方法:体外培养肺癌A549细胞,制备芪连扶正胶囊含药血清,按实验分组干预,Western blotting检测TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3、Smad4、Smad7的表达,RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达。结果:芪连扶正胶囊含药血清可上调TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3、Smad4表达,下调Smad7、TGF-β1mRNA在肺癌A549细胞中的表达,其中,各药组分子表达量除芪连扶正胶囊低剂量组外,与对照组相比均有显著性差异(P0.01),与化疗组相比,联合组及芪连扶正胶囊各组亦有显著性差异(P0.05或P0.01)。结论:芪连扶正胶囊含药血清可通过纠正TGF-β/smad通路紊乱发挥抗肺癌转移作用。     

柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:探讨柴胡疏肝散对肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的作用机制。方法:60只Wistar大鼠被随机均分为6组:正常组、模型组、柴胡疏肝散高、中、低剂量组、柴胡疏肝散预防组。除正常组外,其余各组均采用猪血清ip诱发HF,0.5 m L/只,2次/周,连续10周,5周后即可形成HF。预防组于造模同时给药(以柴胡疏肝散6.3 g·kg-1),柴胡疏肝散高、中、低剂量组[(12.6,6.3,3.15)g·kg-1]于造模第6周给药,连续10周。采用RT-PCR法检测各组肝组织转化生长因子-β1(TGF-β1),Smad2,Smad3,Smad4和Smad7的mRNA表达,免疫组化法分别检测肝组织TGF-β1,磷酸化Smad 2/3(p-Smad 2/3)和Smad7蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组TGF-β1,Smad2,Smad3的mRNA和TGF-β1,p-Smad 2/3蛋白表达均显著增加(均P0.01),Smad7基因表达显著降低(均P0.01);与模型组比较,柴胡疏肝散中剂量组TGF-β1和Smad3 mRNA表达均显著降低,p-Smad 2/3和TGF-β1蛋白表达显著减弱(P0.05,P0.01),Smad7基因表达显著增加(P0.01)。结论:柴胡疏肝散有明显的抗HF作用,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路有关。     

三七总皂苷对肺癌A549细胞上皮间质转化的抑制作用

目的观察三七总皂苷(PNS)对体外经转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导肺腺癌A549细胞后发生上皮细胞间质化(EMT)的作用。方法首先进行PNS MTT实验,然后再进行PNS干预EMT实验,将A549细胞随机分为5组:空白组加入F-12培养基,模型组及低、中、高浓度中药组分别加入10 ng/mL TGF-β_1和62.5、125、250μg/mL PNS,继续培养72 h。采用光学显微镜观察各组细胞的形态变化,采用实时荧光定量PCR、Western Blot及免疫荧光技术检测纤维连接蛋白(FN)、波形蛋白(Vim)、E-钙黏素(E-Cad)mRNA及蛋白表达水平。结果 31.25～500μg/mL PNS对A549细胞无明显增殖作用。与空白组比较,模型组FN mRNA及蛋白表达升高(P0.01,P0.05),Vim蛋白表达升高(P0.05),E-Cad mRNA及蛋白表达降低(P0.05)。与模型组比较,高浓度中药组FN mRNA表达降低(P0.05),E-Cad及蛋白mRNA表达升高(P0.01,P0.05);低浓度、高浓度中药组FN蛋白表达降低(P0.05),低、中浓度中药组Vim蛋白表达降低(P0.05)。结论 PNS体外干预可提高EMT过程中上皮标志物E-Cad并抑制间质标志物FN、Vim的表达,高浓度时结果更为显著,对EMT过程有一定的干预作用。     

鳖甲煎丸通过TGF-β/Smad信号通路抑制DEN诱导肝癌大鼠上皮间质转化的机制

目的:通过研究鳖甲煎丸对二乙基亚硝胺(DEN)诱导肝癌模型大鼠中转化生长因子-β(TGF-β)/Smad通路信号分子及下游靶基因的影响,探讨鳖甲煎丸抗肝癌侵袭转移的分子机制。方法:大鼠分为正常组、模型组、鳖甲煎丸组(2.2 g·kg-1·d-1),对模型组及鳖甲煎丸组大鼠使用DEN进行腹腔注射,诱导大鼠肝脏发生肝炎-肝硬化-癌变病理改变,鳖甲煎丸组在肝硬化阶段给予鳖甲煎丸连续灌胃6周,收集血清及肝脏标本。采用试剂盒检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),总胆红素(TBIL),白蛋白(Alb),γ-谷氨酰转肽酶(GGT),碱性磷酸酶(ALP);苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肝脏病变;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测转化生长因子(TGF)-β1的mRNA转录水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TGF-β/Smad通路中TGF-β1,Smad2/3,磷酸化Smad2/3及上皮间质转化标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin),E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达水平。结果:鳖甲煎丸组与模型组之间肝功能指标差异均无统计学意义。与模型组比较,鳖甲煎丸能改善大鼠肝癌组织中细胞呈气球样变性、水肿、凝固性坏死的病理变化,降低肝癌组织中TGF-β1mRNA转录及蛋白表达水平(P0.01),下调磷酸化Smad2蛋白表达水平(P0.01),同时下调下游靶基因蛋白N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平(P0.01)。结论:鳖甲煎丸可能通过减少肝癌组织中TGF-β1的表达水平,抑制由TGF-β/Smad通路激活介导的肝癌细胞上皮间质转化(EMT),从而达到抗肝细胞癌转移侵袭的作用。     

补肾化瘀泄浊方通过调控细胞外调节蛋白激酶信号通路阻抑人肾小管上皮细胞间充质转化的机制研究

目的:观察补肾化瘀泄浊方对转化生长因子(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)的上皮间充质转化(EMT)及Smad2/3的影响,探讨其阻抑HK-2 EMT的机制。方法:采用TGF-β1诱导建立HK-2 EMT模型,Western blot检测TGF-β1对EMT标记蛋白、Smad2/3及细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号蛋白的影响。予不同剂量补肾化瘀泄浊方进行干预,Real-Time PCR检测EMT相关基因mRNA的表达,Western blot检测EMT相关蛋白、Smad2/3及ERK的表达;与ERK通路抑制剂PD98059作比较,观察补肾化瘀泄浊方通过ERK信号通路干预HK-2 EMT的作用。结果:与空白组比较,模型组HK-2细胞出现EMT特有的“纺锤形”结构,EMT标记α-SMA、Vimentin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05),E-cadherin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05),且磷酸化ERK及Smad2/3蛋白水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,补肾化瘀泄浊方各剂量组HK-2细胞EMT样形态改善,α-SMA、Vimentin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05),E-cadherin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05),磷酸化ERK及Smad2/3蛋白水平下降(P<0.05),且剂量越高作用越明显。与模型组比较,ERK通路抑制剂能显著下调α-SMA、Vimentin、磷酸化Smad2/3蛋白水平(P<0.05);补肾化瘀泄浊方高剂量具有与ERK通路抑制剂类似的作用。结论:TGF-β1可诱导HK-2 EMT,上调ERK及Smad2/3磷酸化水平,补肾化瘀泄浊方很可能通过抑制ERK通路活化,下调Smad2/3磷酸化水平,阻抑HK-2 EMT。     

高三尖杉酯对成纤维细胞增殖、凋亡及TGF-β1/Smad信号通路的影响北大核心

目的:探讨高三尖杉酯碱通过TGF-β1/Smad信号通路对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKF)增殖及凋亡的影响.方法:取第4代对数生长期的HKF细胞,随机分为空白对照组、高三尖杉酯碱组、TGF-β1组、高三尖杉酯碱+TGF-β1组,各组细胞给予相应药物孵育后,CCK-8检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,qRT-PCR检测Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA表达,蛋白印迹法检测TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Bcl-2、Bax蛋白表达.结果:与对照组比较,高三尖杉酯碱组细胞存活率、侵袭细胞数、划痕愈合百分比显著降低,细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高,ColⅠ、Col Ⅲ、TGF-β1 mRNA及p-Smad2、p-Smad3、Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.05).TGF-β1组上述指标变化趋势与高三尖杉酯碱组相反,除存活率外与对照组比较差异均有统计意义(P＜0.05).高三尖杉酯碱+TGF-β1组上述指标介于高三尖杉酯碱组和TGF-β1组之间,与高三尖杉酯碱组及TGF-β1组比较差异均有统计意义(P＜0.05).结论:高三尖杉酯碱可抑制HKF细胞增殖,诱导凋亡,降低细胞迁移和侵袭能力,其机制与抑制TGF-β1/Smad信号通路有关.