基于VEGF通路探讨断藤益母汤抑制胶原诱导型关节炎小鼠血管翳形成的作用

目的 探讨断藤益母汤抑制胶原诱导型关节炎（CIA）小鼠血管翳形成的机制。方法 SPF级DBA/1雄性小鼠24只,随机分为4组,分别是空白组（NC组）,模型组（CIA组）,甲氨蝶呤组（MTX组）,断藤益母汤组（DTYM组）,每组6只。除正常组外,其余组小鼠进行造模。二次免疫起,给予灌胃等体积溶媒,MTX（1 mg·kg^-1）和DTYM（15.4 g·kg^-1）,给药35 d。观察小鼠一般情况、关节炎指数;取材后进行膝、踝关节微型计算机断层摄影（micro CT）扫描,苏木素-伊红（HE）和番红-固绿染色观察病理改变,免疫组化检测血小板-内皮细胞黏附分子-1（CD31）,血管内皮生长因子-α（VEGF-α）,血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）,磷酸化（p）-VEGFR2的表达。结果 与NC组比较,CIA组小鼠踝关节红肿明显,关节炎指数评分显著上升（P<0.05,P<0.01）,膝、踝关节关节面明显破损,软骨厚度降低,膝、踝关节micro CT骨破坏评分明显升高（P<0.01）,滑膜中CD31,VEGF-α,VEGFR2,p-VEGFR2积分吸光度显著升高（P<0.01）;与CIA组比较,DTYM组踝关节红肿程度明显减轻,给药3周后小鼠关节炎指数评分明显下降（P<0.05,P<0.01）,膝、踝关节关节面更完整,软骨厚度增加,膝、踝关节micro CT骨破坏评分均明显降低（P<0.05,P<0.01）,滑膜中CD31,VEGF-α,VEGFR2,p-VEGFR2积分吸光度显著降低（P<0.01）。结论 断藤益母汤可能是通过调控VEGF通路抑制CIA小鼠血管翳的形成。     

健脾消癌方通过PI3K/Akt信号通路抑制结肠癌血管生成的研究＊

目的 观察结肠癌HCT116细胞健脾消癌方的条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响，从PI3K/Akt生物轴调控角度探讨其作用机制。方法 培养HCT116细胞，细胞设3组：对照组，健脾消癌方组（加入15%健脾消癌方含药血清）及人参皂苷Rg3组；制备HCT116细胞健脾消癌方条件培养液（分组及制备方法见实验方法），用条件培养液干预HUVEC（脐静脉内皮细胞，Human Umbilical Vein Endothelial Cells），Matrigel基质胶法检测HCT116细胞健脾消癌方条件培养液对HUVEC小管形成的影响。随后采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组HCT116细胞磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、VEGF（血管内皮生长因子，Vascular endothelial growth factor）蛋白表达。最后在结肠癌HCT116荷瘤小鼠中验证健脾消癌方对肿瘤生长速度的影响，并经瘤组织VEGF蛋白表达、CD31免疫组化染色检测肿瘤内血管生成情况。结果 模型组HUVEC细胞管腔形成较空白血清组显著增加（P<0.05）；健脾消癌方组及人参皂苷Rg3组较模型组HUVEC细胞管腔形成显著减少（P<0.01）。p-Akt和VEGF蛋白表达水平模型组高于空白血清组（P<0.05），健脾消癌方组及人参皂苷Rg3组显著低于模型组（P<0.01）；PI3K、Akt蛋白表达量组间差异无统计学意义。与对照组比较，模型组荷瘤小鼠肿瘤体积显著性增大，瘤组织内VEGF表达、CD31阳性面积显著性增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，健脾消癌方组及人参皂苷Rg3组荷瘤小鼠肿瘤体积显著减小，瘤组织内VEGF表达、CD31阳性面积降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 健脾消癌方可抑制肿瘤的血管生成和生长，其作用机制可能与PI3K/Akt生物轴调控VEGF表达有关。     

归芪白术方联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠EGFR，VEGFR2表达和血管生成的影响

目的 探讨归芪白术方联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）表达及血管生成的影响。方法 昆明种小鼠进行实验并建立胃癌荷瘤模型，造模成功后将小鼠随机分成6组：空白组、模型组、奥沙利铂组（10 mg·kg^-1）、联合高、中、低剂量组（奥沙利铂10 mg·kg^-1联合归芪白术方17.68、8.84、4.42 g·kg^-1）；末次给药后，取移植瘤，计算抑瘤率；苏木素-伊红（HE）染色观察瘤组织形态学变化；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清表皮生长因子（EGF），白细胞介素-8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF）水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）和免疫组化法（IHC）检测EGFR、磷酸化EGFR（p-EGFR）、VEGFR2、磷酸化VEGFR2（p-VEGFR2）和血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）的表达；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测EGFR、VEGFR2 mRNA相对表达。结果 给药组瘤体质量较模型组显著下降（P<0.01）；与奥沙利铂组比较，联合高、中剂量组瘤体质量明显下降（P<0.05，P<0.01）；模型组肿瘤细胞密度较高，细胞形状规则，未见明确的组织坏死灶；给药组肿瘤细胞密度降低，可见明确的组织坏死灶及大规模炎性细胞；与空白组比较，模型组与给药组血清中EGF，VEGF和IL-8水平均明显上升（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，给药组血清中EGF、VEGF和IL-8水平显著降低（P<0.01），EGFR、p-EGFR、VEGFR2、p-VEGFR2和CD31蛋白及EGFR、VEGFR mRNA表达显著降低（P<0.01）；与奥沙利铂组比较，联合高、中剂量组EGF、VEGF和IL-8水平明显降低（P<0.05，P<0.01），EGFR、p-EGFR、VEGFR2、p-VEGFR2和CD31蛋白及EGFR、VEGFR2 mRNA表达明显下降（P<0.05，P<0.01）；联合低剂量组中EGF、VEGF和IL-8含量降低，EGFR、p-EGFR、VEGFR2、p-VEGFR2和CD31蛋白及EGFR、VEGFR2 mRNA表达也有所下降，但差异无统计学意义。结论 归芪白术方联合奥沙利铂能通过影响EGFR，VEGFR2的表达，抑制胃癌荷瘤小鼠肿瘤组织的生长和血管生成。     

防己黄芪汤对脐静脉内皮细胞功能的影响

目的 防己黄芪汤对血管内皮生长因子（VEGF）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖、迁移、黏附、侵袭及管腔形成能力的作用。方法 VEGF（20 μg·L^-1）体外诱导HUVECs，加入不同质量浓度防己黄芪汤（0.25，0.5，1 g·L^-1）作用后，分别采用噻唑蓝（MTT）比色法、划痕修复实验、转移小室（transwell）迁移、黏附、侵袭及管腔形成实验检测防己黄芪汤对VEGF诱导的HUVECs功能的影响。提取HUVECs中的蛋白，采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测磷酸化Janus激酶1（p-JAK1）的蛋白表达水平。结果 与空白组比较，VEGF（20 μg·L^-1）能显著增加HUVECs细胞的增殖、划痕修复，transwell迁移、黏附、侵袭及管腔形成的能力（P<0.01）；与VEGF组比较，防己黄芪汤（0.25，0.5，1 g·L^-1）作用24 h对VEGF诱导的HUVECs增殖活性没有明显影响，作用24 h内能明显降低VEGF诱导升高的HUVECs划痕修复，transwell迁移、黏附、侵袭及管腔形成的能力（P<0.05）。与空白组比较，VEGF能显著诱导p-JAK1在HUVECs中的异常升高（P<0.01），防己黄芪汤（0.25，0.5，1 g·L^-1）能明显降低p-JAK1的表达水平（P<0.05，P<0.01）。结论 防己黄芪汤能够降低VEGF诱导的HUVECs划痕修复，transwell迁移、黏附、侵袭及管腔形成的能力，而其机制可能与JAK1相关。     

益肾活血方对肾纤维化小鼠血管内皮结构及功能的影响

目的 从内皮细胞及细胞能量代谢角度，探讨益肾活血方对肾间质纤维化（RIF）的作用机制。方法 采用单侧输尿管梗阻（UUO）方法造模成功后将75只SPF级C57BL/6小鼠随机分为模型组、白藜芦醇组（50 mg·kg^-1·d^-1）、益肾活血方低、中、高剂量组（7.1、14.2、28.4 g·kg^-1·d^-1），每组15只。另设15只作为假手术组。假手术组及模型组予等体积生理盐水灌胃。所有小鼠于造模术后第7、14、21天（d7、d14、d21）处死并取材，采用免疫组织化学S-P法检测血小板内皮细胞黏附分子31（CD31）蛋白表达，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅳ型胶原蛋白（Col-Ⅳ）、促血管生成素-1（Ang-1）/酪氨酸激酶受体-2（Tie-2）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）、闭合蛋白（Occludin）蛋白表达，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测肾组织Ang-1/Tie-2、VEGF、VE-cadherin、Occludin mRNA表达，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测小鼠活性氧（ROS）水平。结果 与假手术组比较，模型组肾组织中CD31表达明显减少且随造模时间延长而加重（P<0.05），α-SAM、Col-Ⅳ蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；但d14~d21间CD31表达趋于平稳；ROS水平显著升高（P<0.01）；Ang-1/Tie-2、VEGF、VE-cadherin、Occludin蛋白表达及mRNA表达显著下调（P<0.01）。与模型组比较，白藜芦醇组、益肾活血方中、高剂量组治疗后CD31表达量明显增加（P<0.05），α-SAM、Col-Ⅳ显著下降（P<0.01），ROS含量显著减少（P<0.01），Ang-1/Tie-2、VEGF、VE-cadherin、Occludin的蛋白表达及mRNA表达量均显著上调（P<0.01）。与白藜芦醇组比较，益肾活血方低剂量组与益肾活血方中剂量组Ang-1/Tie-2、VEGF、VE-cadherin、Occludin蛋白表达具有显著差异（P<0.01），益肾活血方高剂量组CD31、Ang-1/Tie-2 mRNA表达量差异无统计学意义，益肾活血方中剂量组ROS水平差异无统计学意义。结论 益肾活血方抗RIF作用可能与促进血管内皮修复、调控线粒体ROS减轻氧化应激，保护肾脏内皮结构完整性，延缓细胞凋亡，维持细胞能量代谢有关。     

通络生骨胶囊对糖皮质激素致血管内皮细胞功能损伤的保护作用

目的 观察通络生骨胶囊（TLSGC）对糖皮质激素致血管内皮细胞功能损伤的影响,并从丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路初步探索其作用机制。方法 取正常SD大鼠胸主动脉环,用甲泼尼龙琥珀酸钠（MPS,0.04 g·L^-1）和（或）血管内皮细胞生长因子（VEGF,20 μg·L^-1）体外干预,加入TLSGC（12.5,25,50 μg·L^-1）连续作用5 d,观察血管环芽出的微生血管数目、长度和面积;此外,以甲泼尼龙琥珀酸钠（MPS,0.04 μg·L^-1）加入由VEGF（20 μg·L^-1）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,再加入TLSGC（12.5,25,50 μg·L^-1）,然后分别采用transwell迁移,transwell侵袭及管腔形成实验检测HUVEC的迁移、侵袭及管腔形成能力,并以硝酸还原酶法检测细胞上清中一氧化氮（NO）含量,干粉法检测细胞上清中内皮素-1（ET-1）含量,蛋白免疫印迹法检测细胞中血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）,ERK,磷酸化（p）-ERK,MEK和p-MEK蛋白表达量。结果 与正常组比较,MPS能明显抑制由VEGF诱导的大鼠胸主动脉环微血管数目、长度和面积以及HUVEC细胞迁移、侵袭和管腔形成能力,降低NO并升高ET-1含量,MPS还能明显减少由VEGF诱导的VEGFR2,p-MEK和p-ERK在HUVEC中的蛋白含量（P<0.05,P<0.01）;与模型组比较,TLSGC能剂量依赖地改善由MPS降低的大鼠胸主动脉环微血管数目、长度和面积以及HUVEC细胞迁移、侵袭和管腔形成能力,提高HUVEC中的NO,VEGFR2,p-MEK和p-ERK蛋白含量并降低ET-1含量（P<0.05,P<0.01）。结论 TLSGC对糖皮质激素所致血管内皮细胞血管生成和分泌功能的损伤具有保护作用,其机制可能与活化MEK/ERK信号通路有关。     

淫羊藿总黄酮对大鼠急性心肌梗死后缺血心肌血管新生作用的影响

目的 研究淫羊藿总黄酮在大鼠急性心肌梗死后对缺血心肌血管新生的促进作用,探讨其在抗心肌缺血,改善心功能方面的分子生物学机制。方法 采用大鼠冠状动脉左前降支结扎的方法建立大鼠急性心肌梗死模型。雄性SD大鼠随机分为假手术组、心肌梗死模型组,地尔硫卓组（10 mg·kg^-1·d^-1）和淫羊藿总黄酮高、低剂量组（200,100 mg·kg^-1·d^-1）,每组8只。模型组、假手术组均给予同体积生理盐水干预。手术成功后开始每天灌胃1次,共7 d。给药结束后,采用小动物超声影像系统检测各组大鼠心脏结构与功能;苏木素-伊红（HE）染色法观察大鼠心肌缺血区病理改变;免疫组化法检测大鼠缺血心肌组织CD31与α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达变化;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠心肌组织血管内皮生长因子受体2（VEGF-R2）表达和蛋白激酶B磷酸化（p-Akt）水平;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）法检测心肌缺血部位血管内皮生长因子（VEGF）与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）mRNA的表达变化。结果 与假手术组比较,模型组大鼠心脏左室收缩末期内径（LVIDs）,左室舒张末期内径（LVIDd）,左室收缩末期容积（LVEVs）和左室舒张末期容积（LVEVd）均显著增加,而左室前壁收缩末期厚度（LVAWs）,左室前壁舒张末期厚度（LVAWd）,左室后壁收缩末期厚度（LVPWs）,每搏输出量（SV）,射血分数（EF）,短轴缩短率（FS）和心输出量（CO）显著下降,心肌缺血组织出现显著病理性改变,而CD31与α-SMA表达显著降低（P<0.01）;同时p-Akt水平,VEGF-R2蛋白表达,VEGF与bFGF mRNA表达也显著下降（P<0.01）。与模型组比较,淫羊藿总黄酮高剂量组大鼠心肌缺血病理变化明显改善;心脏LVIDs,LVIDd,LVEVs和LVEVd均明显下降,而LVAWs,LVAWd,LVPWs,SV,EF,FS和CO明显增加,心肌缺血组织CD31与α-SMA表达升高（P<0.05,P<0.01）;同时p-Akt水平,VEGF-R2蛋白表达以及VEGF与bFGF mRNA表达也明显增加（P<0.05,P<0.01）。结论 淫羊藿总黄酮能够通过上调急性心肌梗死后缺血心肌bFGF,VEGF及其受体VEGF-R2表达,激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt/VEGF细胞信号传导通路促使缺血心肌血管新生,从而改善心肌梗死区周边心肌有效灌注不足,减缓急性心肌梗死后心室重构和心力衰竭的发展。     

基于Akt/JNK/p38 MAPK信号通路探讨健脾活骨方对酒精致血管内皮细胞功能损伤的保护作用

目的 观察健脾活骨方（JPHGP）对酒精致血管内皮细胞功能损伤的保护作用,并基于蛋白激酶B/c-Jun氨基末端激酶/p38 MAPK（Akt/JNK/p38 MAPK）信号通路探索相关作用机制。方法 通过鸡胚尿囊膜实验、胸主动脉环实验和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的迁移、侵袭、黏附和管腔形成实验,在有或无酒精诱导条件下,观察JPHGP不同质量浓度8、16、32 μg·L^-1对血管新生的影响;采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测HUVEC中Akt、JNK、p38 MAPK等磷酸化表达水平。结果 与正常组比较,模型组动脉环周围微血管数目及长度均减少,HUVEC的迁移、侵袭、和管腔形成能力降低（P<0.05,P<0.01）;JPHGP 16、32 μg·L^-1组作用后能明显升高鸡胚尿囊膜新生血管长度（P<0.05,P<0.01）,与模型组比较,JPHGP 8、16、32 μg·L^-1组能浓度依赖地增加胸主动脉环周围微血管数量（P<0.05,P<0.01）,JPHGP 32 μg·L^-1组能升高胸主动脉环周围微血管长度（P<0.05）;JPHGP 16、32 μg·L^-1组均能增强HUVEC的迁移、侵袭、和管腔形成能力。Western blot检测结果表明,与正常组比较,模型组中的p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-Akt/Akt蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）;与模型组比较,JPHGP 8、16、32 μg·L^-1组的p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-Akt/Akt蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）,JPHGP 16、32 μg·L^-1组的p-JNK/JNK的蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。结论 JPHGP对酒精致血管内皮细胞功能损伤具有保护作用,其机制可能与激活Akt/JNK/p38 MAPK信号通路有关,相关研究结果将为JPHGP“健脾活血”功效阐明提供一定的科学依据。     

黄芪赤风汤对脑梗死大鼠模型的治疗作用及对脑组织ZO-1、Claudin-5、P-gp、MRP1蛋白表达的影响

目的 探究黄芪赤风汤对大脑中动脉栓塞（MCAO）大鼠模型的治疗作用及机制。方法 将90只SPF级雄性大鼠随机分为假手术组，模型组，黄芪赤风汤高、中、低剂量组（中药低、中、高剂量组）（8.10、4.05、2.025 g·kg^-1），脑心通组（脑心通，0.32 g·kg^-1），建立MCAO大鼠模型，给予黄芪赤风汤药液进行干预，对各组大鼠进行神经功能学评分；大鼠脑组织采用2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）染色，计算脑梗死面积；采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组大鼠血清白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）含量；采用苏木素-伊红（HE）染色观察各组大鼠脑组织病理变化；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠脑组织闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、紧密连接蛋白-5（Claudin-5）、P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药蛋白1（MRP1）的表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分、脑梗死率显著增加（P<0.01），血清IL-6、IL-1β和MMP-9含量显著升高（P<0.01），脑组织ZO-1，Claudin-5蛋白表达水平显著降低（P<0.01），P-gp，MRP1蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠14 d神经功能评分明显降低（P<0.05，P<0.01），且有效改善脑组织病理变化，显著降低脑梗死率（P<0.01），血清IL-6、IL-1β、MMP-9表达水平明显降低（P<0.05，P<0.01），VEGFR2含量显著增加（P<0.01），中药高、中剂量组及脑心通组VEGF含量明星增加（P<0.05，P<0.01），中药低剂量组虽有下降趋势，但差异无统计学意义，中药高剂量组和脑心通组脑组织ZO-1、Claudin-5蛋白表达水平明显升高（P<0.05，P<0.01），P-gp、MRP1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 黄芪赤风汤可以通过改善脑组织病理变化，减少炎症反应、促进血管生成、调节血脑屏障（BBB）功能，从而发挥治疗脑梗死作用。     

青蒿琥酯对实验性脉络膜新生血管的干预作用及对视网膜脉络膜组织HIF-1α，VEGF表达的影响

目的 通过观察青蒿琥酯（ART）对实验性脉络膜新生血管（CNV）及相关蛋白表达的影响,探讨其对CNV的干预作用及可能机制。方法 将80只BN大鼠随机分为5组,每组16只,除正常组外,其余应用532 nm激光机建立CNV动物模型。5组分别灌胃给药14 d,ART低剂量、高剂量组10.08,20.16 mg·kg^-1·d^-1,正常组、模型组、康柏西普组等容积1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液灌胃,同时康柏西普组予5 μL玻璃体腔注射1次。分别在7,14 d应用眼底荧光素血管造影法（FFA）评价CNV荧光素渗漏情况（灰度值）,苏木素-伊红（HE）染色观察CNV组织病理学变化,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测视网膜脉络膜中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）,血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达水平。结果 FFA结果显示,与正常组比较,模型组灰度值在7 d及14 d时升高（P<0.01）;7 d时与模型组比较,ART高剂量组、康柏西普组灰度值降低（P<0.01）;14 d时与模型组比较,ART各剂量组、康柏西普组灰度值不同程度降低（P<0.05,P<0.01）。HE结果显示,与正常组比较,模型组CNV厚度值在7 d及14 d时显著升高（P<0.01）;与模型组比较,ART各剂量组、康柏西普组CNV厚度值降低（P<0.01）。与正常组比较,模型组HIF-1α,VEGF表达量在7 d及14 d时不同程度升高（P<0.05,P<0.01）;与模型组比较,ART各剂量组、康柏西普组表达量降低（P<0.01）。结论 ART对实验性CNV具有抑制作用,其机制与下调实验性CNV形成早期HIF-1α,VEGF的表达有关。