RNA干扰沉默NF-κB p65基因表达抑制胰腺癌PANC1细胞增殖与侵袭的研究

目的 运用RNA干扰技术阻断人胰腺癌细胞株PANC1的NF-κB p65表达,观察该基因沉默后对细胞增殖能力及体外侵袭能力的影响.方法 采用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA(siRNA)转染人胰腺癌细胞PANC1作为siRNA组,另设无同源性siRNA转染细胞的阴性对照组和蒸馏水空白对照组.实验重复6次.应用RT-PCR检测转染细胞NF-κB p65 mRNA与细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达.MTT结合克隆形成实验测定细胞生长抑制率.Matrigel细胞侵袭实验测定细胞体外侵袭能力.结果 siRNA组、阴性对照组和空白对照组NF-κB p65 mRNA相对表达量分别为0.227±0.045、0.381±0.038和0.404±0.031;ICAM-1 mRNA相对表达量分别为0.597±0.083、0.983±0.068和1.027±0.098;细胞生长抑制率(72 h)分别为18.3%、2.3%和0;克隆形成率分别为(14.1±3.1)%、(24.5±2.1)%和(27.2±2.6)%;侵袭细胞数分别为80.25±6.35、123.83±8.80和127.68±9.23.siRNA组均明显低于2个对照组(P＜0.01).结论 NF-κB p65的RNA干扰能抑制胰腺癌PANC1细胞NF-κB p65 mRNA和ICAM-1 mRNA的表达,抑制细胞的生长和侵袭.     

hFXYD6反义核酸对胆管癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响

目的:研究hFXYD6基因反义核酸对人胆管癌QBC939细胞体外增殖和侵袭能力的影响.方法:构建hFXYD6基因反义核酸真核表达载体pcDNA3.1(-)/hFXYD6(-)并转染人胆管癌QBC939细胞,同时设pcDNA3.1(-)空载体对照组和空白对照组.SYBR GreenⅠ荧光定量RT- PCR和免疫组化分别检测hFXYD6 mRNA及蛋白表达;MTT、平板克隆形成实验检测细胞体外增殖活性:流式细胞仪检测细胞周期;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力.结果:与空白组和空载组比较,反义组细胞hFXYD6 mRNA及蛋白表达量降低;细胞群体倍增时间增加(46.8 h vs 34.5 h,35.3 h),细胞克隆形成率降低(24.3%±5.3% vs 61.0%±8.5%,58.0%±5.6%,P<0.001);细胞周期中G1期细胞比例明显升高(66.4%±2.9% vs 33.5%±2.3%,39.4%±3.7%,P<0.001),S期比例明显减少(18.6%±1.6% vs 36.2%±2.1%,34.1%±1.6%,P<0.001);Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数无显著改变.空白组和空载组细胞间均无明显差异.结论:hFXYD6反义核酸抑制人胆管癌QBC939细胞体外增殖能力,但对其侵袭能力无明显作用.     

siRNA干扰缺氧诱导因子2α对乳腺癌细胞侵袭能力的影响及相关机制

目的探讨缺氧诱导因子(HIF)-2αsiRNA对乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力的影响及相关机制。方法采用RNA干扰(RNAi)技术沉默已建立的缺氧细胞模型MCF-7细胞中HIF-2α的表达;RT-PCR方法检测转染后MCF-7细胞中HIF-2αmRNA的表达;采用划痕实验和侵袭实验探讨细胞侵袭能力的变化;采用Western印迹和RT-PCR方法检测基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达。结果 RNAi结果显示,缺氧+siRNA组HIF-2αmRNA的表达与单纯缺氧组相比均明显降低(P<0.05);转染后划痕实验结果显示,缺氧+siRNA组与单纯缺氧组相比细胞伤口愈合速度明显减慢。Transwell侵袭实验显示,缺氧+siRNA组与单纯缺氧组相比穿膜细胞数显著减少(P<0.05);Western印迹和RT-PCR结果显示,缺氧+siRNA组与单纯缺氧组相比,MMP-2蛋白及mRNA表达均下调(P<0.05)。结论 HIF-2αsiRNA抑制乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的机制之一可能与MMP-2基因的表达下调有关。     

反义肝素酶基因对胰腺癌细胞体外增殖和侵袭的抑制作用

目的:研究反义肝素酶基因对人胰腺癌SW1990细胞体外增殖和侵袭能力的抑制作用．方法:反义肝素酶基因转染胰腺癌sW1990细胞,并设空载体对照组和空白对照组,以流式细胞仪检测细胞周期;免疫组化、Western blot及RT-PCR检测肝素酶蛋白和mRNA表达;平板克隆形成实验检测细胞增殖活性,Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力．结果:与空白组和空载组比较,反义组细胞周期中S期比例明显减少(18.8％±2．5％vs 36．3％±2．2％,33．2％±2．1％,P<0．01),G1期细胞比例明显升高(66．0％±2．7％vs30．7％±3．2％,39．8％±4．9％,P<0．01);肝素酶蛋白及mRNA表达分别降低34．3％和37．8％:细胞克隆形成数目减少(12．2±2．8 vs 30．8±4．4,28．3±2．7,P<0．01);Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数减少(13．0±3．5 vs 34．8±5．8,29．4±5．6．P<0．01)．结论:反义肝素酶基因抑制人胰腺癌SW1990细胞体外增殖及侵袭能力．     

VEGF促进肝癌SMMC-7721细胞侵袭性的自分泌机制

目的:探讨促血管内皮生长因子(VEGF)对人肝癌细胞SMMC-7721侵袭力以及对该细胞中基质金属蛋白酶9(MMP-9)的影响,初步研究VEGF对肿瘤侵袭和转移的影响及可能的作用机制.方法:使用VEGF体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,通过细胞体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变,再分别使用30μg/L、10μg/LVEGF培养人肝癌SMMC-7721细胞,以正常培养人肝癌SMMC-7721细胞为空白对照组.使用半定量RT-PCR和Western blot法对3组细胞中MMP-9的mRNA和蛋白表达水平进行分析.结果:细胞体外侵袭实验显示,外加VEGF培养后,细胞侵袭力明显增强(P0.01);MMP-9mRNA和蛋白的表达在外加VEGF组中要明显高于空白对照组(0.479±0.025,0.665±0.024vs 0.315±0.022;0.521±0.026,0.662±0.026vs 0.366±0.025,均P<0.01),且高浓度和低浓度组之间也有明显差别.结论:肝癌SMMC-7721细胞系中存在有自分泌机制,VEGF可通过自分泌机制上调肝癌细胞的MMP-9表达,进而促进肿瘤的浸润转移.     

siRNA沉默Cyclin E基因对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:观察siRNA沉默Cyclin E基因表达对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:构建2个靶向Cyclin E基因siRNA载体,转染人肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞.RT-PCR、Western blot检测转染后HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞Cyclin E基因mRNA和蛋白表达水平.CCK-8试验、软琼脂克隆形成实验检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖、克隆形成能力.流式细胞术、transwell试验分别检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞周期和侵袭能力.结果:构建的2个Cyclin E基因siRNA载体插入序列与所设计序列均一致;转染HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞后,干扰1组、干扰2组与空白对照组和阴性对照组比较,C y c l i n E m R N A和蛋白表达量均显著降低(P<0.05),细胞生长速度延缓,软琼脂细胞集落形成数、穿透细胞数均显著降低(P<0.05),S和G2/M期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例增加.结论:沉默肝癌细胞Cyclin E表达水平,可有效抑制细胞生长、增殖和侵袭能力.     

反义Snail转录因子抑制肝癌转移

目的:研究反义Snail转录因子体外抑制肝癌转移的作用.方法:采用RT-PCR技术分别检测肝癌细胞株HepG2中SnailmRNA和E钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA的表达水平.将HepG2细胞分为转染反义Snail质粒(反义组)和空载体质粒(对照组),观察Snail对E-cadherinmRNA表达的逆转作用及对肝癌细胞体外侵袭、运动的抑制作用.结果:SnailmRNA在HepG2细胞中有表达,E-cadherinmRNA在HepG2细胞中没有表达.HepG2细胞瞬时转染0,24,48h时,SnailmRNA的表达水平分别为0.887±0.005,0.665±0.010,0.348±0.012;同时,E-cadherinmRNA开始有表达,分别为0,0.160±0.001,0.299±0.005,各时间点间分别比较,有显著性差异(P<0.05).HepG2细胞稳定转染后,反义组、对照组SnailmRNA表达水平分别为0.131±0.010,0.3577±0.020,两组比较有显著性差异(P<0.05);反义组E-cadherinmRNA开始有表达,表达水平为0.476±0.030,而对照组为0,两组比较有显著性差异(P<0.01);检测间质细胞标志物纤维连接蛋白mRNA的表达水平,反义组显著低于对照组(0.201±0.010vs0.558±0.010,P<0.01).体外细胞运动实验表明,反义组、对照组跨膜细胞数分别为(48±2)个和(401±17)个,有显著性差异(P<0.01).重组细胞基底膜侵袭实验显示,两组穿透基底膜细胞数分别为(39±8)个和(211±61)个,显著性差异(P<0.05).结论:肝癌细胞中存在SnailmRNA与E-cadherinmRNA表达的负向关系,抑制SnailmRNA的表达对肝癌细胞的侵袭和运动有抑制作用,可能为肝癌的基因治疗提供新的靶点.     

小干扰RNA沉默甲胎蛋白基因对HepG2细胞迁移及侵袭的影响

目的研究甲胎蛋白(AFP)对肝癌HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制。方法应用合成的靶向沉默AFP小干扰RNA(siRNA)转染肝癌HepG2细胞,分为空白对照、阴性对照组及AFP siRNA组,各组细胞干预48 h后,采用实时定量PCR(qRT-PCR)和ELISA法检测细胞转染后的沉默效率,Transwell小室实验检测沉默AFP基因后HepG2细胞的侵袭、迁移能力,用Western blotting法观察沉默AFP基因的表达对上皮-间质转化(EMT)相关蛋白(N-cadherin、Vimentin和E-cadherin)、AKT和p-AKT蛋白表达的影响。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果转染沉默后,与空白对照组相比,AFP siRNA组中AFP mRNA的相对表达量明显降低(P 0.01),抑制率达86.440%,同时AFP siR NA组细胞上清液中AFP蛋白表达水平同样明显降低(P 0.01)。与空白对照组相比,AFP siRNA组的迁移细胞数和侵袭细胞数显著下降,差异具有统计学意义(P值均0.01)。沉默HepG2细胞中AFP基因的表达后,与空白对照组比较,AFP siRNA组EMT相关蛋白E-cadherin蛋白的表达水平升高(P 0.01),而N-cadherin及Vimentin表达水平均明显降低(P值均0.05),且PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT的表达水平明显降低(P 0.01)。结论沉默AFP可抑制肝癌细胞转移,基于HepG2细胞株的机制研究可能与阻断PI3K/Akt通路抑制EMT相关。     

靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

目的: 构建靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用.方法: 设计合成靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与pSUPER载体连接, 构建VEGF siRNA表达载体, 经酶切鉴定和测序确认后, 脂质体2000介导VEGF siRNA转染HepG2细胞. RT-PCR及Western blot检测VEGFsiRNA表达载体转染的HepG2细胞中VEGF基因表达.结果: 通过双酶切鉴定和测序分析, 成功构建了靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体. RT-PCR和Western blot法检测转染VEGFsiRNA表达载体的HepG2细胞VEGF mRNA及VEGF165表达下调, 其抑制率分别为65%和74%. 实验组中的HepG2中VEGF mRNA表达较阴性对照组、空载体组表达量显著下降(0.304±0.062 vs 0.896±0.061, 0.884±0.074,P<0.05).结论: 成功构建了靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体, 且该载体在体外能有效抑制HepG2细胞VEGF基因表达.     

Dysadherin基因沉默对胰腺癌细胞侵袭移行能力的影响

目的 探讨靶向封闭dysadherin基因对胰腺癌细胞PANC1、BxPC3体外侵袭移行能力的影响.方法 应用脂质体转染方法将小分子RNA(siRNA)转染细胞.实验分为dysadherin-siRNA转染(dysa)组、阴性对照siRNA转染(HK)组、脂质体对照(对照)组、.采用RT-PCR、免疫组化方法检测转染细胞的dysadherin mRNA及蛋白表达;采用Transwell侵袭小室检测转染细胞体外侵袭移行能力.结果 转染dysadherin-siRNA(5 nmol/L)的PANC1和BxPC3细胞的dysadherin mRNA表达较HK组细胞分别下降95.4%、52.1%(P＜0.05);dysadherin蛋白表达亦分别降低91.2%、83.6%(P＜0.01).PANC1细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为163.2±15.5、154.4±17.3和53.6±7.9;BxPC3细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为30.7±3.2、27.5±2.8和4.7±2.4.dysa组显著低于HK组和对照组(P值均＜0.01).结论 应用RNA干扰技术沉默人胰腺癌细胞株PANC1、BxPC3的dysadherin基因可使细胞的侵袭移行能力下降.     

介导EGFR siRNA转染肝癌HepG2细胞的试剂筛选及条件优化

目的筛选介导表皮生长因子受体（EGFR）小干扰RNA（siRNA）转染肝癌HepG2细胞的试剂,并优化转染条件。方法设计靶向EGFR的特异性siRNA,分别用Lipofectamine 2000、siPORT Amine、ICAFectin 442、N-TER nanoparticle、X-tremeGENE、polyMagnetofection、combiMAGnetofection介导转染肝癌HepG2细胞48、72 h。实时定量RT-PCR检测HepG2细胞的EGFR mRNA,计算敲除EGFR mRNA率,据此筛选出最佳转染试剂,继续进行不同试剂用量、不同siRNA浓度、正反向转染的对比。测算转染后细胞存活率及转染率。结果 Lipofectamine2000、siPORTAmine及combiMAGnetofection介导转染72 h后,HepG2细胞的EGFR mRNA敲除率均超过65%。2μl的combiMAGnetofection及200 nM的EGFR siRNA组合、72 h时HepG2细胞的EGFR mRNA沉默效率最高（90%±1%）,其细胞存活率为94%±8%,转染率超过95%。结论介导EGFR siRNA转染HepG2细胞的最佳试剂是combiMAGnetofection,优化转染条件为2μl的combiMAGnetofection、200 nM的EGFR siRNA、转染72 h。     

针对STAT3的siRNA抑制HepG2细胞增殖和p44/42MAPK蛋白的表达

目的研究STAT3信号传导通路对HepG2细胞p44/42MAPK蛋白表达和细胞生长的影响。方法将针对STAT3的siRNA转染入HepG2细胞以沉默STAT3基因的表达,采用MTT法检测细胞生长,采用Western blot法检测STAT3和p44/42MAPK蛋白的表达。结果对照组和lipofectamineTM2000处理组细胞生长无明显差异(q=0.97,P0.05),而siRNA处理组细胞生长被明显抑制(q=9.36,P0.05);SiRNA转染后24h、48h、72h和96h,细胞抑制率分别为33.2%、39.6%4、3.1%和33.9%s,iRNA在96h后抑制作用减弱,细胞开始重新繁殖;转染细胞72h和96h后,可见STAT3蛋白表达均被抑制(t=14.12,P0.05),p44/42MAPK蛋白表达未被抑制(F=3.99,P0.05),而p-p44/42MAPK蛋白表达增加(t=16.30,P0.05)。结论 STAT3信号传导通路可以影响细胞生长及p44/42MAPK蛋白质的磷酸化,而p-p44/42MAPK的表达增加可能代偿了沉默STAT3引起的细胞生长抑制,使细胞重新繁殖。     

The inhibition effect and its molecular mechanism of human cervical cancer oncogene siRNA on hepatocarcinoma cells

OBJECTIVE: To evaluate the effect and the possible mechanism of HCCR siRNA on cell proliferation and apoptosis of hepatocarcinoma cells. METHODS: pRIV2-siHCCR plasmids, which express small interfering RNA of HCCR were constructed and transfected into HepG2 cells. The mRNA and protein expressions of HCCR were detected by real time PCR and Western blot. The proteins p15, p16, p27, p53, and PTEN were detected by Western blot. The cell proliferation and apoptosis were observed by MTT and FACS. RESULTS: The plasmid pRIV2-siHCCR was constructed successfully. Real time PCR and Western blot analysis showed that the HCCR siRNA effectively inhibited HCCR expression in HepG2 cells after pRIV2-siHCCR transfection. MTT method confirmed that HepG2 cell proliferation was suspended, while the cell apoptosis was increased much more than that in the control group. After the transfection with the plasmid of pRIV2-siHCCR into HepG2 cells, the expression of p53 protein was decreased, and P15 increased; and levels of PTEN, p16, and p27 were evidently not changed. CONCLUSION: After being transfected with HCCR siRNA expression plasmid, the cell proliferation of HepG2 was arrested, while the apoptosis of HepG2 cells increased. Our results demonstrate the potential role of p53 and p15 in HCCR signaling.     

靶向cyclinE小干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:以cyclinE基因编码区为靶位,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,观察转染后对HepG2细胞的影响.方法:针对cyclinE基因序列构建表达siRNA的真核表达载体pSilencer3.1-H1hygro,利用脂质体Metafectene转染CyclinE基因高表达的肝癌细胞株HepG2.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR和Western blot法观察转染后细胞cyclinE基因表达.结果:成功构建了表达siRNA的真核质粒载体,转染后cyclinE基因mRNA及蛋白表达水平分别下降了79%和65%.结论:靶向cyclinE基因的siRNA可有效沉默HepG2细胞高表达的cyclinE基因,从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡.     

Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference in HepG2.2.15

INTRODUCTION Hepatitis B is a severe infectious disease threatening peoples’ health all over the world. There is still no efficient therapy to control HBV persistent replication, which may lead to the development of liver cirrhosis and hepatocellualar ca…     

RhoA因子在单增李斯特菌侵袭HepG2细胞中的作用

目的研究HepG2细胞的Rho家族RhoA因子在Lm侵袭中的作用。方法构建真核表达载体p3×FLAG-Myc-CMV-24-RhoA,经脂质体法转染HepG2细胞,使HepG2细胞过表达RhoA;同时针对RhoA序列合成siRNA,脂质体法转染HepG2细胞,抑制HepG2细胞RhoA表达。2种细胞同时感染Lm,通过Real-time PCR检测HepG2细胞RhoA上调/下调时培养物中Lm-Hly基因拷贝数,评估Lm数量。结果HepG2细胞转染p3×FLAG-Myc-CMV-24-RhoA载体后,Western blotting法检测RhoA表达量升高,且48 h升高显著,此时HepG2细胞内Lm数量明显低于对照组;HepG2细胞转染siRNA后,Western blotting法检测RhoA表达量降低,且72 h降低显著,此时HepG2细胞内Lm数量明显高于对照组。结论Lm侵入受HepG2细胞RhoA因子调控,主动下调细胞RhoA因子表达可能是Lm侵袭机制之一。     

人宫颈癌基因小干扰RNA抑制HepG2细胞生长的作用及其机制

目的 利用RNA干扰技术探讨人宫颈癌基因(HCCR)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制. 方法 构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR,将其转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量PCR、Westem blot检测HCCR及其相关基因的表达,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖状态,流式细胞术观察细胞凋亡与细胞周期变化. 结果 成功构建真核表达质粒pRIV2-siHCCR,其表达的HCCR siRNA可有效抑制HepG2细胞内HCCR的表达,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加.Western blot结果显示HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后,细胞内P53蛋白的表达降低,P15蛋白的表达明显升高,而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变. 结论 HepG2细胞中HCCR蛋白下调后,细胞增殖受到抑制,凋亡细胞增多,其作用机制可能与蛋白质P53、P15有关.     

小干扰RNA抑制核因子-κB活化对HepG2细胞凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(SiRNA)抑制核转录因子(NF)-κB活化对肝癌细胞凋亡的影响.方法 化学合成NF-κB siRNA和阴性对照siRNA,脂质体法转染HepG2细胞,用巢式RT-PCR和荧光定量PCR检测NF-κB mRNA表达情况;免疫组织化学法、酶联免疫吸附法、Western b10t检测NF-κB蛋白表达情况;用磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素法检测细胞凋亡,分析NF-κB表达抑制和细胞凋亡间关系.多个样本均数间的比较先行方差齐性检验,方差齐时行单因素方差分析;计数资料比较采用确切概率法分析.结果 NF-κBp65 mRNA在HepG2细胞相对表达量为1.13±0.03,在正常肝细胞L02为0.29±0.07,两者比较,t=27.02,P<0.05,差异有统计学意义.利用NF-κB siRNA干扰可下调NF-κB表达,且呈剂量、时间依赖;NF-κB siRNA转染HepG2细胞72h后,NF-κBmRNA和蛋白表达分别下降了93%和62%,抑制NF-κB表达使HepG2细胞凋亡增加85%. 结论 NF-κB在肝癌细胞中高表达,NF-κB SiRNA能特异性抑制其在肝癌细胞中活化并促进癌细胞凋亡发生.     

RNAi特异性抑制FoxO3a对软脂酸诱导HepG2.2.15细胞凋亡的影响

目的:观察FoxO3a基因干扰对软脂酸诱导HepG2.2.15细胞凋亡的影响.方法:HepG2.2.15细胞分五组:mock组(加脂质体)、FoxO3a siRNA组、FoxO3a siRNA+软脂酸组、阴性siRNA对照组、阴性siRNA+软脂酸组;Western blot法检测细胞的FoxO3a蛋白表达水平.MTT...