化瘀祛痰方药及其拆方对内皮细胞TLR4/NF-κB炎症信号通路干预的研究

目的探讨化瘀祛痰方药及其拆方含药血清对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞EA.hy926 TLR4/NF-κB信号通路活化的干预作用。方法 40只SD大鼠随机分为5组,即空白对照组、全方组、补气组、化瘀组、祛痰组,各组大鼠分别以生理盐水和相应中药煎剂连续灌胃9 d,末次灌胃给药2 h后,腹主动脉采血,离心后分离血清。体外培养EA.hy926细胞,随机分为7组,即①正常对照组、②LPS刺激组、③全方组、④补气组、⑤化瘀组、⑥祛痰组、⑦空白血清对照组。其中②组加入终浓度为10μg/ml的LPS,③～⑦组用各组含药血清(浓度为10%)预处理24 h后加入终浓度为10μg/ml的LPS,各组细胞培养24 h后进行各项指标测定。采用实时定量反转录-聚合酶链反应(Real-time PCR)定量分析TLR4、NF-κB和TNF-αmRNA表达;ELISA法检测TNF-α含量;Western印迹检测TLR4、NF-κB蛋白表达。结果与正常对照组相比,LPS刺激后TLR4、NF-κB和TNF-α表达显著增加(P<0.01),全方组TLR4、NF-κB和TNF-α的表达与刺激组相比显著减少(P<0.01);拆方各组中,化瘀组TLR4、NF-κB和TNF-α水平均显著减少(P<0.01),而补气组和祛痰组TLR4、NF-κB和TNF-α水平降低不明显。结论化瘀祛痰方药及化瘀拆方可显著抑制内皮细胞TLR4/NF-κB炎症信号通路的活化,这可能是其抗AS的作用机制之一。     

从TLRs介导的炎症信号通路研究补肾方的抗肝损伤机制

目的:从TLRs介导的炎症信号通路探讨补肾方的抗肝损伤机制。方法:将42只SPF级健康成年C57BL小鼠,雌雄各半,随机分为正常组、模型组、补肾全方组和拆方组(补肾阴组、补肾阳组、清化湿热组、引经药组)。每天给药1次,连续给药7天,第7天给药后4h,除正常组外,均给予刀豆蛋白A 15mg/kg尾静脉注射,注射后18h摘眼球处死老鼠。检测肝功能,肝组织HE染色,ELISA法检测外周血相关炎症介质,Western Blot法检测TLR3/4/9相关信号通路链中关键蛋白。结果:肝功能指标中,补肾全方组的ALT、AST均显著下降(P0.05)、ChE显著上升(P0.05);补肾阳组在AST中下降明显(P0.05),补肾阴组在ALT中下降明显(P0.05)。肝组织HE染色表明,各组均具有一定的改善肝组织炎症坏死的作用,与模型组相比,补肾全组、补肾阳组中坏死区域的面积显著减小。外周血主要炎症介质结果表明,补肾全方组的IL-6、IL-1、TNF-α、TNF-β均显著下降(P0.05),补肾阳组的TNF-β和IL-1显著下降(P0.05),而补肾s阴组的TNF-α、TNF-β和IL-6显著下降(P0.05)。Western Blot检测结果表明,ConA处理后TLR3/4/9相关信号通路链中的关键蛋白如TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NF-κB、TIRP、myd88的表达均增加,补肾全方及其拆方处理后,TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、NF-kB、MyD88在补肾全组中表达减少,TLR9、TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88在补肾阳组中表达减少,TLR9、TLR3、TRAF6、NF-kB在补肾阴组中表达减少,TRAF6在清化湿热组中表达减少。结论:补肾方能通过影响TLRs介导的炎症信号通路,下调炎症介质,发挥其抗肝损伤作用。     

替罗非班通过上调miR-22保护ox-LDL诱导的脐静脉内皮细胞损伤

目的探讨替罗非班对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的脐静脉内皮细胞(EA.hy926)损伤的影响和可能机制。方法采用低、中、高剂量的替罗非班作用于ox-LDL诱导的EA.hy926细胞,采用细胞计数法(CCK-8)、流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-22表达水平。酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平。转染miR-22模拟物上调EA.hy926细胞中miR-22表达水平,采用上述方法检测上调miR-22对ox-LDL诱导的EA.hy926细胞损伤的影响。结果替罗非班作用于ox-LDL诱导的EA.hy926细胞后,细胞存活率显著升高,凋亡率显著降低,细胞培养上清液中TNF-α和IL-6含量显著降低,miR-22表达显著升高(P0.05)。上调miR-22表达后,ox-LDL诱导的EA.hy926细胞培养上清液中TNF-α和IL-6含量显著降低,细胞存活率显著升高,凋亡率显著降低(P0.05)。结论替罗非班能够减轻ox-LDL诱导的脐静脉内皮细胞凋亡和炎症反应,其机制可能与上调miR-22表达有关。     

基于p38MAPK通路探讨疏肝健脾方药含药血清对LPS刺激下大鼠Kupffer细胞炎症损伤保护作用的机制

目的基于p38MAPK通路探讨疏肝健脾方药含药血清对脂多糖(LPS)刺激大鼠Kupffer细胞炎症损伤的保护作用。方法体外培养并鉴定SD大鼠Kupffer细胞,提取并制备疏肝健脾方药含药血清,在LPS刺激大鼠Kupffer细胞产生炎症反应基础上,对Kupffer细胞进行疏肝健脾方药含药血清、p38MAPK抑制剂药物干预,ELISA法检测Kupffer细胞上清液中白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量的表达,Western印迹检测Kupffer细胞TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表达。结果疏肝健脾方药含药血清提取量约为每只2~3 ml,大鼠获得纯化并经免疫荧光法鉴定Kupffer细胞(0.5~1.0)×107个,Typan blue染色测定细胞活力均在95%以上;LPS组较空白血清组IL-6、TNF-α水平均有显著升高(P0.01);与LPS组比较,各药物干预组IL-6、TNF-α表达水平显著降低(P0.01);与空白血清组比较,LPS组的p38MAPK、p-p38MAPK、TLR4蛋白表达均有显著升高(P0.01);与LPS组比较,SB239063能显著下调p38MAPK的蛋白表达水平(P0.01),肝健脾组亦有下调,但无显著差异(P0.05);疏肝健脾组、SB239063组的p-p38MAPK蛋白表达水平均下调显著(P0.01);TLR4蛋白表达水平以疏肝健脾组下调具有显著性差异(P0.01),SB239063组下调无显著差异(P0.05)。结论疏肝健脾方药可能对LPS刺激大鼠Kupffer细胞炎症损伤发挥保护作用,而含药血清可能是其重要作用途径之一。     

丙泊酚对LPS刺激人单核细胞分泌TNF-α及TLR4表达的影响

将不同浓度丙泊酚作用于脂多糖(LPS)激活的人外周血单核细胞24 h,ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α的水平,流式细胞仪检测单核细胞表面TLR4的表达变化.结果 随丙泊酚浓度的升高,LPS刺激单核细胞引起的TLR4表达逐渐降低.相关分析示,TNF-α与TLR4表达呈正相关.证实丙泊酚可抑制LPS刺激单核细胞引起的TNF-α释放,且呈剂量依赖性;其机制可能为降低单核细胞TLR4的表达.     

IRAK-M在内毒素诱导Kupffer细胞耐受中的表达及其意义

目的:观察内毒素耐受状态TKupffer细胞中白介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)的表达并探讨其在Kupffer细胞内毒素耐受形成中的作用.方法:通过脂多糖(LPS,10μg/L)预处理建立内毒素耐受Kupffer细胞模型,并与对照组细胞进行比较;在LPS(100 μg/L)刺激后不同时点,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中TNF-α水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中TNF-α和IRAK-M的mRNA表达,TransAM NF-kB Kit检测细胞中NF-kB活性,蛋白印迹法(Western blot)检测细胞中IRAK-M蛋白表达.结果:LPS刺激在两组细胞中均引起TNF-α释放增加.TNF-α mRNA表达以及NF-kB活性增强,但耐受组细胞的三种指标明显低于对照组(P＜0.05);对照组细胞在LPS刺激24 h后才能检测出IRAK-M mRNA的表达,而耐受组细胞在LPS刺激前已可检测到IRAK-M的基因表达,且该表达在LPS刺激后迅速增强,于6 h达高峰,24 h时仍明显高于对照组(P＜0.05);对照组细胞在LPS刺激24 h后才有微弱的IRAK-M蛋白表达,而耐受组细胞在LPS刺激前已有IRAK-M的蛋白表达,并随LPS刺激进一步上调,两组有显著差异(P＜0.01).结论:内毒素耐受状态下,Kupffer细胞中的IRAK-M表达明显增强,IRAK-M可能在Kupffer细胞内毒素耐受形成中起重要作用.     

汉滩病毒感染EA.hy926细胞上调固有免疫相关分子表达的研究

目的　探讨汉滩病毒（hantaan virus, HTNV）感染EA.hy926细胞诱导抗病毒固有免疫相关分子的表达,为建立HTNV感染的细胞模型提供依据。方法　将HTNV感染EA.hy926细胞,利用间接免疫荧光和实时荧光定量PCR技术于不同感染时间段,检测EA.hy926细胞中模式识别受体、细胞因子及抗病毒相关分子的mRNA表达水平。结果　HTNV感染EA.hy926细胞后,随着感染时间的持续,核蛋白mRNA相对表达倍数显著上调,且不同感染时间段差异具有统计学意义（P＜0.05）;与未处理组相比,HTNV感染EA.hy926后,Toll样受体3、RIG-I和MDA5模式识别受体mRNA相对表达倍数均显著上调（P均＜0.05）,IL-6、IL-10、IFN-β和CCL5细胞因子mRNA相对表达倍数均显著上调（P均＜0.05）,ISG15、MxA、OAS1、IFITM1和IFITM3抗病毒相关分子mRNA相对表达倍数均显著上调（P均＜0.05）。结论　HTNV感染EA.hy926细胞后,可上调抗病毒固有免疫相关分子的表达,该细胞可以作为体外HTNV感染的细胞模型。     

槲皮素对软脂酸诱导的EA.hy926细胞eNOS合成的影响

目的研究槲皮素对软脂酸诱导EA.hy926细胞e NOS合成的影响。方法体外培养EA.hy926细胞,分正常对照组、模型组、槲皮素组、二甲双胍组,采用RT-PCR法及免疫组化法,测定各组细胞e NOS m RNA和蛋白表达。结果模型组细胞e NOS m RNA和蛋白表达显著低于正常对照组(P0.05),药物组与模型组相比e NOS m RNA及蛋白表达显著增加(P0.05),药物组间差异无统计学意义(P0.05)。结论槲皮素对软脂酸诱导EA.hy926细胞e NOS合成具有显著促进作用。     

细胞因子和脂多糖对人结肠癌细胞系HT-29 Toll样受体4表达和调控的影响

背景：正常肠上皮作为物理屏障能限制肠道微生物的入侵。肠上皮细胞极低表达Toll样受体（TLR）4和髓样分化蛋白（MD）-2，不与脂多糖（LPS）反应。目的：探讨以细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、干扰素（IFN）-γ和LPS刺激人结肠癌细胞系HT-29后，TLR4和MD-2的表达及其对LPS反应性的变化。方法：将FIT-29细胞分为8组，分别加入RPMI1640、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、LPS、TNF-α＋LPS、IL-1β＋LPS、IFN-γ＋LPS干预；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测各组细胞上清液内IL-8水平；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞TLR4和MD-2 mRNA的表达。结果：TNF-α、IL-1β和IFN-γ能显著上调HT-29细胞TLR4、MD-2 mRNA和IL-8的表达（P〈0．01）；HT-29细胞与，TNF-α、IL-β、IFN-γ预孵育后再以LPS刺激，IL-8的表达进一步上调（P〈0．01）。结论：细胞因子（TNF-α，IL-1β，IFN-γ）可增加肠上皮细胞TLR4和MD-2的表达，促进其对LPS的反应，引起肠上皮细胞对常驻菌的过度反应．从而启动或加重肠道炎症。     

锌指蛋白A20抑制Toll样受体4介导的人单核细胞炎症反应的实验研究

目的:观察锌指蛋白A20过度表达对人单核细胞膜Toll样受体(TLR4),下游促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与白细胞介素(IL)-12,以及抗炎因子IL-10表达的影响,探讨锌指蛋白A20对单核细胞炎症反应的抑制作用及可能的调节机制。方法:Ficoll细胞分离液分离人外周血单核细胞,随机分为对照组、脂多糖(LPS)组、A20转染组与LPS+A20转染组。荧光显微镜检测GFP报告基因,免疫组织化学检测A20蛋白的表达,RT-PCR检测A20及TLR4的mRNA表达,流式细胞检测技术检测TLR4的蛋白表达,ELISA方法检测上清液TNF-α、IL-12及IL-10表达水平。结果:LPS刺激后,单核细胞TLR4和内源性A20的mRNA和蛋白、TNF-α、IL-12和IL-10表达较对照组均明显升高(均P<0.01);TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10均明显高于对照组(均P<0.01);转染A20基因的单核细胞,在无LPS刺激的条件下,上述指标与对照组相比均差异无统计学意义;转染A20基因的单核细胞在LPS刺激后,TLR4mRNA和蛋白、TNF-α、IL-12的表达以及TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10均显著低于LPS组,而IL-10的表达明显高于对照组和LPS组(均P<0.01)。结论:TLR4激活介导单核细胞的炎症反应,且正反馈调节其自身受体TLR4和内源性A20的表达;A20参与单核细胞TLR4激活所介导的炎症反应,其表达增加与TLR4表达的增加有关;单纯提高A20表达对未被激活的单核细胞TLR4及其信号通路影响不大;A20过表达可抑制TLR4激活所介导的单核细胞的炎症反应。