庚型肝炎病毒NS5基因重组质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

我们对中国南方株ＨＧＶＮＳＳ部分基因进行分子克隆，并将其插人质粒表达载体ＰＱＥ３０．构建重组表达质粒，在大肠杆菌中进行表达。一、材料与方法１．主要试剂：ＡＭｙ-ＲＴ为Ｐｒｏｍｅｇｓ公司产品，限制性内切酶、Ｋｌｅｎｏｗ酶及Ｔ４ＤＮＡ连接自购自ＢＯｅｈｒｉｌｌｕｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ公司，质粒ｐＵｃｌ吕与＊ＨＳＱ菌由中山医科大学分子医学中心提供，质粒ＰＱＥ３０与Ｍ１５菌由中国军事医学科学院微生物所提供。２．ＨＧＶＮＳＳ的分子克隆与测序：经计算机分析ＨＧＶ基因编码蛋白质阅读框架及抗原表位，选择ＮＳＳ区抗…     

白细胞介素12对小鼠肝癌基因治疗的实验研究

目的：研究白细胞介素１２对小鼠肝癌细胞基因治疗效果。方法：利用脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ）及脊髓灰质炎（Ｐｏ－ｌｉｏ）病毒内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）,连接ｍＩＬ－１２ Ｐ４０及ｐ３５ ｃＤＮＡｓ和筛选基因新霉术磷酸转移酶（ＮｅｏＲ）,克隆至逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ中,使三个基因同时受逆转录病毒载体５’端ＬＴＲ启动子控制,转录至同一ｍＲＮＡ转录本上,从而构建成多顺反子逆转录病毒载体,即ｐＧＣＥＮ／ｍＩＬ－１２。在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将ｐＧＣＥＮ／ｍＩＬ－１２转染包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选,直至出现阳性克隆（命名为：Ｍ４５／ｍＩＬ－１２）,挑取抗性克隆,扩大培养,收集上清,用小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３测定病毒滴度。然后用重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,Ｇ４１８筛选,直至出现阳性克隆,扩大培养,对阳性克隆进行鉴定。将６０Ｃｏ照射（６０ Ｇｙ）Ｍ４５／ｍＩＬ－１２细胞对荷瘤小鼠进行瘤内接种,每周一次,连续治疗三次,观察其治疗效果。结果：病毒上清中重组逆转录病毒滴度为５×１０~５ＣＦＵ／ｍｌ。 ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ证明外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中,以及外源基因在ｍＲＮＡ水平上的表达。     

HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达

１．材料与方法：乳哺动物细胞表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ,长约４．５ｋｂ,带有Ｔ_７公用序列。ｐＣＰ１０是ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ位点中插入双拷贝头尾相接的ＨＢＶａｙｗ亚型全基因ＨＢＶＤＮＡ重组质粒。ＰＣＲ引物ＸＩ１：１４２８－１４４８ｎｔ５'ＣＧＴ　ＣＣＣＧＴＣ　ＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣ３',ＸＩ_２：１６７２－１６５３ｎｔ５'ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧ３'。人肝癌细胞系ＳＭＭＣ－７７２１,出上海细胞所提供。将ＥｃｏＲＩ酶切后回收的全基因ＨＢＶ片段。在Ｔ_４ＤＮＡ连接酶作用下,与ＥｃｏＲＩ酶切…     

逆转录病毒介导的HSV-tk/GCV对肝癌细胞的影响

目的观察单纯疮疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ｔｋ）／丙氧鸟苷（ＧＣＶ）自杀基因治疗系统在体内外对人肝癌的杀伤效应。方法构建携带ＨＳＶ－ｔｋ基因的逆转录病毒载体,将该重组逆转录病毒感染人肝癌细胞ＨＣＣ９２０４,筛选稳定表达ｔｋ的细胞克隆ＨＣＣ９２０４／ｔｋ,并测定其在体外对ＧＣＶ的敏感性;ＨＣＣ９２０４／ｔｋ细胞在裸鼠皮下成瘤,用ＧＣＶ治疗并观察疗效。结果ＧＣＶ在体外对ＨＣＣ９２０４／ｔｋ细胞有明显的杀伤作用和旁杀伤效应,裸鼠体内ｅｘｖｉｖｏ实验得到相似结果,在体内外对未转染细胞则无明显毒性．结论在ｉｎｖｉｔｒｏ水平（指完全体外）和ｅｘｖｉｖｏ水平（指一部分体外一部分体内）,表达ＨＳＶ－ｔｋ基因的肿瘤细胞均可被ＧＣＶ有效杀伤,逆转录病毒介导的ＨＳＶ—ｔｋ／ＧＣＶ自杀基因治疗系统有可能成为肝癌的有效治疗方法。     

乙型肝炎病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增ＨＢＶＸ基因 ,克隆至真核表达载体ｐＶＲ10 12中 ,构建ＨＢＶＸ基因重组表达载体ｐＶＲ10 12 Ｘ。以该质粒转染ＨｅｐＧ2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ＥＬＩＳＡ)检测细胞Ｘ蛋白的瞬时表达 ,与报告质粒ｐＳＶ ｌａｃＺ共转染ＨｅｐＧ2细胞 ,用试剂盒法检测β 半乳糖苷酶表达活性。结果质粒 ｐＶＲ10 12 Ｘ在ＨｅｐＧ2细胞瞬时表达Ｘ蛋白 ,共转染实验中ｐＶＲ10 12 Ｘ组β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 3.2倍 ,表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 ,并能够反式激活ＳＶ4 0早期启动子。乙型肝炎病毒X基因在…     

细菌内构建复制缺陷型人肝细胞生长因子重组腺病毒及其对胎肝细胞细胞周期的影响

利用ＡｄＥａｓｙ系统的细菌内同源重组机制构建以ＣＭＶ驱动并同时表达绿色荧光蛋白 (ＧＦＰ)的人肝细胞生长因子 (ＨＧＦ)复制缺陷型重组腺病毒 (ＡｄＨＧＦ) ,体外感染胎肝细胞 ,初步研究其对肝细胞细胞周期的影响 ,为基因治疗技术和肝细胞移植联合应用于肝纤维化治疗研究提供新的途径。将质粒 ｐＵＣＨＧＦ扩增、酶切获得ＨＧＦｃＤＮＡ片段后插入腺病毒穿梭载体质粒 ｐＡｄＴｒａｃｋ ＣＭＶ的ＣＭＶ启动子的下游 ,构建重组穿梭载体ｐＡｄＴｒａｃｋ ＣＭＶ ＨＧＦ ,ＰｍｅⅠ酶切线性化后与骨架载体ＡｄＥａｓｙ 1在细菌ＢＪ5 183内同…     

HBsAg在不同真核表达载体中的表达

目的建立ＨＢｓＡｇ及其变异体的高效真核表达系统。方法从已构建的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋－ＨＢｓ系列突变重组体获取ＨＢＶ－Ｓ基因片段,将其亚克隆到真核表达载体ｐＭＥＰ４,ｐＣＥＰ４,ｐＬＸＳＮ,ＰＸＴ１及ｐｃＤＮＡ３,从而构建了含ＨＢＶ－Ｓ基因及其突变型的一系列表达载体,并将其转染（或感染）人肝癌细胞系ＨｅｐＧｅ２。结果获得稳定分泌ＨＢｓＡｇＲ其突变体的抗性细胞系。结论各组真核表达载体皆能表达ＨＢｓＡｇ及其突变体,但在转染率、表达量及稳定性上存在差异。选择其中的高效、准确表达系统,将为ＨＢｓＡｇ变异株生物学性状的深入研究及进一步基因治疗、基因免疫的研究提供有用的工具。     

在大肠杆菌中高效表达人I型免疫缺陷病毒p24蛋白

目的 表达人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白ｐ２４，为制备抗ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原奠定基础。方法 将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４＾ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建重组表达质粒，转化大肠肝菌ＢＬ２（ＤＥ３），ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及点免疫印迹分析，结果 构建成功重组表达质粒ｐＥＴ２４经Ｉ     

恶性疟原虫疫苗研究X.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因？…

目的 克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原，为疟疾疫苗研究奠定基础。方法 将恶性疟原虫ＭＳＰ１中类表皮生长因子１（ＥＧＦ－１）基因与人工化学合成的抗原复合基因ＰｆＣＭＲ串接，插入高效非融合型蛋白表达载体ｐＢＶ２２０，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，转化菌经４２℃热诱导表达，表达产物用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ分析。结果 构建成功重组质粒ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＥＧＦ－１，经热诱导后表达出含外     

人类HLA—B7可诱导启动子调控IRES连接的人TNFα和IFN？…

目的：为增强肿瘤细胞表面ＭＨＣＩ类分子表达，并调动免疫系统更有效地抑制和杀伤肿瘤细胞，构建在ＨＬＡ－Ｂ７启动子调控下，ＩＲＥＳ连接的人ＴＮＦα和ＩＦＮβ基因的重组逆转录病毒载体，方法与结果：将ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓｋ（＋）中，改换酶切位点后定向克隆入含ＨＬＡ－Ｂ７启动子的质粒中，构建成ｐＧＬ３Ｂ７ＴＮＦ。ＩＦＮβｃＤＮＡ经定向插入ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）改换酶切点切下，定向克     

培养人胎肝细胞的形态与功能研究

目的探讨人胎肝细胞分离与培养的简易方法．方法采用体外两步灌流法分离人胎肝细胞，选择条件培养液加以培养，并进行形态学和蛋白分泌功能的动态观察．结果用该法分离的肝细胞经台盼蓝拒染试验证实存活率在９５％以上，培养时间可达２周，并保持正常形态和良好的蛋白合成分泌功能．结论用酶灌流分离和条件培养的胎肝细胞性能良好，可用作肝细胞移植的供体．     

微载体培养人肝细胞及肝非实质细胞

目的研究用微载体培养人肝细胞及肝非实质细胞的方法．方法采用体外简易两步灌流和差速离心法获取胎肝细胞和肝非实质细胞，在综合限定条件下进行微载体ｃｙｔｏｄｅｘ３粘附培养，并对培养肝细胞的形态及合成葡萄糖和白蛋白的功能进行动态测定．结果分离肝细胞及肝非实质细胞在接种时即呈明显的聚集倾向，将其与微载体混合振荡孵育２０ｍｉｎ后，二者极易相粘附．在被覆聚羟乙基异丁烯酸的培养瓶内，使用激素限定条件培养液培养约４８ｈ，典型的多细胞聚集球形体得以形成．该形态特征以及白蛋白、葡萄糖合成能力可保持１月结论使用微载体培养人肝细胞和肝非实质细胞具有多种优点，有广泛的应用价值．     

结直肠癌组织中人乳头瘤病毒DNA的研究

目的研究１６、１８型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）是否与结直肠癌的发生有关．方法结直肠粘膜活检组织１２３例，其中结直肠癌３５例，乳头状腺瘤１７例，炎性息肉１１例，结肠炎３０例，以及正常结肠粘膜３０例，用对各型ＨＰＶ高度保守的通用引物和１６、１８型特异性引物作聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ＨＰＶＤＮＡ．结果ＨＰＶＤＮＡ总检出率１４６％，正常粘膜，结肠炎和炎性息肉组为３３％（２／７１），乳头状腺瘤为１７６％（３／１７），结直肠腺癌为３７１％（１３／３５）．在正常粘膜，结肠炎和炎性息肉组未发现１６、１８型ＨＰＶＤＮＡ，在乳头状腺瘤组有３例为１８型ＨＰＶＤＮＡ阳性，结直肠腺癌组１３例ＨＰＶ阳性病例中有３例为１６型，９例为１８型感染；在正常组织、癌旁组织和癌组织中ＨＰＶＤＮＡ检出率依次增高．ＨＰＶ在直肠、左半结肠，右半结肠感染率依次为２８６％，１４％，２６％．结论结肠癌的发生与ＨＰＶ１６、１８型有关，腺癌以１８型感染为主．ＨＰＶＤＮＡ检出率在右半结肠，左半结肠和直肠依次增高．     

人肝细胞癌中转移抑制基因nm23编码蛋白的表达

目的探讨肝脏冷保存与移植肝原发性无功能的关系。方法采用具有免疫耐受性的同种大鼠原位肝移植模型进行研究。将鼠肝分别在４℃ＵＷ液中保存１，６和２４ｈ，分别在移植后１ｈ和２４ｈ取肝脏做病理观察。结果保存在ＵＷ液中的肝脏基本保存了正常的组织结构，而在移植后则不同程度地出现了变性或坏死，并且肝细胞的坏死是以小叶中央静脉为中心。保存时间越长，病变越严重。结论肝脏冷保存时间与移植肝原发性无功能的发生密切相关。     

良性前列腺增生组织中雄激素结合位点和表皮生长因子受体的相关性研究

目的评估雄激素结合位点（ＡＢＳ）和表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）在良性前列腺增生症（ＢＰＨ）中的作用及相互调节关系。方法应用免疫组织化学方法（ＳＰ法）在５０例ＢＰＨ组织和９例正常前列腺组织中对ＡＢＳ和ＥＧＦＲ进行免疫定位、半定量表达。结果前列腺增生组织中ＡＢＳ和ＥＧＦＲ表达均增强，ＡＢＳ主要位于腺上皮细胞和基质细胞，ＥＧＦＲ主要位于基底细胞，ＡＢＳ和ＥＧＦＲ呈显著正相关。结论雄激素的作用部位主要在上皮细胞和基质细胞，表皮生长因子的作用部位在基底细胞，二者的密切相关在ＢＰＨ的发病机理中可能是非常重要的。     

老年人螺旋神经节形态变化及定量的研究

目的观察不同年龄组人的螺旋神经节细胞形态变化，进行定量研究。方法用火棉胶及脱火棉胶人的颞骨切片观察螺旋神经节及其脂褐素，进行图像分析测定。结果随年龄增长螺旋神经节细胞逐渐减少，由０～９岁组的３９２９３个减少至８０～８８岁组的１６７８１个，自２０岁组开始至８０～８８岁组与０～９岁组比较差异有显著性（Ｐ＜０．０５或０．０１）。老年组不仅螺旋神经节细胞明显减少、细胞大小不等、核浓缩或淡染、核偏移，而且耳蜗神经纤维也减少，但胶质细胞增生。随着增龄脂褐素沉积逐渐增多。结论老年人螺旋神经节细胞减少，细胞质内脂褐素沉积，可能是导致老年性耳聋的主要原因之一。     

胃泌素及生长抑素对人大肠癌细胞的调节

目的观察五肽胃泌素（ＰＧ）、胃泌素受体拮抗剂丙谷胺（ＰＧｌ）和生长抑素（ＳＳ）长效类似物ＳＭＳ２０１＿９９５对体外培养人大肠癌细胞系ＳＷ１１１６生长的影响。方法设空白组、对照组、ＰＧ组、ＰＧｌ组、ＳＳ组、ＰＧｌ＋ＰＧ组和ＳＳ＋ＰＧ组。各组主要药物浓度分５×１０－５＿５×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ６个浓度，联合用药组ＰＧ浓度均为５×１０－５ｍｏｌ／Ｌ。采用ＭＴＴ比色分析法检测细胞增殖情况。结果ＰＧ能提高细胞增殖率；ＰＧｌ则抑制细胞增殖；ＰＧ对ＰＧｌ的抑制率总体影响不大，而使其与ＰＧｌ浓度对数值呈显著负相关（ｒ＝－０．８３，Ｐ＜０．０５）。ＳＳ在低浓度时促进细胞增殖，而高浓度时则有抑制作用，细胞增殖率与药物浓度对数值呈显著负相关（ｒ＝－０．９１，Ｐ＜０．０５）；ＰＧ可逆转ＳＳ的促增殖作用，并使其抑制率有所提高，且细胞增殖率仍与ＳＳ浓度对数值呈显著负相关（ｒ＝－０．８４，Ｐ＜０．０５）。结论激素可控制大肠癌的生长，但尚有许多问题待阐明     

VEGF基因治疗靶向载体的构建及其特异性表达分析

目的 :构建KDR启动子介导的VEGF逆转录病毒载体pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5,并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析。方法 :将逆转录病毒载体 3’LTR的U3区缺失 2 99个碱基使其自身启动子失活 ,然后重组pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5载体。经PA317细胞包装 ,NIH3T3细胞测定其病毒滴度。用高病毒滴度细胞株产生的病毒上清分别感染ECV30 4人脐静脉血管内皮细胞和NIH3T3细胞 ,收集细胞培养上清经ELISA和westernBlot分析。结果 :VEGF1 6 5在内皮细胞ECV30 4中的表达量明显高于NIH3T3细胞。结论 :构建的pLXSN D2 99 KDRp VEGF载体 ,可在内皮组织细胞中特异性地表达VEGF。     

肿瘤坏死因子受体在肾小球系膜细胞中的基因表达及蛋白合成

目的：探讨肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）对肾小球系膜细胞（ＭＣ）作用的机理。方法：逆转录多聚酶链反应（ＲＴＰＣＲ）、原位杂交和免疫组织化学方法检测培养大鼠和人ＭＣ肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（ＴＮＦＲ１）的基因表达及蛋白合成；原位杂交方法观察５例系膜增生性肾小球肾炎肾穿刺组织的ＴＮＦＲ１基因表达。结果：培养的大鼠和人ＭＣ有ＴＮＦＲ１ｍＲＮＡ的表达并有ＴＮＦＲ１蛋白的合成，系膜增生性肾小球肾炎增生的ＭＣ内有ＴＮＦＲ１表达。结论：ＴＮＦα通过与ＭＣ表面特异性受体相结合而发挥作用。     

广西并殖吸虫病自然疫源地调查

目的　查清广西主要林区并殖吸虫病自然疫源地分布及虫种。方法　解剖蟹类分离囊蚴并感染动物获取成虫鉴定虫种、玻片压碎法镜检螺类自然感染尾蚴、粪检或解剖动物查找虫卵和成虫了解动物宿主感染、以成虫抗原作ＩＤ及ＥＬＩＳＡ,结合痰液和粪便检查确定人体感染。结果　在３７ 县（市）检查蟹类４ 科８ 属２０ 余种共２０２０８４ 只,有１５县（市）从圆顶华溪蟹等８ 种共１２７５ 只蟹中查获并殖吸虫囊蚴,自然感染率在０．１～２２．２％ 之间;检查淡水螺类４４８４７ 只,携带并殖吸虫尾蚴１５７ 只,自然感染率在０．３％ ～０．４％ 之间;检查６ 种动物粪便、内脏４０８份和１６ 份,发现果子狸等３ 种动物的１７ 份粪便中有并殖吸虫卵。那坡、资源、兴安和融水４县有人体感染病例２５ 人。根据囊蚴及成虫的形态特征初步鉴定有斯氏、异盘、巨睾和白水河（或歧囊）４ 种并殖吸虫。结论　桂西、北山区广泛存在并殖吸虫病自然疫源地,斯氏并殖吸虫是当地的优势虫种,分布于融水、龙胜等１３ 个县