广东省乙型肝炎病毒S基因变异与乙型肝炎疫苗免疫失败关系探讨

目的研究广东省儿童乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)携带者中HBV S基因变异对乙肝疫苗免疫效果的影响。方法收集乙肝疫苗免疫后HBsAg阳性的儿童血清标本36份,利用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV S基因片段,对PCR产物进行脱氧核糖核酸(DNA)序列测定。结果在36份标本中,HBV核酸阳性26份,完成测序23份,11份标本S基因片段出现氨基酸变异,其中4份在“α”决定簇片段内出现了氨基酸变异,2种变异形式未见报道,结论广东省免疫失败儿童存在不同位点的HBV S基因变异,可能是导致部分儿童免疫失败的原因。尚未出现稳定的变异株,对现用乙肝疫苗的免疫效果影响不大。     

乙型肝炎病毒隐匿性感染的分子机制研究

目的从基因变异角度研究HBV隐匿性感染的分子机制。方法不明原因的肝炎患者104例,收集临床资料及血清,套式PCR扩增HBVS、X、C基因,检测隐匿性HBV感染者。HBVS、X区扩增产物测序和变异位点分析,发现可能的和HBV隐匿性感染有关的变异位点,分析HBV基因变异在HBV隐匿性感染中的作用。结果检测出隐匿性HBV感染13例。S基因区未发现有义突变,X基因区及重叠核心启动子区、增强子Ⅱ区发现多位点变异,推测与HBV隐匿性感染有关。结论X基因区及重叠核心启动子区、增强子Ⅱ区多位点变异可能是HBV隐匿性感染的分子基础。     

学龄前儿童乙型肝炎病毒株氨基酸变异研究

了解学龄前儿童(2~6岁)隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)后HBV S基因氨基酸的变异情况,为防控OBI的发生发展提供参考.方法 采用整群抽样方法选择乌鲁木齐4所幼儿园,对在园的学龄前儿童采用ELISA进行HBsAg,anti-HBs,HBeAg,anti-HBe和anti-HBc 5项检测,对259例HBsAg阴性的血清用Promega公司生产的试剂盒进行HBV-DNA产物提取,运用PCR方法扩增HBV-DNA S基因片段,对扩增阳性的序列进行测定;采用分子遗传学软件MEGA5.0对测得的序列进行具体氨基酸分析.结果 259份学龄前儿童血样共发现21份HBV DNA阳性标本,均测序成功.其中1例由于存在氨基酸的插入,没有检出具体的基因型.其余20例样本均表现为C基因型,血清型均为adrq+亚型.S基因序列翻译成氨基酸后分别发生I110L,S123T,T124S,T126I,T131N,F134Y和P142H突变.结论 HBsAg阴性学生血液中存在一定数量的HBV隐匿性感染,S基因存在氨基酸突变,需重视隐匿性的HBV感染以及其发生和发展.     

太原地区孕妇HBV感染者a决定簇的变异

目的 了解太原地区孕妇乙型肝炎病毒（HBV）感染者HBVS基因a决定簇变异情况。方法 2001年11月～2004年7月，采集太原市传染病医院妇产科住院的HBsAg阳性孕妇外周血，采用ELISA法检测血清HBsAg、HBeAg，巢式PCR法检测血清HBVDNA，对41例孕妇标本进行了PCR产物直接测序，与Genebank中HBV中国大陆流行株进行多重序列比对，分析HBVS基因a决定簇变异情况。结果 14．63％（6／41）孕妇携带HBVS基因a决定簇变异株。检出的突变位点中，aa126，aa127，aa131，aa143为较常见的氨基酸变异位点，aa125，aa135，aa137及aa140变异报道较少，大多数位点的变异导致了氨基酸替换。结论 太原地区孕妇HBV感染者携带a决定簇突变株。     

肝癌高危儿童中乙肝病毒逃脱变异分子机制研究

目的；分析受乙肝疫苗保护后部分儿童的“免疫无效”现象。方法：采用巢式PCR－SSCP银染技术对60例曾受疫苗保护的儿童血清中HBV DNA S基因片段进行研究。结果：在HBsAg阴性血清中存在HBV S基因点突变，该突变位于从HBV基因组EcoR I位点算起的第367－369核苷酸区域内，结论：肝癌高危儿童中发现存在HBV逃脱变异，疫苗刺激机体所产生的抗体不能中和入侵的HBVa决定族，也不能阻断HBV感染致使产生“免疫无效现象”。     

乙肝疫苗阻断HBV母婴传播免疫失败与母子HBV基因分型及S基因变异的相关性

目的对照研究乙肝疫苗免疫阻断失败的儿童和母亲血清HBV DNA水平、基因型及病毒S基因变异情况,探讨导致乙肝疫苗阻断母婴传播免疫失败的病毒学因素。方法通过实时定量PCR(RQ-PCR)法检测母子血清HBV-DNA含量;PCR法扩增出母子HBV DNA S基因片断,纯化后进行基因测序。结果7对母子共15份血清HBV DNA均为高水平(>1.0×108copy/ml)。其中2对属于基因B型,5对属于C型。母子间基因序列同源性为99%~100%,HBV-S基因核苷酸测序结果与选定的标准株进行比较,存在多个位点的变异,特别是“a”决定簇的变异。核苷酸变异影响病毒氨基酸的表达。结论乙型肝炎疫苗阻断HBV母婴传播失败的原因可能与HBV变异株的感染有关,特别是“a”决定簇的变异,变异株来源于母亲。     

无偿献血者隐匿性乙肝感染病毒变异检测分析

目的通过对隐匿性乙肝感染者S区基因变异位点的分析及相关蛋白空间结构的预测,探讨无偿献血者隐匿性乙肝感染的分子生物学机制。方法对80例HBs Ag-/HBV DNA+无偿献血者进行血清学补充试验,并对追踪确认的隐匿性乙肝感染者,应用巢氏PCR技术对S区基因进行扩增和序列测定,并将测得基因片段与NCBI Gen Bank数据库做序列比对分析,明确突变位点,同时进行蛋白模型构建,进行空间结构的分析。结果 HBs Ag-/HBV DNA+无偿献血者血清学检测模式多样,以抗-HBc阳性为主,追踪试验确认4例隐匿性乙肝感染者,有3例巢氏PCR扩增出S区基因序列,2例发生突变,蛋白预测提示氨基酸改变可能影响抗原决定簇空间构象,造成抗体结合位点改变或识别能力减弱。结论隐匿性乙肝感染者S区容易发生变异,尤其是a抗原决定簇氨基酸的改变导致蛋白质空间构象的变化,可能是造成隐匿性乙肝发生的原因之一。     

广州地区HBV DNA~+/HBsAg~-献血者分子生物学特征

目的分析广州地区HBV DNA+/HBs Ag-献血者HBV基因型和S区"a"决定簇及主要亲水区(MHR)分子生物学特征,为进一步阐明OBI的分子机制提供参考。方法采用两种ELISA试剂和单人份核酸检测(NAT)平行检测的方法对广州市2013年10月至2014年5月无偿献血者血液标本进行筛查,采用巢式PCR对筛查出的HBV DNA+/HBs Ag-标本S区进行扩增,扩增成功作为实验组。随机选取13例HBV DNA+/HBs Ag+献血者标本作为对照组。对两组标本进行基因分型,分析"a"决定簇和主要亲水区(MHR)的置换位点和置换率。结果对筛查到的60例HBV DNA+/HBs Ag-标本S区进行巢式PCR扩增,有19例扩增成功,两组在基因型分布方面没有统计学差异。实验组MHR区氨基酸序列置换率高于对照组(P<0.05),两组在"a"决定簇氨基酸置换率没有统计学差异。19例实验组中变异比较多的位点为T126和Q129,分别为6和7次。实验组21号标本MHR出现6次变异,是置换率最高的一例。各组均未发现有基因缺失情况。结论 HBV DNA+/HBs Ag-献血者S基因MHR存在较大变异,MHR变异对OBI的影响可能大于"a"决定簇,T126和Q129变异可能成为现有引起OBI新的高突变率点。     

四川省两县(区)乙型肝炎病毒S基因和P基因变异分析

目的 分析四川省两县(区)乙型肝炎(乙肝)病毒(Hepatitis B Virus,HBV)S基因和P基因变异.方法 从乙肝病毒表面抗原、乙肝病毒e抗原均阳性的血清中提取病毒脱氧核糖核酸,经聚合酶链反应和核苷酸测序后,比较和分析S基因和P基因核苷酸和氨基酸变异.结果 47例慢性HBV感染者血清标本中,12份标本在"a"决定簇内出现氨基酸变异(25.53%),分别为T126A、I126T/S、P127T、T131N、M133L、M133T、T140I;变异主要集中在"a"决定簇的第1环上(92.86%,13/14).1份标本逆转录酶C域中出现rtV2071变异.结论 自然发生的氨基酸变异主要集中在"a"决定簇的第1环上,其抗原性已改变,对乙肝疫苗接种人群构成了潜在的威胁.拉米夫定耐药株也可在未接受核苷(酸)类药物治疗的病人中发现.     

隆安县乙肝疫苗免疫逃避株的研究

目的 查明隆安县部分乙肝疫苗免疫失败的原因。方法 用套式PCR(nPCR)扩增41例隆安县接受乙肝疫苗免疫的儿童及其母亲血清HBV S基因,阳性者用直接测序法测序。结果 23例HBV DNA阳性,阳性率为56％(23／41);表面抗原的4个主要亚型(adr、adw、ayr、ayw)都出现在本研究中,其中以adw为主,占65．2％(15／23),标本3及27儿童感染的亚型(adw)不同于他们母亲感染的亚型(adr及ayw);标本46兄弟俩及标本37均在aa145发生突变(甘氨酸一精氨酸),标本64也在aa145发生突变(甘氨酸→丙氨酸)。另外,标本38在aa120发生突变(脯氨酸→丝氨酸),标本27在aa129发生突变(谷氨酰胺→精氨酸)。结论 隆安县存在乙肝疫苗免疫逃避株。提示免疫逃避株的产生是隆安县部分乙肝疫苗免疫失败的原因之一,这些免疫逃避株是目前阻断乙肝病毒母婴传播的难点。     

单纯乙型肝炎疫苗免疫后表面抗原携带者“a”决定簇基因变异的分子流行病学特征

目的　了解单纯乙型肝炎疫苗免疫失败后表面抗原 ( HBs Ag)携带者和未免疫携带者 HBs Ag基因变异的流行特点及乙型肝炎病毒 ( HBV)基因型和血清亚型的分布特点。　方法　应用直接测序和基因序列特异固相聚合酶链反应( SS- SPPCR)方法 ,分别检测 69例单纯乙型肝炎疫苗免疫后携带者和 83例未免疫携带者 ,乙型肝炎病毒 HBs Ag“a”决定簇氨基酸的变异及 HBV基因型和血清亚型的分布。　结果　 HBV基因型 B、C和 D均存在 ,其中 B和 C为优势基因型 ;血清亚型 adr、adw2、avr、ayw1、ayw2和 ayw3均存在 ,其中 adr和 adw2为优势血清亚型。直接测序检测的乙型肝炎疫苗免疫后携带者 HBs Ag“a”决定簇氨基酸变异率明显高于未免疫携带者对照 ,变异率分别为 3 1.9% ( 2 2 / 69)和 8.4 % ( 7/ 83 )。14 5、12 6和 13 3位是最常见的氨基酸变异点。应用更为敏感的 SS- SPPCR法分别检测 14 5和 12 6位氨基酸点突变的变异率 ,各组间差别不明显。经直接测序法检测 ,免疫后携带者基因变异危险度 ( OR)是未免疫携带者的 5 .1倍。按基因型和血清亚型分层分析 ,基因型 B和 adw2血清亚型携带者受免疫后出现基因变异的危险度明显高于未免疫携带者 ,分别为3 1.7和 2 8.9。　结论　接种乙型肝炎疫苗者可引起表面抗原基因的免疫逃避     

乙型肝炎免疫球蛋白阻断乙肝病毒母婴传播过程中病毒S区基因变异的研究

目的了解乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）在阻断母婴传播过程中S基因变异的特点,比较与未予阻断者的差异,探讨基因变异与宫内传播的关系,协助评价HBIG的治疗安全性.方法将18对乙型肝炎病毒（HBV）携带母亲及其宫内感染新生儿按母亲产前处理分为HBIG组8对,母亲于产前3月起肌肉注射HBIG 200～400IU至分娩前;对照组10对,母亲产前不接受HBIG者.巢式PCR扩增HBV S基因片段并直接测序.以每对病例第一份（母亲孕中期）血清HBV株S基因区氨基酸（或核苷酸）作为标准,对每对病例第二份血清（母亲分娩前）和第三份血清（新生儿）HBV株进行分析.结果HBV S区碱基替代突变率和氨基酸变异数在HBIG组和对照组之间的差异均无统计学意义;18例宫内感染儿17例其病毒株与母亲分娩前的优势株一致,其中4例为S区变异株;18例宫内感染儿病毒株分型B型adw2 12例,C型adrq^＋6例.结论无症状携带HBV孕妇产前使用现有剂量HBIG至临产并未增加HBV S区的变异.HBV S区变异株和未变异株均可经宫内传播,宫内感染发生于孕后期;HBV S区变异并非发生宫内感染的主要原因.     

广州市青少年学生乙型肝炎病毒感染状况及危险因素调查

目的了解推广使用乙型肝炎疫苗后,广州市青少年学生乙型肝炎病毒感染状况和感染危险因素。方法选取广州市29所中学的初一和高一学生共14744人作为调查对象,检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和抗体（抗-FiBs）,HBsAg与抗-HBs同时阳性者作乙型肝炎病毒S基因扩增和DNA序列分析。以统一的问卷对HBsAg阳性者进行流行病学调查。结果检出HBsAg阳性者424人,阳性率为2．9％。抗-HBs阳性者12201人,阳性率为82.8％。4人HBsAg、抗-HBs同时阳性,其中1人S基因“a”决定族第126位的异亮氨酸（ATT）变为苏氨酸（ACT）,第143位由丝氨酸（TCG）变为苏氨酸（ACG）,第145位由甘氨酸（GGA）变为精氨酸（AGA）,另外3人未检出S基因“a”决定簇氨基酸变异。流行病学调查提示部分学生问卷可能通过母婴传播以及日常生活密切接触感乙型肝炎病毒。结论乙型肝炎疫苗是预防乙型肝炎的有效制荆。病毒S基因“a”决定簇变异可使乙型肝炎疫苗保护失败,但目前的发生率较低,无须改变疫苗的制备及免疫策略。     

HBsAg与anti-HBs共阳性慢性乙肝患者病毒S蛋白序列分析

目的分析慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者乙型肝炎病毒S蛋白序列突变与HBs Ag、anti-HBs共阳性的相关性。方法随机选择33例HBs Ag、anti-HBs共阳性的CHB患者作为试验组,随机选择33例HBs Ag阳性而anti-HBs阴性的CHB患者作为对照组,对乙型肝炎病毒S区基因进行扩增测序并进行序列分析。结果两组感染的乙型肝炎病毒均为B或C基因型,未见其它基因型;两组在年龄、性别、HBV基因型、血清HBV DNA水平上差异无统计学意义(均P>0. 05);试验组S蛋白在N-端(2. 61%vs. 1. 21%)、主要亲水结构区域(1. 69%vs. 0. 48%)(major hydrophilic region,MHR)、特别是"α"决定簇(3. 23%vs. 0. 63%)的氨基酸突变率均显著高于对照组(均P<0. 01),但在C-端(1. 75%vs. 1. 22%)氨基酸突变率差异无统计学意义(P>0. 05);试验组突变率最高的点是S蛋白的第126位氨基酸;两组氨基酸插入和缺失突变差异无统计学意义(P>0. 05)。结论 CHB患者中S蛋白序列氨基酸的突变特别是"α"决定簇的突变可能与HBs Ag、anti-HBs共阳性相关。     

乙肝疫苗免疫人群乙肝病毒感染和发病状况研究

目的了解上海市儿童乙肝疫苗免疫后乙肝病毒感染和发病情况。方法采用多阶段随机抽样方法,于2000年和2006年共计抽取1 904份接种人群血液标本,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBsAg、抗-HBs和抗-HBc。结果新生儿乙肝疫苗接种率和及时率均保持较高水平。20岁以下人群乙肝发病率明显下降;HBsAg携带率降幅为78.34%。儿童乙肝患者中84.35%（124/147）未接种过乙肝疫苗;23例接种乙肝疫苗但患病的儿童中,12例患儿的母亲或父亲HB-sAg阳性。结论儿童接种乙肝疫苗是预防和降低乙肝感染的有效措施。需加强母（父）婴阻断和家庭内传播机制的研究。     

山东省≤15岁人群感染乙型肝炎病毒“a”抗原决定簇变异株的流行病学特征分析

目的了解山东省≤15岁人群感染的乙型肝炎（乙肝）病毒（Hepatitis B Virus,HBV）中,＂a＂抗原决定簇变异株流行强度及分布特征,探讨其流行与乙肝疫苗（Hepatitis B Vaccine,HepB）免疫的关系。方法对2009年国家法定传染病报告系统报告的山东省≤15岁乙肝病例进行个案调查和血标本采集,采用巢式聚合酶链反应方法扩增其血清HBV S基因,测序后与基因数据库中的标准序列进行比对分析。结果山东省2009年共报告≤15岁乙肝326例,对302例（92.64%）进行了个案调查和血标本采集,对其中158份标本进行HBV-脱氧核糖核酸提取,扩增HBV S基因并成功测序137份。14份标本检出＂a＂抗原决定簇变异株,检出率为10.22%;有HepB免疫史和无HepB免疫史者检出率分别为10.66%和6.67%,差异无统计学意义（χ2=0.23,P=0.63）;未发现不同性别、地区、接种HepB种类和母亲乙肝病毒表面抗原携带状态者间检出率的差异有统计学意义（P〉0.05）。14份标本共检出＂a＂抗原决定簇6个氨基酸位点发生9种变异,其中126位点和144位点检出率较高,分别为4.38%（6/137）和2.92%（4/137）,但差异无统计学意义（χ2=7.39,P=0.19）。结论目前山东省≤15岁乙肝病例中,HBV＂a＂抗原决定簇变异株流行率较低,存在多种变异形式,尚未出现强变异株;尚未发现其流行与HepB免疫有关。     

132例乙型肝炎病毒感染者基本核心启动子变异分析

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）感染者基本核心启动子（BCP）变异情况。方法收集HBV感染者血清标本132份(HBV DNA均阳性),用半巢式聚合酶链反应扩增HBV C基因部分片段,产物纯化后直接测序,检测BCP T1762/A1764变异。用S基因错配聚合酶链反应（PCR RFLP）法确定HBV基因型。结果51例乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性患者BCP T1762/A1764双变异检出率为27.45%,81例HBeAg阴性患者BCP T1762/A1764双变异检出率为62.96%,两组比较,差异有高度显著性（χ2=15.79,P＝0.00）。 BCP T1762/A1764双变异的HBV感染者B基因型检出率为33.85%,明显低于C基因型的检出率66.15%（χ2=24.25,P＝0.00）。结论HBV感染者普遍存在BCP T1762/A1764双变异,以C基因型感染者多见。     

Therapeutic efficacy of hepatitis B surface antigen-antibodies-recombinant DNA composite in HBsAg transgenic mice.

Therapeutic efficacy of HBsAg-anti-HBs-recombinant DNA harboring hepatitis B virus (HBV) S gene complex was compared with three other therapeutic vaccine candidates (recombinant HBsAg, HBsAg complexed to anti-HBs antibodies and naked plasmid DNA encoding the HBV S gene). After four injections at 3-week intervals, the most pronounced decrease of serum HBsAg, the highest titer of anti-HBs response, the highest level of interferon-gamma produced by splenocytes and potent cytotoxicity T cell response were observed in the HBsAg-anti HBs-sDNA immunized group. Reduced expression of HBsAg in hepatocytes was also shown. The therapeutic mechanism of HBsAg-anti-HBs-DNA was speculated as modulation of HBsAg presentation via both endogenous and exogenous pathways.     

The effect of introduction of universal childhood hepatitis B immunization in South Africa on the prevalence of serologically negative hepatitis B virus infection and the selection of immune escape variants.

The effect of universal hepatitis B vaccination on the prevalence of serologically negative hepatitis B virus infection (HBV) and the emergence of HBsAg variants is unknown. We prospectively studied two different cohorts of 12--24 month old children in South Africa. They consisted of the unvaccinated children (n=459) born before the introduction of universal vaccination and the vaccinated children (n=1213) between 1 and 2 years after the introduction of the vaccination program. The frequency of detecting HBV DNA by PCR was reduced from 6.5% in unvaccinated children to 0.3% in vaccinated children (P<0.00001). There were no unique amino acid substitutions within the major hydrophilic region of the S sequence in both pre- and post-vaccination samples. Universal childhood vaccination reduced the frequency of serologically negative HBV infection and did not necessarily lead to selection of escape variants.