斯钙素1的表达对肺癌细胞A549细胞周期及凋亡的影响

背景与目的：斯钙素1(stanniocalcin l,STC1)在多种癌组织中表达上调,且与癌组织的恶性程度相关,但STC1在肺癌细胞中的分子作用机制尚不明确。本研究旨在探讨STC1的表达对肺癌细胞A549细胞周期及凋亡的影响。方法：构建STC1基因RNA干扰的肺癌细胞株A549-STC1-siRNA和对照细胞株A549-Vector,用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)检测A549-Vector及A549-STC1-siRNA细胞株的细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4,凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xl及凋亡诱导基因Caspase-3、Bax、Bak、Bid的表达水平,用流式细胞术检测STC1基因对A549细胞周期的影响,用原位末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling,TUNEL)检测STC1基因对A549细胞凋亡的影响。结果：与A549-Vector细胞相比,A549-STC1-siRNA的细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4在转录和蛋白表达水平上均显著减少(P<0.05),G0/G1期细胞比例明显增加,S期及G2/M期细胞比例降低(P<0.05),细胞周期受阻;A549-STC1-siRNA的凋亡抑制基因Bcl-2和Bcl-xl表达下调(P<0.05),而凋亡诱导基因Caspase-3、Bax、Bak及Bid显著上调(P<0.05);TUNEL实验表明,A549-STC1-siRNA细胞的凋亡率明显增加。结论：STC1基因的低表达可阻滞肺癌细胞A549的细胞周期,抑制细胞增殖,同时促进细胞凋亡。     

miR-29a对人胃癌细胞增殖、迁移的影响及其机制研究

目的：探讨微小RNA-29a（miR-29a）对人胃癌细胞增殖、迁移的影响及其机制。方法：胃癌SGC-7901细胞随机分为miR-29a转染组、质粒对照组、空白对照组、信号转导子与转录激活子3（STAT3）抑制组。miR-29a转染组、质粒对照组采用脂质体转染法分别将has-miR-29a mimics质粒、siRNA对照质粒转染至人胃癌SGC-7901细胞，STAT3抑制组细胞加入STAT3抑制剂溶液，空白对照组不做处理。实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和Western blot法检测转染后细胞中miR-29a、血管内皮生长因子（VEGF）、STAT3、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）mRNA和蛋白的表达情况；MTT、划痕实验分别检测细胞增殖和迁移情况。结果：qPCR和Western blot实验结果显示，与空白对照组和质粒对照组比较，miR-29a转染组的miR-29a相对表达水平升高，VEGF、cyclin D1 mRNA及蛋白相对表达水平与p-STAT3/STAT3比值均下降（P < 0.01）。MTT实验与划痕实验结果显示，与空白对照组和质粒对照组比较，miR-29a转染组细胞在培养24、48、72 h的细胞相对增殖率及迁移率降低（P < 0.01）。与空白对照组比较，STAT3抑制组细胞的cyclin D1 mRNA及蛋白相对表达水平、p-STAT3/STAT3比值均降低，细胞相对增殖率与迁移率降低（P < 0.01）。结论：miR-29a能降低VEGF mRNA、蛋白的表达，抑制人胃癌细胞增殖和迁移，其机制可能与下调p-STAT3及cyclin D1的表达有关。     

circRNA MYO1C对肺癌细胞自噬和肿瘤干细胞分化的影响

目的 探讨环状RNA(circRNA)MYO1C对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞自噬和肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)分化的影响。方法 通过RT-qPCR检测正常肺上皮细胞和NSCLC A549细胞中circRNA MYO1C水平。将A549分为对照组、NC组和siMYO1C组,通过转染si-circRNA MYO1C质粒干扰circRNA MYO1C。用CCK-8法和Transwell实验检测细胞生长活力和迁移能力。通过Western blot检测CSCs分化标志蛋白(OCT4、SOX2和NANOG)以及自噬标志蛋白(P62和IC3II/LC3I)的表达水平。结果 相对正常肺上皮细胞,circRNA MYO1C在A549细胞中表达明显上调(0.99±0.06 vs. 4.87±0.88,P=0.002)。与NC组比较,siMYO1C组细胞中circRNA MYO1C水平、细胞活力、迁移、OCT4、SOX2、NANOG和IC3II/LC3I蛋白水平显著降低,而P62蛋白水平显著升高(P＜0.001)。结论 下调circRNA MYO1C能够抑制NSLCLC细胞的CSCs分化和自噬相关蛋白表达,并抑制肺癌细胞迁移。     

沉默表皮生长因子受体的表达对肺腺癌A549细胞自噬的影响

目的：研究降低表皮生长因子受体（EGFR）的表达对肺腺癌A549细胞自噬活性的影响。方法：A549细胞中加入EGF处理,分为4组,即未处理组和10、25、50 ng/mL EGF处理组,用Western blot方法检测EGFR的蛋白表达;采用转染siRNA降低肺腺癌细胞A549细胞EGFR的表达,将A549细胞分为4组,即未处理组、EGFR siRNA-1组、EGFR siRNA-2组和EGFR siRNA-3组,分别采用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测EGFR mRNA和蛋白表达水平来评价3个siRNA的沉默效果;将A549细胞分为转染EGFR siRNA组、转染空载体组、转染试剂组（只加入等量转染试剂）及未处理组,且4组均加入等量的50 ng/mL EGF,用Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达,观察沉默EGFR表达对自噬活性变化;A549细胞分为转染EGFR siRNA组和转染空载体组,用透射电子显微镜观察自噬小体。结果：转染siRNA后A549细胞EGF蛋白的表达降低,LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化水平升高（P < 0.05）,细胞内出现较多自噬小体,自噬活性明显增加。结论：降低EGFR的表达可以提高肺腺癌A549细胞自噬活性。     

miR-29a对人胃癌细胞增殖、迁移的影响及其机制研究

目的：探讨微小RNA-29a（miR-29a）对人胃癌细胞增殖、迁移的影响及其机制。方法：胃癌SGC-7901细胞随机分为miR-29a转染组、质粒对照组、空白对照组、信号转导子与转录激活子3（STAT3）抑制组。miR-29a转染组、质粒对照组采用脂质体转染法分别将has-miR-29a mimics质粒、siRNA对照质粒转染至人胃癌SGC-7901细胞,STAT3抑制组细胞加入STAT3抑制剂溶液,空白对照组不做处理。实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和Western blot法检测转染后细胞中miR-29a、血管内皮生长因子（VEGF）、STAT3、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）mRNA和蛋白的表达情况;MTT、划痕实验分别检测细胞增殖和迁移情况。结果：qPCR和Western blot实验结果显示,与空白对照组和质粒对照组比较,miR-29a转染组的miR-29a相对表达水平升高,VEGF、cyclin D1 mRNA及蛋白相对表达水平与p-STAT3/STAT3比值均下降（P < 0.01）。MTT实验与划痕实验结果显示,与空白对照组和质粒对照组比较,miR-29a转染组细胞在培养24、48、72 h的细胞相对增殖率及迁移率降低（P < 0.01）。与空白对照组比较,STAT3抑制组细胞的cyclin D1 mRNA及蛋白相对表达水平、p-STAT3/STAT3比值均降低,细胞相对增殖率与迁移率降低（P < 0.01）。结论：miR-29a能降低VEGF mRNA、蛋白的表达,抑制人胃癌细胞增殖和迁移,其机制可能与下调p-STAT3及cyclin D1的表达有关。     

miR-223-3p通过调控ECT2诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的实验研究

目的：探讨miR-223-3p对非小细胞肺癌细胞增殖与凋亡的影响及其可能的作用机制。方法：选取24例非小细胞肺癌患者的癌及癌旁组织,实时定量PCR检测miR-223-3p的相对表达水平,免疫组化检测分析上皮细胞转化序列2（ECT2）蛋白的表达水平,并对两者进行相关性分析。将人非小细胞肺癌A549细胞分为正常对照组、转染对照组、miR-223-3p过表达组,其中正常对照组细胞未作任何处理,转染对照组细胞转染空质粒载体,miR-223-3p过表达组转染miR-223-3p mimics。MTT实验和平板集落形成实验检测各组细胞的增殖率,流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,Western blot实验检测ECT2蛋白的表达水平;采用siRNA转染法沉默A549细胞中的ECT2后,检测细胞增殖及凋亡的变化。结果：miR-223-3p在癌组织中表达显著低于癌旁组织,而癌组织中ECT2蛋白表达高于癌旁组织,二者存在负相关关系（r=-0.666,P < 0.05）;与正常对照组和转染对照组细胞相比,miR-223-3p过表达组细胞的增殖率降低（P < 0.05）,ECT2蛋白表达显著降低,而细胞凋亡率显著升高（P < 0.05）;沉默ECT2对细胞增殖和凋亡的影响与过表达miR-223-3p基本一致。结论：miR-223-3p可能通过负向调控ECT2的表达,进而抑制非小细胞肺癌细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制有待进一步研究。     

氟达拉滨与TRAIL联用诱导肺癌细胞凋亡及 其作用机制

目的：研究氟达拉滨（Fludarabine）在低浓度下与TRAIL联合处理是否能够诱导人肺癌A549细胞发生凋亡,并探讨其作用机制。方法：实验设对照组、Fludarabine组、TRAIL组、Fludarabine和TRAIL联合组,CCK-8法检测Fludarabine与TRAIL联合处理时对A549细胞及人脐静脉内皮细胞（HUVEC,人正常细胞作为对照）增殖活力的影响,流式细胞术检测A549细胞凋亡情况,Western blot法检测凋亡相关蛋白Survivin、Bcl-2、Bcl-xl、caspase-8、caspase-3、JNK和p38的表达情况。结果：25、50 μmol/LFludarabine或50 ng/mL TRAIL单独处理时对A549及HUVEC细胞增殖活力均无明显影响（P均>0.05）,两者联合处理后对A549细胞增殖活力抑制率分别为30.9%和44.9%。Fludarabine或TRAIL单独使用时对A549细胞凋亡无明显影响,联合处理时可使A549细胞凋亡率达到89.3%。与对照组、Fludarabine组和TRAIL组相比,Fludarabine与TRAIL联合处理可使A549细胞中Survivin、Bcl-2、Bcl-xl表达降低（P均<0.05）,促进caspase-8及caspase-3的激活,并能促进JNK和p38的磷酸化（P均>0.05）。结论：Fludarabine与TRAIL联合处理可促进A549细胞凋亡。     

白藜芦醇对肺癌紫杉醇耐药细胞的增殖抑制作用及其机制

目的：研究白藜芦醇作用后人肺腺癌紫杉醇耐药细胞对紫杉醇敏感性的改变,并探讨其作用机制。方法：建立人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Taxol-R,用不同浓度白藜芦醇、紫杉醇单独或联合干预A549/Taxol-R细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率;概率单位法计算半数抑制浓度（IC₅₀）;观察不同浓度白藜芦醇处理后,紫杉醇对A549/Taxol-R细胞IC₅₀的变化;流式细胞术检测细胞凋亡水平;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达。结果：白藜芦醇对A549/Taxol-R细胞增殖的抑制率具有浓度和时间的双重依赖性（P均 < 0.05）。白藜芦醇处理后,紫杉醇对A549/Taxol-R细胞的IC₅₀值下降,从（17.50±1.24）μg/mL降低至（4.18±0.62）μg/mL。白藜芦醇和紫杉醇联合干预的A549/Taxol-R细胞凋亡率、坏死率高于单独干预组（P < 0.05）,联合干预组A549/Taxol-R细胞的Bax、Caspase-3的表达较单独干预组上调,而Bcl-2的表达则相对下调（P < 0.05）。结论：白藜芦醇可能通过促进细胞的凋亡来增强人肺腺癌紫杉醇耐药细胞对紫杉醇的敏感性,其机制可能和促进Bax、Caspase-3的表达,下调Bcl-2的表达有关。     

防己诺林碱对肺癌H1299和A549细胞的作用及其分子机制研究

目的 探究防己诺林碱在肺癌中的作用及其分子机制。方法 MTS法检测经10、15、20、30、40和60 μM/L防己诺林碱处理的肺癌H1299和A549细胞的增殖情况,通过Caspase3、Caspase8和Caspase9活性检测试剂盒和TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况。Western blot检测MAPK信号通路(p-Akt、PI3K、mTOR和Akt蛋白)、增殖和转移(MMP-2、MMP-9、PCNA、Cyclin D1和P21蛋白)、周期和凋亡(Cyclin D2、Bcl2、MCL-1、Bax和p53蛋白)相关蛋白的表达情况,通过Real-time PCR检测PI3k、mTOR、MMP-2、MMP-9、PCNA、Cyclin D1、Cyclin D2、MCL-1、Bax、Bcl2和TP53基因表达情况。结果 防己诺林碱会抑制肺癌H1299和A549细胞的增殖,诱导细胞凋亡,增加Caspase3、Caspase8和Caspase9酶活性。经防己诺林碱处理后,PI3K、p-Akt、mTOR、MMP-2、MMP-9、PCNA、Cyclin D1、Cyclin D2和Bcl2蛋白表达降低,P21、MCL-1、Bax和p53蛋白表达升高,并且表现为剂量依赖性,但对Akt蛋白表达无影响;PI3K、mTOR、MMP-2、MMP-9、PCNA、Cyclin D1、Cyclin D2和Bcl2基因表达降低,TP53、MCL-1和Bax基因表达增加。结论 防己诺林碱通过调控MAPK信号通路、增殖和转移、周期和凋亡相关蛋白和基因的表达,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

沉默HOXC8增加A549细胞对放射敏感性作用机制研究

目的 探讨HOXC8对非小细胞肺癌A549细胞放射敏感性影响及潜在机制,以期为临床联合治疗提供新思路。方法 慢病素感染构建稳定沉默HOXC8的A549细胞,qPCR和蛋白印迹法进行验证;克隆形成实验检测A549稳转株对放射敏感性影响;蛋白印迹法检测沉默HOXC8后TGF-β1及其下游信号蛋白表达变化。结果 成功构建沉默HOXC8的A549稳转株;沉默HOXC8后A549细胞活力和克隆形成能力显著降低;沉默HOXC8后也增加了A549细胞对放射的敏感性;沉默HOXC8显著抑制了TGF-β1及其下游信号蛋白p-Smad2/3表达。结论 沉默HOXC8可能通过抑制TGF-β1信号转导增加A549细胞对放射的敏感性,HOXC8可能在其中起重要作用。     

抑制TPD52基因表达对结直肠癌细胞凋亡及ROS含量的影响

目的:探讨抑制肿瘤蛋白D52（TPD52）基因表达对结直肠癌细胞活力、凋亡率及活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量的影响及机制。方法:正常结肠NCM460细胞作为对照细胞,分别用RT-PCR及Western blotting检测人结直肠癌Caco2、SW480、HCT116、HT29细胞TPD52的mRNA及蛋白表达。以LipofectamineTM 2000为载体,将抑制TPD52表达的siRNA（TPD52-siRNA）及阴性对照siRNA（NC）转染HCT116细胞,转染48 h,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率及ROS含量;Western blotting检测各组细胞增殖相关蛋白Ki67和PCNA及凋亡相关蛋白Bax和Survivin的蛋白表达。结果:与正常结肠NCM460细胞比较,Caco2、SW480、HCT116、HT29细胞中TPD52的mRNA及蛋白表达均明显升高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。转染TPD52-siRNA的HCT116细胞TPD52的mRNA及蛋白表达均明显降低,与空白对照组和NC组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。与NC组比较,TPD52-siRNA组细胞活力明显降低,凋亡率升高,ROS含量升高,Ki67、PCNA和Survivin的蛋白表达明显降低,Bax的蛋白表达明显升高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论:TPD52基因表达抑制可降低结直肠癌细胞活力和诱导凋亡,机制可能与细胞内ROS水平提高及Ki67、PCNA、Survivin表达下调和Bax表达上调有关。     

miR-194-5p调控LMNB1抑制肺腺癌细胞的生长转移

目的:探究miR-194-5p调控LMNB1对肺腺癌细胞生长转移的作用。方法:实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验检测肺腺癌组织和癌旁组织中miR-194-5p、LMNB1表达水平。体外培养肺腺癌细胞A549,分为对照组、miR-194-5p mimics阴性对照组、miR-194-5p mimics组。转染处理后,CCK-8实验检测各组A549细胞增殖情况,比较各组细胞活力;流式细胞实验检测各组A549细胞凋亡率;细胞划痕及Transwell小室侵袭实验分别检测各组A549细胞迁移、侵袭力,比较各组细胞迁移、侵袭数;免疫印迹实验检测各组A549细胞凋亡蛋白caspase-3、Bax和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin、Vimentin表达;qRT-PCR实验及免疫印迹实验分别检测各组A549细胞miR-194-5p、LMNB1 mRNA表达及LMNB1蛋白表达。结果:相比癌旁组织,肺腺癌组织中miR-194-5p表达水平明显降低（P＜0.05）,LMNB1表达水平明显升高（P＜0.05）。相比对照组,miR-194-5p mimics组A549细胞活力、细胞迁移数、细胞侵袭数、LMNB1 mRNA表达水平、Vimentin和LMNB1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率、miR-194-5p表达、caspase-3、Bax和E-cadherin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。miR-194-5p mimics阴性对照组A549细胞上述各指标与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:miR-194-5p可下调LMNB1表达,抑制肺腺癌细胞增殖,促进其凋亡,并降低其迁移及侵袭能力。     

UHRF1通过调控细胞自噬抑制肺腺癌细胞增殖的分子机制研究

目的 探讨泛素样含PHD和环指结构域1(Ubiquitin like with PHD and ring finger domains 1, UHRF1)在肺腺癌(Lung adenocarcinoma)细胞的增殖、自噬中的作用及其潜在机制。方法 通过生物信息学网站(TCGA)检测UHRF1在肺腺癌组织中的表达。qRT-PCR和Western blot检测肺腺癌细胞系(PC-9、A549和H1299)以及人支气管上皮细胞(16HBE)中UHRF1的表达。转染UHRF1-shRNA后, 采用CCK-8、克隆形成以及Ki-67检测肺腺癌A549细胞活性和增殖能力的改变;蛋白免疫印记检测自噬相关LC3-I/II、Beclin-1蛋白以及增殖相关蛋白CDK6、Rb和PCNA蛋白的变化;透射电镜观察敲除UHRF1后A549细胞中对于自噬小体的影响。结果 在肺腺癌患者组织中UHRF1表达明显高于癌旁组织, 而相对于正常的支气管上皮细胞16HBE, 肺腺癌细胞系A549与H1299中UHRF1的mRNA和蛋白水平均明显升高。此外, CCK-8法和克隆形成实验表明沉默UHRF1能够降低肺腺癌细胞系A549的生长效率。Ki-67免疫荧光法检测结果显示敲除UHRF1后A549细胞增殖能力相对于正常对照组明显降低。此外我们发现, 敲除UHRF1导致CKD6和PCNA蛋白水平相对于Control-siRNA组表达升高, 而Rb蛋白表达下调。我们同时还发现, 沉默UHRF1后能够提高LC3-II/LC3-I的比例, 诱导Beclin-1的表达上调。沉默UHRF1促进A549细胞中自噬小体的形成。结论 UHRF1在肺腺癌中高表达, 沉默UHRF1能够发挥抑制增殖的作用。而这种作用可能是通过促进细胞自噬产生的。     

干扰GTPBP4基因对食管癌EC9706细胞放射敏感性影响

目的 探讨沉默GTPBP4基因对人食管癌EC9706细胞系放射敏感性影响。方法 通过GEO数据库分析食管癌患者组织中GTPBP4的表达情况。利用重组质粒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术转染食管癌EC9706细胞系,使细胞中GTPBP4基因沉默,观察GTPBP4基因沉默对EC9706细胞增殖、凋亡及放射敏感性影响。通过qRT-PCR和蛋白质印迹法评估基因沉默效果及检测凋亡相关蛋白表达。应用MTT法检测转染后细胞的增殖变化。采用流式细胞术检测干扰GTPBP4基因表达后细胞凋亡变化。应用克隆形成实验检测细胞照射后放射敏感性变化。结果 GEO数据库分析表明GTPBP4基因在人食管癌组织中的表达明显高于正常邻近食管组织(P<0.001)。与空白对照组和阴性对照组相比,干扰组EC9706细胞的GTPBP4 mRNA及蛋白表达水平明显下降(均 P<0.001),表明质粒成功转染EC9706细胞。MTT检测结果显示干扰组EC9706细胞增殖率受到显著抑制(P<0.001)。流式细胞术结果显示干扰组EC9706细胞凋亡率明显升高(P<0.001),细胞凋亡明显增加(P<0.001);凋亡相关蛋白(Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3、Bax)表达明显升高,抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达下降(P<0.001、P=0.001、P=0.0014、P=0.005)。克隆形成实验结果显示干扰组EC9706细胞放射增敏比1.716。结论 GTPBP4基因在人食管癌组织中高表达,RNAi技术可有效抑制EC9706细胞GTPBP4基因表达,从而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、增强细胞对放射线的敏感性。     

番茄红素对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:研究番茄红素(lycopene,LP)对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响并探讨其机制.方法:体外培养并取对数生长期人非小细胞肺癌A549细胞,分别给予不同浓度的LP(2.5、5、10、20 μg/ml)和顺铂(40 μg/ml)进行干预,48 h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定吸光度值并计算细胞增殖抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡状况,逆转录PCR法(RT-PCR)检测细胞中凋亡相关基因(BaxmRNA、bcl-2 mRNA)表达,免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白(caspase-3)表达.结果:与空白对照组比较,LP能够剂量依赖性地提高人非小细胞肺癌A549细胞增殖抑制率,延长细胞周期中G0/G1期并缩短G2/M期,提高A549细胞凋亡率(AI),上调Bax mRNA表达、下调bcl-2 mRNA表达,提高Bax/bcl-2比值,上调caspase-3蛋白表达.结论:LP具有抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖并促进其凋亡的作用,其机制可能与LP能够阻滞细胞周期并调节凋亡相关基因蛋白表达有关.     

姜黄素联合KLF8-siRNA干扰对肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制

目的:探讨姜黄素联合KLF8-siRNA干扰对肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制.方法:采用脂质体法将KLF8-siRNA干扰序列转染至体外培养的A549细胞中,RT-PCR和Western blot检测转染效果.实验分为NC组(转染阴性对照)、KLF8-siRNA组(转染KLF8-siRNA)、Cur组(...     

Ki67基因RNA干扰增殖型腺病毒对肺癌细胞增殖的抑制作用

 目的 探讨Ki67基因小干扰RNA（Ki67．siRNA）增殖型腺病毒对肺癌细胞的示伤作用及IXlD／的表达情况。方法 提取重组腺病毒的DNA，PCR鉴定正确后，大量扩增，氯化铯梯度离心纯化，测病毒滴度。ZD-Ki67感染人肺癌细胞系（A549），通过荧光显微镜下观察和结晶紫染色法检测细胞病作用、IVITT法检测细胞存活、Western印迹法检测E1A、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Ki67表达。结果 PCR鉴定表明ZD55-Ki67包含目的基因且无野生型腺病毒的污染；ZD55-Ki67滴度为4．5×1010PFU／ml免疫印迹法证实ZD55-Ki67在肿瘤细胞中表达E1A；ZD55-Ki67抑制Ki67表达及肺癌细胞生长的作用显著优于Ad-Ki67。结论 ZD55-Ki67能够有效抑制Ki67基因的表达，降低肺癌细胞的增殖能力，为肺癌研究和抗肿瘤基因治疗提供新的策略。     

Effects of G250 promoter controlled conditionally replicative adenovirus expressing Ki67-siRNA on renal cancer cell

Replication-competent adenovirus (RCAd) has been used extensively in cancer gene therapy, and tumor-selection is critical for the use of replication-competent adenovirus. Here we investigated the anti-tumor characterization of oncolytic virus, whose E1A gene is under the control of a renal cell carcinoma specific promoter - the G250 promoter. The constructed oncolytic virus G250-Ki67 is armed with transgene of Ki67-siRNA, and G250-ZD55-Ki67 also with E1B-55 KD deleted. The tumor-specific expression of E1A and Ki67 was demonstrated by Western blot and immunohistochemistry staining, and the tumor-specific cytotoxicity was assessed by crystal violet staining and cell viability assays. The G250-Ki67 and G250-ZD55-Ki67 adenoviruses could express E1A protein in 786-O and OSRC cell lines but not in ACHN and HK-2 cell lines. The expression of Ki67 gene in 786-O and OSRC cell lines were suppressed by these adenoviruses. The cytotoxic effects induced by G250-ZD55-Ki67 and G250-Ki67 were more obvious on the 786-O cell lines than on the OSRC cell lines. Each group of adenoviruses could inhibit the proliferation of the 786-O cells and OSRC cells. However, the effects induced by G250-ZD55-Ki67 and G250-Ki67 on 786-O cells were stronger than on OSRC cells. Moreover, G250-ZD55-Ki67 had enhanced antitumor activities in these renal cancer cells compared with G250-Ki67. G250 promoter-derived CRAds carrying Ki67-siRNA could highly amplify and express Ki67-siRNA in renal cancer cells with expression of G250 antigen, inhibit renal cancer cells proliferation and induce apoptosis. These results demonstrated that the G250-specific oncolytic adenovirus expressing Ki67-siRNA is applicable for human renal clear cell cancer therapy.