体内示踪技术评价噬菌体展示肽GX1特异靶向胃癌新生血管

目的:评价噬菌体展示肽GX1与胃癌新生血管结合的特异性及体内靶向性。方法:化学合成Bio-GX1展示肽;构建人胃癌移植瘤裸鼠模型,A组将Bio-GX1展示肽经尾静脉注入荷瘤小鼠体内,分别于体内循环8h、12h、18h、24h时处死裸鼠,B组将GX1噬菌体经尾静脉注入荷瘤小鼠体内,于体内循环8min时处死裸鼠,免疫荧光方法检测GX1噬菌体及展示肽与胃癌血管体内结合特异性及靶向性;构建小鼠肾包膜下胃癌移植瘤模型,分别于移植瘤术后第5天、第10天经尾静脉注入Bio-GX1展示肽,体内循环8h处死小鼠,免疫荧光方法检测GX1与胃癌血管体内结合的特异性及靶向性。结果:GX1展示肽体内循环8-24h,GX1噬菌体体内循环8min,可特异靶向人胃癌移植瘤裸鼠胃癌组织血管,而与肝、心、脾、肾(脑)、肺、肌肉组织等对照组织血管未见明显结合;GX1展示肽体内循环8h,可特异靶向小鼠肾包膜下胃癌移植瘤模型肿瘤血管,与对照组织血管未见明显结合。结论:GX1噬菌体及展示肽均可在体内特异靶向胃癌血管,具有体内胃癌血管靶向性,可作为胃癌血管靶向治疗及诊断的有效候选分子。     

单克隆抗体在肿瘤抗血管新生治疗策略中的研究进展

血管新生 (Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)是在体内已存在血管的基础上形成新生血管并随之与其吻合的过程。包括活化内皮细胞的增殖、迁移、浸润、管状结构形成和新生血管的成熟几个连续的步骤。近年来 ,随着对血管新生研究的日益深入 ,产生了各种血管新生抑制剂 (ａｎｇｉｏｇｅｎ     

应用免疫沉淀-质谱法筛选肿瘤血管靶向肽CGNSNPKSC的结合受体

目的：筛选和鉴定肿瘤血管靶向肽GX1（CGNSNPKSC）的结合受体。方法：化学合成生物素标记的GX1，培养内皮细胞并收集细胞膜蛋白；利用免疫沉淀的方法进行免疫磁珠分离，富集能与血管特异性短肽GX1结合的蛋白质；利用生物素-亲和素系统进行westernblot免疫检测，筛选出能和GX1结合的目的条带；利用液相色谱-二级质谱（LC—MS／MS）对能与血管特异性短肽GX1结合的蛋白质进行测序鉴定。结果：利用免疫沉淀和westernblot的方法，获得了能与GX1结合的蛋白条带，其分子量为13KDa。利用LC-MS／MS及生物信息学分析，获得了8个候选蛋白：cDNA FLJ40018fis，clone STOMA 2006398，cytochromeP45019A1，pmble histone—lysine N-methyltransferaseASHlL，adenylylcyclase—associated protein2（CAP2），similar to ankyrin repeat domain20A，diacylglycerol kinaseiota（DGKI），isoform 2 of Inositol1，4，5-trisphosphate receptor type1，similartoannexinA2 isoforml。结论：利用免疫沉淀-质谱法获得了8个GX1结合受体的候选蛋白，为进一步寻找血管抑制治疗的靶标奠定了一定的实验基础。     

高通量肿瘤血管新生研究技术平台的建立

目的：建立高通量肿瘤血管新生研究的体内外技术平台。方法：以VEGF,hFGF为血管新生因子,以Thalidomide血管新生抑制因子对体外培养的血管内皮细胞系（RF／6A,SVEC）应用MTT试验,迁移试验,浸润试验和管状形成试验检测内皮细胞的各种特性;体内实验以鸡胚C57BL／6小鼠为实验动物检测血管新生因子和抑制因子在体内对血管新生的影响。结果：VEGF和bFGF在体内和体外均有促进血管新生的作用,体外试验表明VEGF和bFGF对内皮细胞的增殖活性,迁移、浸润和管状结构形成均有明显的促进作用（P＜0．01）;小鼠体内栓子试验和鸡胚绒毛尿囊膜试验结果均表明,VEGF和b FGF对体内血管新生同样具有促进或刺激作用,和阴性对照组相比主要表现在新生血管密度高、管腔大、管壁完整等;而Thalidomide在体内外均有明显抑制血管新生的作用。结论：本技术平台是一个高通量、经济、简便易行、实用的血管新生研究技术平台。     

抗ATPase F1α抗体对人非小细胞肺癌血管内皮细胞的抑制作用

目的: 探讨一种新的抗ATPase F1α抗体，人血管抑制和肿瘤转移相关蛋白(human angiostatin interacting and tumor metastasis involving protein, HAITMIP)抗体((MAb3D5AB1,简称GX)对人非小细胞肺癌血管内皮细胞（nonsmall cell lung cancerderived vascular endothelial cell，NSCLCVEC）的抑制作用。 方法: 从非小细胞肺癌患者手术切除标本分离和原代培养NSCLCVECs；采用免疫荧光法检测NSCLCVECs膜上ATPase F1α的表达，RTPCR分析细胞ATPase F1αmRNA的表达水平；CCK8 法检测GX对NSCLCVECs增殖的抑制效应，划痕损伤实验检测GX对NSCLCVECs迁移的抑制作用，FACS检测GX对NSCLCVECs凋亡的影响。结果: 倒置荧光显微镜检测显示， NSCLCVECs胞膜上有ATPase F1α的显著表达；RTPCR的结果表明，分别来源于肺腺癌、肺鳞癌的血管内皮细胞中ATPase F1αⅡ肽段基因片段大小为668 bp。CCK8结果表明，经GX处理，NSCLCVECs的增殖活力显著低于对照组（P<0.01）；划痕损伤实验结果显示，经GX处理的NSCLCVECs的迁移速度显著低于对照组（P<0.01）；FACS结果显示，GX处理后NSCLCVECs的凋亡率高于对照组（P<0.01）。结论: ATPaseF1α在NSCLCVECs膜上有较高的表达，GX通过靶向作用于ATPaseF1α抑制NSCLCVECs的增殖、迁移，并诱导细胞凋亡。     

重组人血管内皮抑素对血管新生的影响研究

目的 探讨重组人血管内皮抑素（Endostar,恩度）对血管内皮细胞趋化、迁移、粘附、增殖及小管形成等与血管新生相关生物学行为的影响。方法 以原代培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为细胞模型,通过Boyden小室荧光定量分析、划痕试验、HUVEC荧光定量粘附分析、CFSE染色流式细胞术、CCK-8定量检测、小管形成试验和Matrigel栓试验研究恩度对HUVEC与血管新生相关的生物学行为的影响。结果 恩度在5～50 000ng／ml范围内可抑制血管内皮生长因子诱导HUVEC的迁移运动,且浓度为50ng／ml和500ng／ml时效果最明显;恩度在5～50 000ng／ml间可呈剂量依赖的方式抑制HUVEC向损伤部位的迁移。与0ng／ml相比,50、500和5000ng／ml 恩度处理的HUVEC的粘附率、增殖率及HUVEC形成网状小管结构的数量、面积和长度均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）; Matrigel栓实验结果显示,恩度在50～5000ng／ml间对SCID小鼠体内血管新生有明显的抑制作用。结论 恩度在细胞水平能抑制HUVEC与血管新生相关的生物学行为,包括HUVEC的趋化、迁移、粘附、增殖和小管形成;在动物水平能抑制SCID小鼠体内的血管新生,据此推断恩度能抑制血管新生。     

促血管生成素在肿瘤血管新生中的作用

促血管生成素(angiopoietin,Ang)是一族分泌性蛋白因子，作用于内皮特异受体酪氨酸激酶Tie-2，影响内皮的增殖、迁移及管状结构形成，在胚胎期血管发生及成年机体的生理、病理性血管新生中发挥重要作用。Ang及其受体在肿瘤组织表达明显高于周围正常组织，特别是Ang-2，特异表达于肿瘤边缘的血管重建区，参与肿瘤血管新生的起始及延续过程，影响肿瘤生长和转移，并有望成为一种新的抗肿瘤血管新生靶向因子。     

肿瘤血管靶向肽GX1的受体筛选

目的：筛选肿瘤血管靶向肽GX1（CGNSNPKSC）的受体。方法：化学合成生物素标记的GX1,分离培养原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,培养并收集共培养人脐静脉内皮细胞（co-HUVECs）全蛋白;应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与GX1结合的蛋白质;采用银染检测,确定并获取特异性蛋白条带;利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALD I-TOF-MS）及生物信息学分析,对条带蛋白进行测序和分析。结果：免疫沉淀和银染法获得与GX1特异性结合的蛋白条带,其分子量在10-15KDa之间。利用MALDI-TOF-MS及生物信息学分析获得了一个有意义的候选蛋白核苷二磷酸激酶A（NDPKA）。结论：利用免疫沉淀-质谱法筛选获得了GX1受体的候选蛋白,为研究GX1的作用机制奠定了基础。     

长春瑞滨及联合热疗抗血管生成作用的实验

目的探讨长春瑞滨及联合热疗对血管生成的抑制作用。方法以人肺癌A549细胞为对照,采用MTT法观察长春瑞滨及联合热疗对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响;通过Transwell趋化实验、小管形成实验及流式细胞术观察长春瑞滨对HUVEC迁移、小管形成及细胞凋亡的影响;利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,观察长春瑞滨对体内CAM新生血管的影响。结果小剂量（0.1～1 ng/ml）长春瑞滨对HUVEC和A549增殖抑制具有差异细胞毒性（P=0.000）。0.1～1 ng/ml 长春瑞滨呈剂量依赖性抑制HUVEC增殖（r=0.993,P=0.000）,联合热疗具有抑制HUVEC增殖的叠加或协同效应。小剂量长春瑞滨能够抑制HUVEC迁移和小管形成,诱导HUVEC凋亡,遏制CAM新生血管形成。结论小剂量长春瑞滨具有抗血管生成作用,联合热疗具有协同或叠加效应。     

食管鳞癌细胞外泌体中miR-130a对血管新生的作用及其机制

目的 探讨食管鳞癌细胞外泌体中的miR-130a对血管新生的作用及其机制。方法 提取食管上皮细胞HEEC、食管鳞癌细胞TE-13和Eca-109所分泌的外泌体及转染miR-130a mimic、miR-130a inhibitor及其阴性对照（NC）后的Eca-109细胞外泌体,并与人脐静脉血管内皮细胞HUVEC共孵育。采用MTT、Transwell小室及小管形成实验检测各组HUVEC细胞的增殖、迁移和小管形成能力,qRT-PCR检测miR-130a的表达水平,Western blot检测PI3K和AKT的磷酸化水平以及PTEN、Ang1和iNOS的表达水平。结果 HUVEC细胞与TE-13、Eca-109细胞外泌体共孵育后,增殖、迁移以及小管形成能力均增强（P＜0.01）,PI3K与AKT磷酸化水平及Ang1与iNOS的表达水平上调（P＜0.001）,而PTEN表达水平下调（P＜0.001）。qRT-PCR检测结果显示,TE-13和Eca-109细胞外泌体中的miR-130a表达水平均高于HEEC细胞（P＜0.01）。下调Eca-109细胞外泌体中的miR-130a表达可抑制HUVEC细胞增殖、迁移及小管形成能力（P＜0.01）,同时下调PI3K和AKT的磷酸化及Ang1和iNOS表达水平（P＜0.001）,上调PTEN表达水平（P＜0.001）。结论 食管鳞癌细胞外泌体中的miR-130a可能通过激活血管内皮细胞的PTEN/PI3K/AKT信号通路诱导肿瘤血管新生。     

肿瘤血管靶向肽GX1的受体筛选

目的:筛选肿瘤血管靶向肽GX1(CGNSNPKSC)的受体.方法:化学合成生物素标记的GX1,分离培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs),培养并收集共培养人脐静脉内皮细胞(co-HUVECs)全蛋白;应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与GX1结合的蛋白质;采用银染检测,确定并获取特异性蛋白条带;利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)及生物信息学分析,对条带蛋白进行测序和分析.结果:免疫沉淀和银染法获得与GX1特异性结合的蛋白条带,其分子量在10-15KDa之间.利用MALDI-TOF-MS及生物信息学分析获得了一个有意义的候选蛋白核苷二磷酸激酶A(NDPKA).结论:利用免疫沉淀-质谱法筛选获得了GX1受体的候选蛋白,为研究GX1的作用机制奠定了基础.     

肿瘤血管内皮特异性靶向肽 GX1 与 NGR 在胃癌中显像差异分析

目的：分析肿瘤血管内皮特异性靶向肽GXl与NGR在胃癌中显像差异。方法：构建人胃癌移植瘤裸鼠模型，99Tcm直接法制,99Tcm-GXI、99Tcm-NGR，由尾静脉分别注入荷瘤小鼠体内，SPECT显像连续追踪24h，观察两组小肽在胃癌中显像差异，计算机勾划肿瘤及心脏感兴趣区，比较两组T／NT比值差异。结果：99Tcm直接法标记NGR，所得标记率在90％以上，无需纯化，比活度大于200Ci／mmol，具有良好的体内外稳定性。两组荷瘤小鼠自8h起右后肢背侧肿瘤部位均可见放射性浓聚，T／NT比值随时间延长总体呈递增趋势。99Tcm-GX1组自8h起，肿瘤部位放射性浓聚即高于心血池本底，T／NT比值〉199Tcm-NGR组8h-18h肿瘤部位放射性分布均低于心血池本底，T／NT比值〈1，至24h其肿瘤部位放射性明显浓聚，并超过心血池本底，T／NT比值增高至1．34。比较两组T／NT比值，自8h至18h，99Tcm-GXl组其比值持续高于99Tcm-NGR组，但至24h小时，99Tcm-NGR组比值迅速升高并高于99Tcm-GXl组。结论：99Tcm-直接法标记NGR，标记率大于90％，比活度高，体内外稳定性好，具有良好的生物学活性，完全可以满足SPECT显像的要求。”99Tcm-GX1、99Tcm-NGR均能够靶向到荷瘤小鼠的肿瘤组织，具有肿瘤标志物的影像学特征，与99Tcm-NGR相比，99Tcm-GX1灵敏度更高，适合早期实时探测，而99Tcm-NGR在晚期实时探测方面具有更多优势。     

PTP1B基因对人胃癌细胞株的增殖和迁移能力的影响

背景与目的：胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤,术后易复发和转移。前期研究发现,蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)基因与胃癌肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期有关。本研究通过RNA干扰技术和基因克隆技术分别沉默和上调胃癌细胞中PTP1B基因的表达,观察PTP1B基因对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法：将靶向沉默PTP1B基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列和克隆人的PTP1B cDNA基因序列分别转染MKN28和MKN45细胞,采用实时定量PCR(quantitative realtime PCR,qRT-PCR)、蛋白［质］印迹法(Western blot)分别检测转染后细胞中PTP1B基因和蛋白的表达水 平,使用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、Transwell迁移试验和划痕试验分别观察PTP1B基因对细胞增殖和迁移能力的影响。结果：转染shRNA后,MKN28细胞中PTP1B mRNA和蛋白表达量与空白对照组、阴性对照组相比抑制显著(P＜0.05)。CCK-8增殖活性实验显示,shRNA沉默PTP1B基因表达后能显著抑制胃癌MKN28细胞在48、72和96 h的增殖活性(P＜0.05)。Transwell迁移试验和划痕实验显示,PTP1B表达下调后胃癌MKN28细胞的迁移能力受到显著抑制(P＜0.05)。而提高PTP1B在MKN45细胞中表达后,细胞的增殖和迁移能力则显著提高(P＜0.05)。结论：PTP1B基因是胃癌细胞增殖和迁移的重要调控因子。     

下调胰岛素样生长因子-1表达对人胃癌细胞增殖和侵袭及迁移的影响

目的 胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor-1,IGF-1)作为体内重要的促有丝分裂原分子,可能与恶性肿瘤的转化及转移相关,但是目前有关IGF-1的表达与胃癌细胞迁移、侵袭的研究较少.本研究旨在研究IGF-1在胃癌组织中的表达,并探讨其表达对人胃癌HGC-27细胞体外增殖及侵袭、迁移能力的影响.方法 检测承德医学院附属医院2014-05-10-2016-05-10胃癌手术切除78例胃癌组织、30例癌旁正常组织及体外不同胃癌细胞系中IGF-1的表达情况.针对IGF-1基因序列,设计发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)干扰序列并构建干扰载体,转染胃癌HGC-27细胞.荧光实时定量PCR及蛋白质印迹技术分别检测转染干扰载体后HGC-27细胞中IGF-1的表达情况.细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)、划痕实验及Transwell侵袭实验分别检测下调IGF-1对体外细胞HGC-27增殖及迁移、侵袭能力的影响.结果 免疫组织化学法检测显示,低分化胃癌组织中IGF-1阳性表达率为76％(29/38),高、中分化为53％(21/40),癌旁正常组织为27％(8/30).不同胃癌组织与癌旁组织中IGF-1的表达差异有统计学意义,x2=16.66,P＜0.01.并且其表达与胃癌的病理分期(x2=7.430,P=0.007)、组织分化(x2=4.618,P=0.032)等病理因素相关.体外不同胃癌细胞系中IGF-1均呈现高表达,但差异无统计学意义.利用干扰载体能够有效下调胃癌细胞HGC-27中IGF-1在mRNA及蛋白质水平的表达.与空载体转染对照组和野生型HGC-27细胞比较,IGF-1表达下调明显抑制胃癌细胞的体外增殖和侵袭、迁移能力.结论 IGF 1在体内胃癌组织及体外胃癌细胞中高表达,下调IGF-1的表达能够抑制人胃癌细胞HGC-27的增殖及体外侵袭、迁移能力.     

ZIC1联合苦参碱对人乳腺癌 MDA - MB -231细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的：探讨 ZIC1联合苦参碱对人乳腺癌 MDA - MB -231细胞的增殖、迁移能力及凋亡的影响。方法：将慢病毒载体 rLV - Zic1- PGK - puro 稳定转染人乳腺癌 MDA - MB -231细胞株并得到稳定传代的细胞株,Western blot 法检测转染效果。以人乳腺癌 MDA - MB -231细胞及 ZIC1基因稳定转染的细胞为研究对象进行药物实验,MTT 法筛选出苦参碱的半数抑制浓度（IC50）后分组,划分 A 空载不加药组（阴性对照组）,B空载加药组,C 转染不加药组和 D 转染加药组。对四组细胞采用黏附试验检测细胞黏附（增殖）能力、划痕实验检测细胞迁移能力、流式细胞术检测细胞凋亡。结果：ZIC1或苦参碱单独作用均可抑制乳腺癌 MDA - MB-231细胞黏附（增殖）、迁移及增强其凋亡,差异较对照组有统计学意义（P <0.05）,且在抑制细胞迁移上存在时间依赖性。两者联合作用抗癌效果更明显,差异较其它三组有统计学意义（P <0.05）。结论：苦参碱联合 ZIC1可明显增强对人乳腺癌 MDA - MB -231细胞的抑癌效果。     

沉默MTA1表达对胃癌SGC7901细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:观察转移相关基因1（MTA1）基因沉默对人胃癌细胞SGC7901增殖和迁移侵袭能力的影响,探讨 MTA1基因在胃癌发生发展中的作用。方法:利用脂质体法将靶向MTA1的小分子干扰 RNA（siRNA） 转染到胃癌细胞株 SGC7901中。运用Real time PCR 和Western blot 技术检测SGC7901细胞内MTA1的 mRNA和蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell小室实验观察细胞迁移和侵袭能力。结果:MTA1 siRNA 可有效抑制SGC7901细胞MTA1基因在 mRNA 和蛋白水平上的表达（P﹤0.01）。CCK-8实验表明MTA1 siRNA 转染后细胞增殖不受影响;Transwell小室实验表明细胞迁移和侵袭能力明显下降。结论:沉默MTA1表达可抑制胃癌细胞株 SGC7901迁移和侵袭,而不影响细胞增殖。MTA1在胃癌侵袭转移过程中可能发挥重要作用。     

重组人血管内皮抑制素对鼻咽癌HNE-1细胞株体外血管生成拟态的抑制作用

目的：研究重组人血管内皮抑制素（rh-Endostatin，Endostar，恩度）对人鼻咽低分化鳞癌HNE-1细胞的增殖、迁移及体外血管生成拟态的影响。方法：用不同浓度恩度（0～50μg／m1）处理HNE-1细胞，MTT法检测HNE-1细胞增殖活性的变化；创伤修复实验检测细胞迁移能力的变化。在Matrigel上接种HNE-1细胞，观察HNE-1细胞能否形成血管网状结构及其特点；体外管状形成抑制试验检测恩度对HNE-1细胞管道形成能力的影响。结果：恩度（1-50μg／m1）组的OD值与对照组比较无明显统计学差异（P〉0．05），但可以显著降低HNE-1细胞的迁移速度（P〈0．01），且与浓度呈负相关（r=-0．983，P〈0．01）。HNE-1细胞在Matrigel上培养能形成血管网状样结构，并能与内皮细胞连接共同构成马赛克样血管网状结构；恩度能抑制HNE。1细胞体外管道形成（P〈0．01），其管状结构数量与恩度浓度呈负相关（r=-0．978，P〈0．01）。结论：HNE-1细胞具有血管生成拟态及与内皮细胞共同形成马赛克血管的能力，恩度能够抑制HNE-1细胞的迁移和体外血管生成拟态形成。     

胃癌中MPZL1的表达及其对胃癌细胞增殖能力的影响

目的 探讨MPZL1在胃癌中的表达及其与胃癌患者预后的关系和对胃癌细胞增殖、克隆形成能力的影响。方法 利用GEPIA、UALCAN在线数据库分析MPZL1在多种恶性肿瘤中的表达情况，进一步运用KM Plotter和UALCAN数据库分析MPZL1对胃癌患者总生存时间的影响；采用Western blot检测胃癌细胞中MPZL1蛋白表达情况以及凋亡信号通路蛋白的变化；运用CCK-8和平板克隆实验分别检测MPZL1的表达变化对细胞增殖和克隆形成能力的影响。结果 在线数据库GEPIA发现MPZL1在多种恶性肿瘤中呈高表达趋势。UALCAN和KM Plotter数据库分析结果显示MPZL1在胃癌组织中高表达，可能与胃癌患者的总生存时间呈负相关；CCK-8和平板克隆形成实验结果显示，过表达MPZL1促进胃癌细胞的增殖和克隆形成能力（P<0.05）；Western blot结果显示，促凋亡蛋白Bad、Caspase-7表达水平在过表达组较对照组明显减少，在敲减组的表达水平高于对照组。结论 MPZL1在胃癌组织中高表达，且促进胃癌细胞的增殖、克隆形成能力，可能与抑制凋亡信号通路有关。