肝细胞肝癌中乙肝病毒基因整合位点及临床病理分析

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)在肝细胞肝癌(HCC)染色体上的整合规律及其与临床病理的关系.方法 收集40例HBsAg阳性HCC患者围手术期的一般临床资料和病理学资料,并进行随访.以40例HCC组织的DNA为模板,HBVX基因上游序列和人类基因组Alu重复序列为引物,应用巢式PCR原理,扩增出HBV X基因及其侧翼的人基因组DNA片段.PCR产物割胶回收后以ABI公司3700XL测序仪进行全自动测序.所获结果经美国国家生物技术信息中心(NCBI) BLAST及Mapviwer检索确认HBV整合在染色体上的精确位置.结合临床病理及随访资料分析HBV DNA整合对HCC患者的影响.结果 40份HCC组织中,18例存在HBV整合现象,整合的标本中15例正向插入宿主基因,7例反向插入宿主基因,其中4例既有正向插入,又有反向插入,有2例标本有两个HBV整合位点.从病毒基因分析,整合可发生于X基因的任意长度,且均以截短方式插入宿主细胞DNA.另有22份标本未检测到有整合.HBV整合与HCC患者在性别、年龄、AFP、癌栓及复发等方面无关(P＞0.05);而与HBV DNA、肿瘤大小、分化程度呈正相关(P＜0.05).结论 HBV在HCC细胞染色体上的整合呈不均衡分布.HBV整合与HCC患者HBV DNA、肿瘤大小、分化程度呈正相关.     

C-myc基因扩增、p16基因变异和乙型肝炎病毒DNA整合与肝细胞癌的相关性研究

目的 探讨C－myc基因扩增、p16基因变异和乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合与肝细胞癌（HCC）的相关性。方法 应用差异聚合酶链反应（d-PCR)分析C－myc基因扩增,用聚合酶链反应（PCR）和单链构象多态（SSCP）分析p16基因变异,用PCR法检测整合型HBV－DNA。结论 （1）HCC组外周血、癌和癌旁肝组织中C－myc基因扩增阳性率分别为48％（14／29）、45％（13／29）和52％（15／29）,3者间差异无显著意义（x^2＝0．0008,P＞0．05,自由度ν＝2）,但明显高于肝硬化（LC）组外周血和LC组织阳性率[0(0/12)和8％（1／12）,P均小于0．05]。（2）29例癌组织中有3例p16基因纯合性缺失,未发现点突变。（3）正常肝、肝硬化和肝癌组织中整合型HBV－DNA阳性率分别为14／5（2／14）、67％（8／12）和97％（28／29）,3者间差异有显著意义（x^2＝29．4345,P＜0．01）。结论（1）HCC的发生与C－myc基因扩增密切相关;（2）HCC中p16基因的纯合性缺失发生频率为10％;（3）HBV－DNA整合与HCC的发生密切相关;（4）对外周血的检测能反映肝细胞（C－myc基因扩增和HBV－DNA整合情况。     

基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。     

乙型肝炎病毒基因型与肝细胞肝癌关系的研究

目的 探讨HBsAg阳性肝细胞肝癌(HCC)患者乙型肝炎病毒(HBV)DNA基因型与其患HCC之间的关系.方法 运用PCR条带分析与基因测序相结合的方法对我院500例HBsAg阳性患者(其中HCC患者150例)的HBV DNA进行分型,并对分型结果进行分析.结果 HBV DNA B型和C型基因型是HBsAg阳性HCC患者和非HCC患者的共同优势基因型.但HCC患者中C型基因型所占比例为65.33%(98/150),明显高于非HCC患者的25.14%(88/350),而B型则相反,分别为28.67%(43/150)与68.86%(241/350),x2=75.45,P<0.05.HCC患者中,HBV的B型与C型基因型分布在不同性别及不同年龄段之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论 HBV DNA C型基因型在HCC患者中多见,可能与HCC的发生有关.     

原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒基因整合状态研究

目的：探讨原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC)与肝硬化（liver cirrhosis,LC)组织中乙型肝炎病毒（HBV）基因各片段的整合情况。方法：采用PCR与Southern杂交技术检测HCC与LC各35例肝组织标本DNA中是否存在HBV基因的整合。结果：HCC组中HBV DNA阳性率为94％（33/35), 其中X片段阳性率为92％（32／35）；HBV DNA整合率为69％（24／35），其中X片段整合率为69％（24／35），LC组中HBV DNA阳性率为94％（33／35），其中X片段阳性率为84％（29／35）；HBV DNA整合率为60％（21／35），其中X片段整合率为40％（14／35）。两组在X片段整合率上存在统计学差异（P＜0．05）。结论：HBV基因的整合在肝硬化与肝癌中是一个普遍的现象。HBV基因的整合是癌变的早期事件。HBV基因中的X片段的整合与HCC关系密切。     

pTRE-2hyg-HBX质粒的构建和初步表达鉴定

目的:构建含HBV(hepatitis B virus)X基因的真核表达载体pTRE-2hyg-HBX,从而建立Tet-On表达系统,研究HBX基因与慢性肝炎和原发性肝细胞肝癌(HCC)的发生和发展的关系.方法:用PCR方法扩增含MIuI和SalI内切酶位点的X基因序列全长,对pTRE-2hyg载体和X基因的PCR产物进行双酶切(MIuI和SALI内切酶),将两者连接,转化大肠杆菌DH5α并提取转化子pTRE-2hyg-HBX,对其进行测序及其RT-PCR功能学检测.结果:已构建的pTRE-2hyg-HBX经测序包含有完整的X基因的片段并能表达.结论:构建成功pTRE-2Ehyg-HBX载体,可用于和pTET质粒共转化细胞系建立可调控的Tet-On表达系统,用于研究X基因与慢性肝炎和原发性肝细胞肝癌的发生和发展的关系.     

乙型肝炎病毒X蛋白与肝细胞癌

乙型肝炎病毒(HBV)是双股环状DNA病毒,包括S/preS、C/preC、P和X4个编码基因.X基因是HBV四个开放读码框中最小的一个,其编码的HBx蛋白分子量为17kDa,由154个氨基酸组成.HBV持续感染与肝细胞癌(HCC)的发生密切相关,HBV-DNA可能以片断性整合的方式存在于肝癌细胞染色体上,其中以HBV X基因的整合为主[1].转基因小鼠实验证明X基因的转入可使小鼠产生肝癌[2].HBV编码的x蛋白(HBx)在HCC的发生过程中起非常重要的作用.本文综述了近年有关HBx对相关基因转录的反式激活作用,对肝细胞DNA损伤修复及细胞凋亡、细胞周期调控、端粒酶活性的影响,HBx对肝细胞的恶性转化作用及针对HBx基因的基因治疗等研究进展.     

肿瘤睾丸抗原CT10基因mRNA在肝细胞肝癌中的表达及HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的检测CT10基因mRNA在肝细胞肝癌 (HCC)中的表达情况 ,了解肿瘤睾丸抗原CT10基因mRNA在HCC中的表达是否具有肿瘤特异性 ;对CT10HLA A2限制性CTL表位进行预测。方法用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法对 45例HCC患者癌组织和相应癌旁组织的CT10基因mRNA表达情况进行了检测 ,对其中 3例RT PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定 ;利用超基序法和量化基序法联合预测CT10HLA A2限制性CTL表位。结果 45例HCC患者中 ,19例表达CT10mRNA ,阳性率为 42 % ,相应的癌旁组织中结果均显示阴性 ;3例DNA测序结果表明RT PCR产物确为CT10cDNA。CT10的表达与年龄、性别、肿瘤体积、分化程度、血清甲胎球蛋白 (AFP)水平、HBV和HCV感染无显著相关性 (P >0 0 5 ) ;预测发现 9个HLA A2限制性CTL表位。结论CT10在HCC中呈高比例、特异性表达 ,可望成为HCC免疫治疗的理想靶位。     

原发性肝癌患者血清HBV DNA含量的测定

HBV感染与肝细胞癌的发生密切相关,血清HBV DNA是HBV复制活动最直接和可靠的标志,可以反映病变活动程度及不同临床演变过程。本文采用免疫荧光定量PCR检测186例原发性肝癌患者的血清HBV DNA含量,综合分析其与HBV血清学标志物的关系,并比较HCC肝炎活动期与静止期患者血清HBV DNA水平及与血清甲胎蛋白（AFP）的关系,为HCC的发病机制、诊断及治疗提供理论依据。     

中国北方肝细胞癌与乙肝病毒感染的紧密关联性

目的确立乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)及丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)感染在中国北方肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生中的病因学地位。方法采用Abbott AxSym系统检测119例连续系列中国北方地区HCC病例的血清HBV、HCV标志，对血清HBV标志阴性病例，采用免疫组化、巢式PCR和DNA测序等对HBVX基因进行鉴定。结果119例HCC中，血清HBsAg阳性率为82．4％(98／119)；anti-HBc阳性率为94．1％(112／119)；4例血清HBsAg及anti-HBc均阴性病例中，3例HBVX基因阳性，因而HBV感染的阳性率达99．2％(118／119)。本组anti-HCV阳性率11．8％(14／119)，且均伴有HBV感染标志。结论中国北方地区HCC与HBV感染具有紧密关联性，是本地区HCC发生的主导病因。HCV感染是一个HOC发生的重要辅助因素。     

HBVx在肝细胞癌中的研究进展

肝细胞癌（HCC）的发生和发展与HBVX蛋白（HBx）的多种生物学功能密切相关,但HBV与原发性肝癌之间的特异关系仍未完全阐明,HBV慢性感染肝细胞的过程为HBV DNA整合于肝细胞DNA之中[1-2],如果其DNA整合在肝细胞DNA的原癌基因附近,可导致这些原癌基因的激活[3].因此,HBx及其编码基因的研究可揭示HCC发生和发展的机制.通过分析病毒基因组转化活性和病毒DNA推测,病毒DNA自身具有病毒癌基因,并且发现其产物x蛋白或HBx Ag具有反式激活功能.随着HBVx基因（HBx）研究的不断深入,同时还发现其可与抑癌基因产物P蛋白相互作用[4-5].HBx基因及其产物在原发性肝癌发生过程中起着十分重要的作用[6-7].对HBx的全面了解,将有助于对HBV致癌机理的认识.     

慢性乙型肝炎患者肝细胞HBV cccDNA、tDNA及HBV表面标志物的相关性研究

目的 回顾性分析慢性HBV感染者肝细胞内HBV ccc DNA含量与肝细胞tDNA、HBsAg、HBcAg的关系以及临床意义.方法 应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测未经抗病毒治疗的患者58例(未抗病毒组)、经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者4例(抗病毒组)的肝细胞HBV ccc DNA和tDNA含量,应用免疫组化法定性检测肝组织内HBsAg和HBcAg表达,用SPSS 13.0软件统计分析肝细胞HBV ccc DNA含量、tDNA、HBsAg、HBcAg间的关系.结果 肝细胞HBV ccc DNA、HBV tDNA含量与HBsAg、HBcAg在肝细胞中的表达模式间差异无统计学意义(P> 0.05).肝细胞内HBV cccDNA含量与HBV tDNA含量呈高度正相关(P<0.01).慢性乙型肝炎抗病毒治疗患者中,疗程> 2年并达到<病毒性肝炎防治方案>停药标准,肝细胞内ccc DNA、tDNA含量较未抗病毒组显著降低,但肝细胞内仍然可以检出HBV ccc DNA、tDNA.结论 肝细胞HBV ccc DNA含量与HBsAg、HBcAg在肝细胞的表达模式间无一定规律性.核苷(酸)类似物抗病毒治疗 2~3年并不能完全清除肝细胞内HBV ccc DNA.     

肝癌患者术前HBV DNA定量水平与肝移植术后肝癌复发关系的探讨

目的 探讨肝癌肝移植患者术前乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA定量与肝移植术后原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)复发的关系.方法 回顾性分析2004年1月到2008年12月因同时合并HCC和HBV行肝移植手术并长期随访的148例患者,使用Kaplan-Meier生存分析统计患者生存率和无瘤生存率,根掘术后HCC是否复发将患者分成HCC复发组(43例)及未复发组(105例),使用COX多因素回归进行危险因素分析.结果 148例HCC肝移植患者1、3、5年生存率分别为86%,72%,72%,无瘤生存率分别为79%,71%,54%.肝移植术后HCC复发43例,复发率为29.1%(43/148),术后HCC平均复发时间为(13.16±14.17)个月(1～54个月).COX多因素回归分析表明超过米兰标准(HR=9.89;95%CI2.30～42.52;P=0.002)以及术前HBV DNA＞5log10 copies/ml(HR=2.26;95%CI1.01～5.04;P=0.047)是肝移植术后HCC复发的独立危险因素.结论 肝移植术前HBV DNA＞5log10 copies/ml和超过米兰标准是原发性肝癌患者肝移植术后HCC复发的高危因素.     

乙肝病毒与肝癌的发生

关于乙肝患者中HBV如何引起肝细胞的癌性变化,其机制还不清楚,可能是由于多种因素综合作用的结果。过去十年中,在这个领域开展了很多研究,研究结果认为,HBV DNA与宿主细胞基因的整合、病毒基因的表达、HBx的转录激活作用、病毒基因序列的变化,甚至是病毒感染引起的慢性炎症,都可能在肝细胞性肝癌(HCC)的发生中发挥作用[1,2]。1HBV感染与HCC发生的流行病学研究几项流行病学研究表明,在全球范围内,除了极少例外,慢性HBV感染区与HCC发生区有极大的相似之处[1,3],在低HBV感染的区域HCC的发病率也比较低[4,5]。还有另外一个证据支持…     

人类XRCC1-399单核苷酸多态性与原发性肝细胞癌的相关研究

目的以病例-对照研究方式探讨人类DNA修复基因XRCC1-399单核苷酸多态性(SNP)与HBV感染者的原发性肝细胞癌(HCC)的发生关系.方法72例HCC患者经病理检查证实,根据地缘、性别、年龄,按1:1～2比例匹配137例非HCC对照者.采用聚合酶链反应-限制片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测受试者XRCC1-399位SNP.结果(1)XRCC1-399SNP和年龄均与HCC的发生无关,但在XRCC1-399Arg/Arg受试者中,HCC的发生与年龄呈负相关(P=0.028);(2)HBV感染是HCC发生的肯定因素(P=0.007);在XRCC1-399Gln/Gln或Arg/Gln受试者中,伴HBV感染者HCC发生率(25.7%)远高于不伴HBV感染者(5.3%,P=0.047);(3)XRCC1-399Arg/Arg受试者HBV感染率与Gln/Gln或Arg/Gln受试者近似(36.6%对38.0%,P=0.052).结论(1)XRCC1-399Arg/Arg可能具有潜在抵抗HCC发生的作用;(2)XRCC1-399Gln/Gln或Arg/Gln联合HBV感染是HCC发生的高危因素.     

肿瘤-睾丸抗原SSX1基因mRNA在肝细胞肝癌中的表达

目的：检测肿瘤－睾丸抗原SSX1基因mRNA在肝细胞肝癌（HCC）中的表达情况。方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）对47例HCC患者的癌组织和相应癌旁组织以及15例肝硬化和15例正常肝组织的SSX1基因mRNA表达情况进行检测，随机选择4例RT－PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定。结果：47例HCC患者中，39例表达SSX1 mRNA，阳性率为83％，相应的癌旁组织中有3例为弱阳性，其中2例患者获得了离癌灶更远处的活检组织，对其进行RT－PCR检测，结果显示阴性；所测的15例肝化和15例正常肝组织均未检测到SSX1的表达。4例DNA测序结果表明RT－PCR产物确为SSX1 cDNA。SSX1的表达与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、血清甲胎蛋白（AFP）水平、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染无显著相关性（P＞0．05）。结论：SSX1在HCC中呈高比例、高特异表达，可望成为HCC免疫治疗的理想靶位。     

肝细胞癌与乙肝病毒基因整合和p16基因表达的相关性研究

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合与p16的关系及其在肝细胞癌发生发展中的作用。方法：聚合酶链式反应（PCR）检测35例肝癌、癌旁组织及31例肝硬化组织中HBV DNA及其整合情况，以Southern blot证实；逆转录－聚合酶链式（RT－PCR）检测组织中p16 mRNA。结果：有HBV DNA整合的肝癌、癌旁及肝硬化组织中X基因整合分别为100．0％、81．8％及68．4％，三者差异有显著性（P＜0．05）；p16 mRNA的表达缺失率分别为51．4％、31．4％、22．6％，三者差异有显著性（P＜0．05）。结论：HBV DNA整合与p16基因表达改变有相关性，两 者在肝癌的发生发展中发挥重要作用。     

肝细胞癌患者血浆FHIT、SLIT2基因启动子甲基化的检测及意义

目的 探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者外周血浆中FHIT和SLIT2基因启动子甲基化状态及其临床意义.方法 应用甲基化特异性PCR(MSP)检测36例HCC患者血浆及10例健康对照者血浆中FHIT和SLIT2的基因启动子甲基化状态,并分析其与临床参数的关系.结果 36例 HCC患者外周血浆中FHIT和SLIT2的基因启动子甲基化率分别为50.0%(18/36)和27.8%(10/36);10例健康对照者血浆中均未检出基因甲基化改变.外周血浆中FHIT和SLIT2基因甲基化发生率与性别、年龄、HBV感染、肝硬化、肿瘤大小、甲胎蛋白(AFP)水平、肿瘤病理分级及临床分期、有无癌栓及是否为复发病例之间无统计学相关性.联合AFP和血浆中FHIT和SLIT2基因甲基化检测诊断HCC敏感性达86.1%,高于单独应用AFP检测的诊断敏感性(61.1%)(P＜0.05,χ2=5.79).结论 HCC患者外周血浆中可检测到FHIT、SLIT2基因甲基化改变,与临床参数无相关性.联合AFP及血浆DNA甲基化检测可提高HCC的诊断敏感性.     

肝门部胆管癌组织内乙型肝炎病毒基因整合位点的研究

目的 探索肝门部胆管癌组织内有无乙型肝炎病毒(HBV)基因的整合,并鉴定其在细胞染色体上的整合位点.方法 收集10例肝门部胆管癌新鲜组织标本,并以同期1例因十二指肠乳头癌而行胰十二指肠切除术患者的正常肝门部胆管组织标本作为对照.抽提组织DNA,采用HBV-Alu-PCR方法扩增HBV X基因及其侧翼的人基因组片段.PCR产物经序列测定后,应用序列分析软件分析比较HBV X基因序列,对其上、下游序列进行Entrez BLAST和NCBI MapViewer分析,确定HBV整合在染色体上的精确位置.结果 10例肝门部胆管癌组织中,有5例可检测到HBV整合片段,共获得6个整合位点.序列分析发现HBV X基因均以截断形式插入到宿主细胞基因组,其中CpG结合蛋白基因上游被HBV重复整合,与肿瘤发生密切相关的p53基因亦被HBV整合.结论 肝门部胆管癌组织内有较高的HBV整合率,HBV常整合在与肿瘤发生相关的基因中,HBV感染与肝门部胆管癌发生有关.

Abstract：

Objectives To study the phenomena of hepatitis B virus (HBV) integration into the tissues of hilar cholangiocarcinoma (HCCA) and to identify the integration sites in the host genome.Methods Ten fresh HCCA samples were collected from the tissues by surgical ablation, 1 normal hilar bile duct sample selected as control.Cellular DNA were extracted by Wizard(R) SV Genomic DNA Purification System.PCR-derived assay(HBV-Alu-PCR) was employed to amplify the viral-host junctions which contain the HBV sequence and the adjacent cellular flanking sequences.The PCR products were purified and subjected to sequencing by ABI-3730XL Auto DNA Analyzer.The sequence analysis of viral-host junctions was performed by DNASIS(R) MAX 3.0 bioinformatics software.The insertion sites between viral and cellular sequences were identified through homology comparison using NCBI BLAST and MapViewer search.Results In 10 HCCA samples,5 were demonstrated to have HBV integration fragments with total 6 inserted sites identified.Sequence analysis from viral-host junction showed that HBV X gene inserted into host genome at random distribution with truncated fragments.HBV integration recurrently targeted the unknown region in upstream of CXXC finger protein-1 (CpG-binding protein) gene (4 cases).p53 tumor suppressor gene was also found at the integration site.Conclusions There is high integration rate of HBV DNA into cellular genome of HCCA.HBV integration is found frequently into or close to cancer-related genes.The findings demonstrat that HBV infection might have association with the pathogenesis of HCCA.     

克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体

目的探讨构建人骨形成蛋白2(human bone morphgenetic protein 2,hBMP 2)真核表达载体的方法.方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM T hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒.分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1( )真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1( )真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序.结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP 2扩增条带,重组质粒pGEM T-hBMP 2经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP 2条带和4.0 kbp的载体片断;pcDNA3.1 hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与Gene Bank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合.结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体.