缺氧微环境对胰腺癌细胞发生上皮向间叶转化的诱导作用

目的 探讨胰腺癌细胞在缺氧微环境中通过发生上皮向间叶转化(EMT)从而获得侵袭性表型的可能机制.方法 在缺氧微环境下培养胰腺癌细胞Pane-1、Transwell侵袭小室对比检测细胞在缺氧微环境下侵袭能力的变化情况.Western blot、免疫荧光检测缺氧对Panc-1细胞上皮细胞标记分子E-cadherin、间叶细胞标记分子vimentin表达的影响;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测缺氧对EMT诱导因子Snail表达的影响.将编码HIF-1α cDNA的真核表达载体pCD-NA 3.1-HIF-1α瞬时转染Panc-1细胞,Western blot检测HIF-1α对E-cadherin、vimentin表达的影响.结果 常氧组细胞每高倍镜视野穿透数为(84±3)个,缺氧组为(121±5)个,差异有统计学意义(P<0.01).Panc-1细胞在常氧、缺氧12 h、缺氧24 h、缺氧48 h条件下E-cadherin蛋白的相对值分别为(0.59±0.04、54.00±0.05、0.45±0.10、0.36±0.03);vimentin蛋白的相对值分别为:(0.36±0.05、0.41±0.04、0.48±0.06、0.58±0.05),缺氧同常氧组比较差异有统计学意义(P<0.05).缺氧微环境下Panc-1细胞Snail mRNA的表达量升高,在缺氧第3天后差异具有统计学意义(P<0.05).Panc-1细胞转染HIF-1α前后,E-cadherin蛋白的相对值分别为0.63±0.05、0.47±0.07;Vvi-mentin蛋白的相对值分别为0.47±0.07、0.32±0.04,转染前后差异有统计学意义(P<0.05).结论 缺氧微环境可能通过活化HIF-lα、Snail等转录因子,促进胰腺癌细胞发生上皮向间叶转化,产生侵袭性表型.     

低氧诱导因子-3α对胎盘滋养层细胞生长的影响

目的研究低氧诱导因子-3α(HIF-3α)对人绒毛膜滋养层细胞(HTR8/SVneo)生物学行为的影响。方法构建人HIF-3α过表达载体(pcDNA3.1-HIF-3α),并筛选HIF-3α抑制剂(HIF-3αsiRNA)最佳靶序列;用2.5μg的pcDNA3.1-HIF-3α质粒和75 pmol/L的HIF-3αsiRNA分别转染HTR8/SVneo细胞作为转染组,同时各自设立阴性转染组。采用EdU法和MTT法检测细胞增殖和细胞活力水平;用细胞流式法检测细胞凋亡水平;并用细胞培养小室(Transwell)法检测细胞浸润和迁移的能力。结果蛋白质印迹法(Western Blot)结果表明成功构建了过表达载体pcDNA3.1-HIF-3α,并筛选到HIF-3αsiRNA#2是最佳抑制靶序列(P<0.05)。EdU实验结果显示,过表达HIF-3α使细胞的增殖显著增强(P<0.05),敲低HIF-3α则使细胞的增殖显著下降(P<0.05)。MTT法检测发现,过表达HIF-3α后细胞活力无显著差异(P>0.05);敲低HIF-3α后细胞活力显著升高(P<0.05)。细胞流式法检测发现,HIF-3α过表达有降低HTR8/SVneo细胞早期凋亡的趋势,但无显著差异(P>0.05);HIF-3α敲低后细胞凋亡无显著差异(P>0.05)。Transwell小室法检测发现,HIF-3α过表达使细胞的迁移以及浸润显著增强(P<0.05),而HIF-3α敲低后细胞的迁移以及浸润显著下降(P<0.05)。结论HIF-3α是调节HTR8/SVneo细胞增殖、迁移和浸润能力的重要因子。     

缺氧通过抑制E-cadherin促进胰腺癌细胞侵袭的研究

目的 观察缺氧对胰腺癌细胞E-cadherin表达的抑制以及侵袭性生物学行为的影响,探讨E-cadherin表达抑制的调控机制.方法 分别在常氧和缺氧环境下培养胰腺癌细胞Pane-1,通过Western blot和TransweU技术对比观察E-cadherin表达的差异以及细胞侵袭能力的变化.体外转染表达HIF-α siRNA的真核表达载体pGenesil-1-HIF-1α以及对照载体,进一步检测沉默HIF-α之后,Pane-1细胞E-cadherin和细胞侵袭能力的变化.结果 缺氧可以抑制Pane-1细胞E-cadherin的表达,并增强其在体外的侵袭能力.而通过RNAi技术沉默了HIF-α之后,则町以部分恢复缺氧微环境对Pane-1细胞E-cadherin表达的抑制,同时降低其在体外的侵袭能力.结论 缺氧微环境中HIF-α的活化可抑制E-cadherin的表达并加强胰腺癌细胞侵袭能力.     

长链非编码RNA HOST2对胰腺癌细胞增殖迁移和侵袭的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)HOST2对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法:qRT-PCR检测正常胰腺上皮细胞系HPDE6-C7及胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3、HPAC中lncRNAHOST2表达水平。将Panc-1细胞分别转染siRNA-HOST2(si-HOST2组)和阴性对照序列(阴性对照组)后,用MTT法测定细胞增殖,细胞划痕和Transwell实验测定细胞迁移和侵袭,Westernblot测定上皮-间质转化(EMT)相关蛋白vimentin、Snail、Twist的表达。以无转染的Panc-1细胞为空白对照组。结果:与正常胰腺上皮细胞HPDE6-C7相比,lncRNAHOST2在各胰腺癌细胞系中的表达均明显上调(均P0.05)。与空白对照组比较,si-HOST2组细胞增殖、迁移和侵袭能力均明显减弱,vimentin、Twist1、Snail蛋白相对表达量均明显下调(均P0.05),而阴性对照组上述指标均无明显变化(均P0.05)。结论:lncRNAHOST2在胰腺癌细胞中高表达,且与胰腺癌增殖、迁移和侵袭密切相关,其机制可能与调节EMT相关蛋白的表达有关。     

表没食子儿茶素没食子酸酯通过PI3K/Akt通路抑制胰腺癌细胞糖酵解的实验研究

目的：探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对胰腺癌细胞的增殖及糖代谢的影响。方法：用CCK8试剂盒检测不同浓度EGCG对胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响，用葡萄糖乳酸试剂盒检测EGCG对糖酵解的影响，Western blot法检测糖酵解酶及PI3K/Akt通路蛋白的表达。结果：CCK8结果显示，EGCG可以抑制PANC-1细胞的增殖，其抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性（P <0.05）。葡萄糖乳酸检测实验表明，EGCG可以抑制PANC-1细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成（P <0.05）。Western blot结果表明，EGCG可以抑制糖酵解酶己糖激酶-2(HK-2)、磷酸果糖激酶（PFK）和乳酸脱氢酶（LDH）及磷酸化PI3K和Akt的表达，且EGCG浓度越高，抑制作用越明显（P <0.05）。结论：EGCG抑制人胰腺癌细胞系PANC-1的增殖和糖酵解，其抑制作用可能与抑制PANC-1细胞中PI3K/Akt通路有关。     

体外共培养hBMSCs和HUVECs对Panc-1胰腺癌细胞上皮间质转化的影响

目的:利用三维共培养技术体外构建含多种细胞的胰腺癌微组织,研究骨髓间充质干细胞(hBMSCs)、内皮细胞(HUVECs)对Panc-1胰腺癌细胞上皮间质转化的影响。方法:水凝胶复合细胞培养构建三维胰腺癌微组织模型。第一组:单纯Panc-1细胞;第二组:Panc-1细胞复合HUVECs;第三组:Panc-1细胞复合hBMSCs;第四组:Panc-1细胞复合HUVECs和hBMSCs。实时定量PCR分析胰腺癌肿瘤侵袭相关的基质金属蛋白酶(MMP-9)、肿瘤上皮间质化E-cadherin和Snail基因。Western blot测定胰腺癌肿瘤侵袭相关的MMP-9、肿瘤上皮间质化E-cadherin和Snail蛋白。结果:HUVECs共培养不影响MMP-9、E-cadherin和Snail基因和蛋白的表达(P>0.05),hBMSCs共培养促进MMP-9和Snail基因和蛋白的表达、抑制E-cadherin基因和蛋白的表达(P<0.05),同时加入两种细胞促进MMP-9和Snail基因和蛋白的表达、抑制E-cadherin基因和蛋白的表达(P<0.05)。结论:利用水凝胶为载体,加入骨髓间充质干细胞、内皮细胞与Panc-1胰腺癌细胞共培养,成功构建复杂的胰腺癌肿瘤微组织。通过对胰腺癌上皮间质转化相关机制研究,发现骨髓间充质干细胞通过调节MMP-9和上皮间质化对胰腺癌的侵袭行为起重要作用。     

他莫西芬对甲状腺乳头状癌的抑制作用

目的:探讨他莫西芬对人甲状腺乳头状癌BCPAP细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:不同浓度的他莫西芬作用于人甲状腺乳头状癌BCPAP细胞24 h后,采用CCK8法观察不用浓度他莫西芬对BCPAP细胞增殖的影响;将实验分为阴性对照组、10μmol/L他莫西芬组和20μmol/L他莫西芬组,划痕修复实验检验他莫西芬对其迁移能力的影响,Transwell小室实验检验他莫西芬对其侵袭能力的影响。Western blot检测各组bcl-2和C-myc的蛋白表达水平。结果:CCK8实验、划痕修复实验和Transwell小室实验结果显示他莫西芬能明显抑制BCPAP细胞的增殖、迁移和侵袭能力,且呈现浓度依赖性(P0.05);Western blot结果显示,他莫西芬下调凋亡相关蛋白bcl-2与C-myc表达水平。结论:他莫西芬抑制甲状腺乳头状癌BCPAP细胞的增殖、迁移和侵袭,增殖抑制作用可能与下调凋亡相关蛋白bcl-2和C-myc表达水平有关     

反义缺氧诱导因子-1α对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响

目的： 观察反义缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响。方法：实验分组：（1）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为缺氧对照组；（2）常氧条件下体外培养，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3 细胞设为常氧对照组；（3）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，稳定转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为实验组。采用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)和免疫印迹(Western Blot)检测各组的HIF-1α和survivin表达情况。 流式细胞术和MTT比色法检测不同剂量的化疗药物(5-氟尿嘧啶、阿霉素、吉西他宾)对各组的凋亡率和生长抑制率的影响。 结果：实验组HIF-1α和survivin的表达明显降低 (P<0.05)，与对照组相比，实验组的凋亡率、抑制率与剂量成正比，高剂量引起高抑制(P<0.05)。 结论：反义HIF-1α可能通过阻断survivin的表达而增强胰腺癌对化疗的敏感性。据此可望通过阻断HIF-1α的表达为胰腺癌基因治疗提供一种新途径。     

缺氧下调结肠癌细胞株CDX2表达的研究

目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和基因系尾型同源盒基因2(CDX2)在人结肠癌细胞株SW480和LS174T不同缺氧时间的表达及其可能的作用机制。方法(1)MTT方法检测在不同CoCl2浓度(100,150,200μmol/L)下和不同时点(24,36,48 h)时对SW480和LS174T细胞活力以及增殖的影响,筛选适宜的CoCl2作用浓度。(2)在细胞化学缺氧培养相应时段,采用半定量RT-PCR技术检测HIF-1α,Snail和CDX2的mRNA的表达变化;同时采用Western blotting技术检测CDX2的蛋白表达。结果结肠癌细胞株在不同浓度CoCl2环境下随缺氧时间的延长,细胞活力明显受到抑制。在低浓度CoCl2(100μmol/L)干预下,随着缺氧时间的延长,HIF-1α和Snail mRNA表达逐渐上升,缺氧24 h时达到高峰,CDX2 mRNA及蛋白表达水平逐渐下降。结论缺氧诱导HIF-1α过表达可通过下调CDX2而加速结直肠癌的进展。     

反义缺氧诱导因子-1α对胰腺癌生长转移的影响

目的观察反义缺氧诱导因子（HIF）-1α对胰腺癌生长、转移的影响及其与β1-integrin的关系。方法缺氧条件下（0.5％O2）体外培养4h，未转染反义HIF-1α质粒的BxPc-3细胞设为缺氧对照组；常氧条件下体外培养，未转染反义HIF-1α质粒的BxPc-3细胞设为常氧对照组；缺氧条件下（0．5％O2）体外培养4h，稳定转染反义HIF-1α质粒的BxPc-3细胞设为实验组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测HIF-1α和β1-integrin的表达情况。Transwell侵袭室方法检测BxPc-3细胞侵袭能力。裸鼠皮下接种BxPc-3细胞8周后，观察各组肿瘤生长情况。结果实验组HIF-1α和β1-integrin的表达明显降低，迁移的细胞数远少于对照组（P〈0．05）；实验组肿瘤的体积、重量、生长速度远低于对照组（P〈0.05）。结论反义HIF-1α可能通过阻断β1-integrin的表达而抑制胰腺癌的生长和转移。因此，阻断HIF-1α的表达为胰腺癌基因治疗提供了新途径。     

微环境乏氧上调胰腺癌细胞HIF-1α表达并诱导凋亡

目的 探讨CoCl2诱导缺氧对体外培养的胰腺癌PC-2细胞缺氧诱导因子-1(HIF-1α)表达变化及诱导凋亡作用.方法 以50、100、150、200μmol/L不同浓度CoCl2处理PC-2细胞模拟肿瘤体内乏氧模型,MTT法检测不同浓度、不同时间CoCl2处理后的PC-2细胞生长情况;透射电镜下观察乏氧微环境作用下的PC-2细胞超微结构的改变;免疫细胞化学和RT-PCR方法 检测乏氧微环境对PC-2细胞HIF-1α基因表达的影响;AnnexinV-FITC/PI双标记染色,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况.结果 不同浓度CoCl2对胰腺癌PC-2细胞生长曲线有不同程度的改变,对数生长期和平台期提前,对数期缩短.随着CoCl2浓度增加,曲线越趋于低平.透射电镜下可见线粒体肿胀,染色质边集等凋亡早期表现,少见凋亡小体.免疫细胞化学和RT-PCR结果 显示,化学缺氧剂COCl2模拟的乏氧微环境可引起胰腺癌PC-2细胞HIF-1α表达的上调;流式细胞仪检测结果 显示,正常对照组、100、150、200 μmol/L CoCl2不同浓度组PC-2细胞凋亡率分别为10.77%、34.32%、40.17%和52.30%.结论 CoCl2对胰腺癌PC-2细胞具有一定的凋亡诱导作用,同时也缩短了细胞正常的生长期,细胞形态发生相应改变,可能与上调HIF-1α的表达有关.     

HIF-1α与EMT在肿瘤中的作用及意义研究进展

缺氧诱导因子1α(HIF-1α)通过调节不同靶基因的转录活性及其自身的表达,参与肿瘤的增殖凋亡与侵袭转移等过程,其过度表达与恶性肿瘤的不良预后有关。上皮/间质转化(EMT)在肿瘤的侵袭和转移过程中起着非常重要的作用,其机制涉及复杂的信号通路、E-钙黏蛋白、Snail转录因子和microRNA等。本文就两者在肿瘤中的作用及意义做一综述。     

Selective inhibition of endothelin receptor A as an anti-angiogenic and anti-proliferative strategy for human pancreatic cancer

Endothelin-1 (ET-1) plays a major role in tumor proliferation and angiogenesis of various types of cancer acting through endothelin receptors A and B (ETRA and ETRB). The aim of this study was to analyze theET-1/ETRsystem inhumanpancreatic cancer cell linesandto evaluate the effect of a selective endothelin A inhibitor in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model. Three different human pancreatic cancer cell lines, MiaPaCa-2, AsPC-1, and Panc-1, were studied. We found that proliferation of human pancreatic carcinoma cells expressing ETRA was significantly reduced with a selective antagonist. Hypoxic conditions led to improved results compared to a normoxic environment (MiaPaCa-2: -53% vs. -18%; AsPC-1: -54% vs. -46%). Proliferation of ETRA negative Panc-1 cells was not decreased. In vivo, the selective ETRA inhibition resulted in reduced angiogenesis as measured by lower microvessel densities (MiaPaCa-2: -47%; AsPC-1: -55%). The blockade of ETRA decreased the volume (MiaPaCa-2: -87%; AsPC-1: -28%) and metastatic spread (MiaPaCa-2: -95.5%; AsPC-1: -27%) of receptorpositive tumors, thereby increasing survival in experimental pancreatic cancer. ETRA blockade did not show an effect on ETRA negative Panc-1 tumors. Therefore, targeting ETRA with a selective antagonist might provide a new approach to reducing proliferation and angiogenesis in human pancreatic cancer. Presented in part at the Forty-Fourth Annual Meeting of The Society for Surgery of the Alimentary Tract, Orlando, Florida, May 18–21, 2003. This work was supported by the R.S. Hirshberg Foundation and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant HO 1843/2-1).     

萝卜硫素通过Traf6/TAK1通路调节肾小管上皮细胞间充质转分化

目的探讨萝卜硫素对脂多糖(LPS)诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)间充质转分化的影响及其对Traf6/TAK1信号通路活化的作用。方法体外培养HK-2细胞,并将其分为正常组、LPS诱导组(100 ng/mL)、LPS+萝卜硫素低剂量组(10μmol/L)、LPS+萝卜硫素中剂量组(20μmol/L)、LPS+萝卜硫素高剂量组(40μmol/L)。培养12、24、48 h后,采用CCK8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测细胞上清中IL-6、IL-1β及TNF-α含量,Western blot方法检测E-cadherin、α-SMA、Traf6、TAK1及p-TAK1蛋白的表达量。结果LPS诱导组相对于正常组HK-2细胞增殖能力、炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)水平、蛋白(α-SMA、Traf6及p-TAK1)表达量均升高,而E-cadherin蛋白表达水平降低;然而不同浓度萝卜硫素处理细胞后细胞增殖能力、炎症因子分泌量、蛋白(α-SMA、Traf6及p-TAK1)表达量均降低,E-cadherin蛋白表达水平升高,表现一定剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。结论萝卜硫素能够抑制LPS诱导的HK-2细胞增殖能力及炎症因子的产生,发挥抑制肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转变的纤维化过程,其机制可能与抑制Traf6/TAK1信号通路活化有关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白通过活化stat3通路促进肝癌细胞上皮间质转化的研究

目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白（HCVc）对肝癌细胞信号转导子和转录激活子3（stat3）通路及上皮间质转化（EMT）的影响。 方法将含HCVc基因序列的重组质粒pEGFP-N3-HCVc转染人肝癌细胞HepG2,Real-Time PCR和Western blotting检测HCVc、总stat3、磷酸化stat3（p-stat3）及EMT指标蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail的表达,划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况。 结果划痕实验及Transwell实验结果显示,过表达HCVc可增强HepG2细胞的迁移和侵袭能力;stat3通路抑制剂AG490处理可抑制HepG2细胞的侵袭能力。RT-PCR和Western blotting结果显示,过表达HCVc后,HepG2细胞中p-stat3、Vimentin及Snail在表达升高,E-cadherin表达下降;AG490处理可下调p-stat3、Vimentin及Snail表达,增强E-cadherin表达。 结论HCVc可活化stat3通路促进肝癌细胞上皮间质转化,增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力。