人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞生物学活性的研究

目的:体外原代培养人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,并对其生物学活性作初步探讨.方法:采用组织块法原代培养牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,绘制生长曲线,测定二者碱性磷酸酶活性;流式细胞术和免疫组化染色法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原、骨形成蛋白的表达情况,观察对比两种细胞的生物学特性的异同.结果:牙龈成纤维细胞原代培养成功率及细胞增殖活性明显高于牙周膜细胞.在牙周膜细胞中,Ⅰ、Ⅲ型胶原均为阳性表达,棕黄色颗粒克满整个胞浆内.在牙龈成纤维细胞中Ⅰ型胶原为弱阳性表达,Ⅲ型胶原阳性表达更弱.牙周膜细胞的ALP水平明显高于牙龈成纤维细胞.牙周膜细胞BMP2表达为强阳性,而牙龈成纤维细胞表达弱阳性.结论:牙周膜细胞具有较强的成骨能力,是理想的牙周组织工程的种子细胞.牙龈成纤维细胞易于培养成活,增殖力强,具有牙周膜细胞的一些特点,组织取材方便,也可作为牙周组织工程的种子细胞.     

体外培养人牙周膜成纤维细胞及其成骨表型特征检测

目的　探讨牙周膜成纤维细胞作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法　采用酶消化法体外培养人牙周膜成纤维细胞 ,以人胎儿皮肤成纤维细胞为对照检测细胞碱性磷酸酶表达及矿化能力。结果　体外培养人牙周膜成纤维细胞与人胎儿皮肤成纤维细胞相比表达更高水平的碱性磷酸酶 (P <0 .0 5 ) ,矿化诱导液连续培养 30d均可观察到矿化结节形成。结论　采用酶消化法可快速简便地获取原代人牙周膜成纤维细胞。体外培养牙周膜成纤维细胞具有成骨样细胞表型特征 ,与人胎儿皮肤成纤维细胞相比更具分化潜能 ,可作为牙周组织工程种子细胞来源     

血管内皮细胞对牙周组织细胞增殖的影响

目的：通过血管内皮细胞与牙周组织细胞复合培养模拟牙周组织再生环境,观察血管内皮细胞对牙周组织细胞增殖的作用规律,探讨血管内皮细胞对牙周组织修复再生的影响。方法：应用原代培养的血管内皮细胞,在Transwell嵌套中实现与人牙周膜成纤维细胞、牙龈成纤维细胞间的复合培养,分别于复合培养第2、4、6、8和10天,以细胞计数手段检测血管内皮细胞共存条件下2种牙周组织细胞的增殖情况,并与单独培养的2种牙周组织细胞作为对照,采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果：在血管内皮细胞存在条件下,2种牙周组织细胞的增殖速率均显著高于单独培养条件。血管内皮细胞存在时,牙周膜成纤维细胞增殖速率逐渐超越牙龈成纤维细胞(第6天起),并在第8天细胞数量上超过牙龈成纤维细胞,差异具有显著性(P<0.01)。结论：血管内皮细胞的存在,对牙周组织细胞的增殖具有促进作用,对牙周膜成纤维细胞增殖的促进作用显著高于牙龈成纤维细胞。     

人牙龈成纤维细胞原代培养方法的比较研究

目的：建立和评价人牙龈成纤维细胞原代培养方法,并观察其生物学特性。方法：分别用组织块法、2种改良酶消组织块法培养人牙龈成纤维细胞（HGF）,用形态学、免疫荧光鉴定细胞来源。通过活细胞观察,MTT比色实验研究细胞体外生物特性。比较3种培养方法培养HGF的效果。结果：细胞抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性,符合人牙龈成纤维细胞的形态学特征和生物学特性。组织块法、改良酶消组织块法（翻瓶法）、改良酶消组织块法（盖玻片法）的细胞培养成功率分别为26.7%、54%、60%。组织块法和2种改良酶消组织块法间的成功率差异有显著性（P〈0.01）,2种改良酶消组织块法间的成功率差异无显著性（P〉0.05）。结论：本实验建立的细胞系为人牙龈成纤维细胞。2种改良酶消化组织块法可显著提高人牙龈成纤维细胞原代培养成功率。     

血管内皮细胞对牙周组织细胞迁移的影响

目的: 通过血管内皮细胞与牙周组织细胞的复合培养模拟牙周组织再生环境, 研究血管内皮细胞对牙周组织细胞迁移的影响, 为明确血管内皮细胞在牙周组织再生过程中的作用奠定基础。方法: 应用原代培养的血管内皮细胞, 在Transwell嵌套中实现与人牙周膜成纤维细胞、牙龈成纤维细胞间的复合培养。分别以Transwell嵌套滤膜下腔面24 h的细胞数量检测垂直迁移能力, 以划痕实验后0、8、16和24 h计数划痕区域的细胞数量检测水平迁移能力, 以玻片试验及计算机辅助图像处理软件计算实验第1、4和7天细胞覆盖创面的面积检测覆盖创面能力, 并均与单独培养的2种牙周组织细胞作为对照。采用SPSS13.0软件包对实验结果进行统计学分析。结果: 血管内皮细胞存在时, 2种牙周细胞在垂直和水平方向的迁移量均显著高于单独培养组(P<0.01), 且牙周膜成纤维细胞垂直向的迁移量显著高于牙龈成纤维细胞(P<0.01), 但其水平迁移量在实验24 h时则显著低于牙龈成纤维细胞(P<0.01);在血管内皮细胞共存条件下, 2种牙周细胞创面覆盖能力在实验第7天高于对照组, 且牙周膜成纤维细胞的创面覆盖能力的增加显著高于牙龈成纤维细胞(P<0.01)。结论: 血管内皮细胞对牙周膜、牙龈成纤维细胞的迁移和创面覆盖有明显促进作用, 且血管内皮细胞对牙周膜成纤维细胞的垂直向迁移和创面覆盖能力的促进作用更为明显。     

人牙髓成纤维细胞等的体外培养、生长特性和鉴定

本实验从人恒牙分离牙髓组织,牙周组织和取鼠胚胎骨作体外培养。收集标本40个,培养出牙髓成纤维细胞7株,牙周膜成纤维细胞16个标本生长原代细胞8株,5个胚胎骨组织均生长7d以上。牙髓和牙周膜成纤维细胞形态典型,抗波形丝蛋白阳性。证明是中胚层来源的成纤维细胞,细胞生长曲线分裂指数显示细胞增殖正常,牙周膜细胞增长速度快于牙髓细胞。说明体外培养人牙髓和牙周膜细胞是可行的。     

体外培养人牙周牙髓相关细胞中釉原蛋白的表达

目的:观察釉原蛋白(amelogenin,Am)基因在体外培养的人牙龈上皮细胞及口腔外胚间充质来源细胞(人牙龈成纤维细胞、人牙周膜成纤维细胞和人牙髓细胞)中的表达.方法:采用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,检测培养细胞中釉原蛋白mRNA的表达.采用蛋白质免疫印迹技术检测培养细胞中釉原蛋白的表达.结果:培养的人牙周膜成纤维细胞、牙髓细胞、牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞中均未检测到釉原蛋白及其mRNA的表达.结论:体外培养的人牙周膜成纤维细胞、牙髓细胞、牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞不表达釉原蛋白基因.     

一种牙周细胞体外创面愈合模型的构建

目的:构建一种可用于牙周组织创面愈合规律研究的体外创面愈合模型,比较牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞覆盖体外创面的速度。方法:体外培养人牙周膜、牙龈成纤维细胞至玻片上各自形成单层融合。以机械方法刮除部分融合层细胞,构成25mm×7mm的无细胞区域,即牙周细胞体外创面。创面形成后继续于100mL/L胎牛血清环境下培养2、6、9d。玻片细胞固定后以结晶紫染色。以计算机辅助图像分析系统对创面特定区域采图,进行细胞覆盖面积定量和统计分析。结果:在所构建牙周细胞体外创面上牙龈成纤维细胞的覆盖速度高于牙周膜细胞。创面形成后第9天,牙龈成纤维细胞覆盖采图区域面积的百分比均数为62.26%,牙周膜细胞则为44.15%,差异有显著性(P<0.05)。结论:实验以细胞覆盖创面面积综合衡量细胞增殖和移动能力,在实验构建的牙周细胞体外创面模型上,牙龈成纤维细胞覆盖创面速度高于牙周膜细胞,能够体现两者在覆盖创面能力上的差异。实验构建的体外创面模型可用于牙周细胞创面愈合能力的研究,对探讨牙周组织创面愈合机制及其调控规律有所裨益。     

人牙龈和牙周韧带成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究——细胞形态、生长曲线及碱性磷酸酶活性测定

目的 :建立人牙龈和牙周韧带成纤维细胞体外培养模型并对其生物学特性作初步探讨。方法 :采用组织块法常规条件下分别进行牙龈和牙周韧带成纤维细胞的培养 ,通过光镜、透射电镜、生长曲线及碱性磷酸酶测定等手段对其部分生物学特性进行研究。结果 :两种培养的原代及传代细胞在光镜下细胞排列及结构无明显差别 ,传代培养时牙龈成纤维细胞有接触抑制现象 ,而牙周韧带成纤维细胞则可呈复层生长 ,牙周韧带成纤维细胞排列方向性较明显 ,生长曲线表明牙周韧带成纤维细胞增殖活性高于牙龈成纤维细胞 ;碱性磷酸酶活性测定及染色法显示两者有明显的差别。结论 :体外培养的两种细胞在形态及排列上相似 ,但在细胞亚型的组成上存在差异。     

人牙龈和牙周韧带成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究—细胞形态，生长曲线及碱性磷酸酶活性测定

目的：建立人牙龈和牙周韧带成纤维细胞体外培养模型并对其生物学特性作初步探讨。方法．；采用组织块法常规条件下分别进行牙龈和牙周韧带成纤维细胞的培养，通过光镜，透射电镜，生长曲线及碱性磷酸酶测定等手段对其部分生物学特性进行研究。结果：两种培养的原代及传代细胞在光镜下细胞排列及结构无明显判别，传代培养时牙龄纤维细胞有接触抑制现象，而牙周韧带成纤维细胞则可呈复层生长，牙周韧带成纤维细胞排列方向性较明显，生长曲线表明牙周韧带成纤维细胞增殖活性高于牙龄成纤维细胞；碱性磷酸酶活性测定及染色法显示两者有明显的判别。结论：体外培养的两种细胞在形态及排列上相似，但百细胞亚型的组成上存在差异。     

LPS刺激对体外培养人牙龈成纤维细胞环氧合酶表达的影响

目的检测脂多糖（LPS）刺激后体外培养人牙龈成纤维细胞环氧合酶-1和环氧合酶-2（COX-1,COX-2）表达的改变,探讨牙龈成纤维细胞与牙周炎症发生发展的关系。方法组织块法原代培养正常人牙龈成纤维细胞并进行来源鉴定,MTT法检测不同浓度LPS刺激后活细胞数量的改变;以10ug/ml刺激第4代细胞,24h后用免疫细胞化学方法检测COX-1和COX-2在细胞中的表达,多功能彩色细胞分析管理系统进行图像分析和统计学分析。结果 LPS刺激可使牙龈成纤维细胞的增殖速度降低,生长曲线大致呈＂S＂形;10ug/ml LPS刺激24h后细胞数量未见明显变化。免疫细胞化学染色结果显示COX-1在LPS刺激前后均有表达但无显著差异（P〉0.05）,COX-2在LPS刺激前无表达,LPS刺激后则表达增强并有显著差异（P〈0.01）。结论 LPS对牙龈成纤维细胞生长增殖有抑制作用,不影响COX-1的表达强度,但可使COX-2表达显著增强,说明牙龈成纤维细胞对LPS刺激的反应可能影响牙周炎症进展。     

人牙龈成纤维细胞和牙周膜成纤维细胞的培养和生物学特征

目的：探讨采用不同方法建立体外培养人牙龈成纤维细胞和人牙周膜成纤维细胞并对其生物学特性作初步探讨。方法：分别采用消化培养法和组织块培养人的牙龈和牙周膜成纤维细胞。通过倒置显微镜活体观察，以及光镜、透射电镜、免疫组化和生长曲线等方法对其生物学特性作初步观察。结果：消化培养法成功率低于组织块培养法。光镜下和透射电镜下观察两种细胞在形态和结构上相似。免疫组化染色证实此两种细胞均来源于中胚层的纤维母细胞。生长曲线表明牙龈成纤维细胞的倍增时间比牙周膜成纤维细胞稍短，而牙周膜成纤维细胞的增殖活性比牙龈成纤维细胞高。结论：组织块培养法适用于此二种细胞的培养。细胞生物学特征方面有许多相似形，提示这两种细胞来于同一个细胞群。     

EGFR在人牙龈成纤维细胞和牙周韧带细胞中表达的研究

成纤维细胞是人牙龈及牙周膜中的主要细胞类型 ,在维持牙龈组织的结构完整、牙周膜的更新、牙周组织损伤后的再生及牙周组织自身结构的稳定等方面具有重要作用。两种部位来源的成纤维细胞虽然形态相似 ,但功能上明显不同 ,目前尚无明确鉴定它们的细胞标记物。为此 ,我们研究了表皮生长因子受体 (ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ,ＥＧＦＲ)在人牙龈成纤维细胞 (ｇｉｎｇｉｖａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ,ＧＦ)和牙周韧带细胞 (ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｃｅｌｌ,ＰＤＬＣ)中的不同表达。一、材料与方…     

人牙周膜成纤维细胞体外培养的研究进展

人牙周膜成纤维细胞是牙周细胞生物学、药理学、毒理学和牙周组织工程学研究的基础,对口腔各个领域意义重大。由于受到牙周组织的解剖结构和取材数量的限制,牙周膜成纤维细胞的体外培养较为困难,因此本文就人牙周膜成纤维细胞的体外培养方法和应用等研究进展作一综述。     

糖基化终产物对牙龈成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原合成的影响

目的 观察糖基化终产物对牙龈成纤维细胞增殖能力和Ⅰ型胶原合成的影响,探讨糖基化终产物对牙周组织修复功能的作用及在伴有糖尿病牙周炎中的致病机制.方法 采用组织块法培养牙龈成纤维细胞,培养基中加入体外合成的不同浓度的糖基化终产物,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测在不同时间段下牙龈成纤维细胞增殖水平的变化,酶联免疫吸附测定法和实时定量反转录聚合酶链法(RT-PCR)分别测定牙龈成纤维细胞合成Ⅰ型胶原的量和表达Ⅰ型胶原mRNA的水平.结果 200 mg/L糖基化终产物作用于牙龈成纤维细胞48、74 h的A值分别为0.016±0.023、0.035±0.008,比其他组A值低(P＜0.05),并且细胞形态发生了改变,细胞由均一的梭形变成圆形、椭圆形、细长不规则条状等,胞质浓缩,细胞间隙增大;糖基化终产物作用72 h后,牙龈成纤维细胞上清液中和胞内Ⅰ型胶原的含量减少(P＜0.05),Ⅰ型胶原mRNA表达下调(P＜0.05).结论 糖基化终产物能抑制牙龈成纤维细胞的增殖、降低其合成Ⅰ型胶原蛋白和表达Ⅰ型胶原mRNA,从而可能削弱了牙周组织的愈合能力.     

尼古丁对人牙周膜成纤维细胞中Fas/Apo-1（CD95）表达的影响

目的：研究尼古丁（nicotine）对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）中Fas/Apo-1（CD95）表达的影响。方法：采用组织块培养法培养原代人牙周膜成纤维细胞并传代取处于对数生长期的第6代细胞用于实验,采用浓度为2mg/L的尼古丁处理第6代牙周膜成纤维细胞72h,通过免疫组织化学染色法检测尼古丁对人牙周膜成纤维细胞中Fas表达的情况。结果：证实尼古丁作用于人牙周膜成纤维细胞后,胞膜中Fas/Apo-1（CD95）抗原呈阳性表达。结论：提示尼古丁可通过Fas系统这一途径导致人牙周膜成纤维细胞的凋亡,从而加重牙周组织破坏的程度和影响牙周组织的再生。     

组织块法培养原代人PDLCs技术的新探讨

目的探讨组织块法培养原代人PDLCs生长情况和成功率,以及提高组织块法培养原代人PDLCs成功率的方法。方法采用组织块法培养原代人PDLCs。免疫组化ABC法进行波形丝蛋白（VIM）和细胞角蛋白（CK）的免疫组化染色．进行细胞来源鉴定。倒置显微镜下进行形态学观察,取第4代人PDLCs用MTT法绘制生长曲线。计算细胞培养成功率。结果组织块法培养原代人PDLCs成功率52．4％。波形丝蛋白染色阳性,细胞角蛋白染色阴性。细胞大多呈长梭形．胞体丰满,伸展良好,核仁清晰,细胞排列均匀,呈漩涡状,火焰状。生长曲线示细胞第3天开始进入对数生长期。结论本实验组织块法培养原代人PDLCs的成功率为52．4％,为人PDLCs作为种子细胞的牙周组织工程的研究．提供了实验基础和理论依据。     

牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞对白细胞介素8的趋化反应

目的评价牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞对白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）的趋化反应。方法将体外培养第6代的牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞（2.5×10     

Scleraxis在牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞中的表达

目的研究碱性螺旋-环-螺旋转录因子 Scleraxis 能否在人牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞、骨髓基质细胞中表达,及其与牙周韧带细胞分化能力的关系。方法体外培养人牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞和骨髓基质细胞,RT-PCR 法检测牙龈成纤维细胞、骨髓基质细胞及不同代次牙周韧带细胞中 Scleraxis 的表达。结果 Scleraxis 在牙周韧带细胞、骨髓基质细胞及牙龈成纤维细胞中的表达差异有统计学意义(P<0.05)。其 Scleraxis 与β-肌动蛋白吸光度比值分别为0.877±0.024,0.438±0.031,0.313±0.083。Scleraxis 在牙周韧带细胞中的表达最强,在牙龈成纤维细胞中表达最弱。牙周韧带细胞中 Scleraxis 的表达随培养代次的增加而减弱。结论 Scleraxis 可表达于体外培养的牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞和骨髓基质细胞,Scleraxis 可能在牙周韧带细胞的分化过程中起重要作用。     

人牙周膜成纤维细胞体外培养条件的优化

目的：优化体外人牙周膜成纤维细胞(HPLF)培养条件，以提高原代HPLF培养成功率。方法：采用玻璃及塑料培养瓶、DMEM、RPMI1640培养液以及胎牛血清、小牛血清，分别比较原代牙周膜成纤维细胞游出率。结果：塑料培养瓶细胞游出率以及细胞游出最短时间均优于常用玻璃培养瓶；两种不同血清比较，胎牛血清的组织块贴壁以及细胞游出率均明显优于小牛血清；RPMI1640比DMEM培养液更适合于HPLF培养。结论：商品塑料培养瓶、胎牛血清、RPMIl640是提高体外HPLF培养成功率的关键。