硅酸二钙对人牙髓干细胞增殖及骨向分化的影响

目的:探索硅酸二钙(Dicalcium silicate,C2S)在人牙髓干细胞增殖和成骨向分化能力方面的影响.方法:配制含梯度浓度(1、5、10、50、100μg/mL)的C2S条件培养基,与人牙髓干细胞共培养1、3、5、7天,CCK-8实验及迁移实验分别用于检测C2S对人牙髓干细胞的增殖能力与迁移能力的影响.筛选出最佳浓度为50μg/mL的C2S溶液与人牙髓干细胞共培养,并诱导其骨向分化.通过碱性磷酸酶(Alkaline phospha-tase,ALP)染色及定量试剂盒,茜素红染色及定量分别检测ALP活性与矿化结节沉积,RT-PCR实验与Western Blot实验检测骨向分化相关mRNA与蛋白表达水平来进一步研究人牙髓干细胞在C2S作用下体外骨向分化能力的改变.结果:50 μ g/mL的C2S溶液可显著提高人牙髓干细胞的增殖能力、ALP活性与体外矿化能力.同时C2S能促进ALP、RUNX2、OPN的RNA表达水平及蛋白水平的升高.结论:50μg/mL的C2S溶液能够显著提升人牙髓干细胞的增殖能力和体外骨向分化的能力.     

miR-103对牙髓干细胞增殖及其向成牙本质细胞分化的影响

目的:探讨miR-103对牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的影响.方法:从即刻拔除的成入第三磨牙中分离培养人牙髓干细胞,将培养的细胞分为对照组、miRNA阴性对照组、miR-103过表达组和miR-103降低表达组,利用CCK-8法检测人牙髓细胞的增殖能力变化,利用q-PCR和Western Bolt技术检测人牙髓细胞中R...     

Satb2过表达慢病毒载体构建及其对骨髓基质细胞的转染及表达

目的：构建大鼠特殊富含AT序列结合蛋白2（special AT-rich binding protein 2,Satb2）基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）后观察Satb2的表达。方法：采用DNA重组技术将Satb2基因插入到含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒表达载体质粒GV208中,获得重组慢病毒载体GV208-Satb2。重组慢病毒载体经过测序鉴定后转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,Western blot分析转染前后Satb2表达情况。结果：测序结果证实Satb2基因正确插入载体中,成功构建大鼠Satb2基因过表达载体。Western blot检测显示转染后Satb2蛋白表达显著上调。结论：针对大鼠Satb2基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中Satb2基因的表达。     

浓缩生长因子(CGF)对人根尖牙乳头干细胞生物学特性的影响

目的:体外研究异体浓缩生长因子(Concentrate Growth Factors,CGF)对人根尖牙乳头干细胞(human stem cells from apical papilla,hSCAPs)增殖、迁移及成骨分化能力的影响,为异体CGF的临床应用提供实验依据.方法:体外分离培养、纯化根尖牙乳头干细胞,通过流式细胞仪、茜素红染色及油红O染色鉴定hSCAPs细胞表面抗原分子及多分化潜能;取静脉血差速离心制备异体CGF,CCK8法检测CGF培养下hSCAPs细胞增殖率,实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测成骨基因表达变化,碱性磷酸酶活性(ALP)实验检测CGF培养下hSCAPs ALP活性,Transwell法检测CGF培养下hSCAPs迁移能力.结果:原代培养的hSCAPs阳性表达间充质干细胞表面分子,并具有多向分化潜能;相较于对照组,异体CGF可明显增强hSCAPs增殖及迁移能力,并能显著增加细胞ALP活性及成骨/成牙相关基因的表达.结论:异体CGF在hSCAPs增殖能力、迁移能力及成骨向分化能力方面具有显著的促进作用,提示异体CGF在牙髓损伤修复及组织工程应用中具有重要的潜在作用.     

模拟微重力对人牙髓干细胞微丝及细胞迁移能力的影响

目的:探讨模拟微重力对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)微丝及迁移能力的影响。方法:利用旋转培养系统(rotary cell culture system,RCCS)将HDPSCs分为常规对照组和微重力培养组,分别于4、12、24、48、72h行免疫荧光染色,观察微丝的变化;72h后,透射电镜观察微丝骨架变化及细胞迁移实验检测细胞迁移能力。结果:4h时即有粗大的微丝纤维束解聚,24～72h变得模糊,紊乱,且出现多向排列趋势;实验组细胞迁移数量少于对照组(P<0.05)。结论:人牙髓干细胞微丝在模拟微重力环境下发生改变,呈时间依赖性并使细胞迁移能力降低。     

Notch配体Delta-1对人牙髓干细胞体外增殖的影响

目的:探讨Notch配体Delta-1对人牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)体外增殖活性的影响。方法:用Delta-1-EGFP重组逆转录病毒感染培养的人牙髓干细胞,获得稳定高表达人Delta-1蛋白的人牙髓干细胞系;利用CFU-F计数、四唑盐(MTT)比色法及流式细胞仪等方法检测Delta-1基因转导人牙髓干细胞的克隆形成率、细胞生长曲线和细胞周期变化。结果:与正常牙髓干细胞相比,Delta-1转导人牙髓干细胞的CFU-F计数为62～89clones/103cell,约为前者的10倍;接种1～7d,转导细胞的活细胞数量增加显著;S期细胞比例及增殖指数,分别从转导前的20.6%和35.8%提高到63.8%和75.7%。结论:Notch配体Delta-1可显著促进人牙髓干细胞的体外增殖,Notch-Delta-1信号转导途径在人牙髓干细胞的自我更新中起重要作用。     

Notch配体Delta1对人牙髓干细胞分化的影响

目的:探讨Notch配体Delta1对体外人牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)向成牙本质细胞分化能力的影响。方法:利用逆转录病毒载体建立高表达人Delta1基因的人牙髓干细胞系;实验分三组,正常牙髓干细胞组、转导细胞组及混合组(正常与转导细胞比例为100∶1),分别进行体外分化诱导。倒置显微镜观测各组细胞各生长期出现的时间;VonKossa染色计数各组形成钙化结节数;Westernblot法检测各组细胞牙本质涎磷蛋白表达。结果:与正常牙髓干细胞相比,转导细胞各生长期出现时间明显提前,形成的钙化细胞结节数目显著增加,牙本质涎磷蛋白表达显著升高。结论:Delta1基因转导牙髓干细胞仍保持了体外向成牙本质细胞分化的能力;Notch-Delta1信号与分化诱导因子协同作用可促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。     

人牙髓干细胞在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物支架上粘附与增殖的研究

采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,免疫组化法及体外诱导分化对细胞进行鉴定。将人牙髓干细胞与PLGA支架材料进行复合培养,扫描电镜(SEM)观察支架材料形态,细胞粘附、增殖及基质分泌情况;细胞计数检测其增殖力。结果:细胞接种2、5、10d,扫描电镜及细胞计数均显示HDPSCs与PLGA支架材料粘附紧密,生长状态良好,细胞明显增殖(P<0.05),有丰富的细胞外基质形成。结论:PLGA是一种适宜人牙髓干细胞粘附与增殖的支架材料。     

不同低氧浓度对体外培养人牙髓干细胞生物学特性的影响

目的: 探讨不同低氧浓度对体外培养人牙髓干细胞生物学特性的影响。方法: 选择2019年1月—2020年1月收集的健康者完整拔除的下颌阻生第三磨牙,采用块酶消化法培养牙髓干细胞,置于3% O₂（3%低氧浓度实验组）、5% O₂（5%低氧浓度实验组）和21% O₂（21%常氧浓度对照组）中培养7 d。用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡情况、细胞表面标志物,采用CCK-8法检测细胞增殖情况, Transwell实验检测细胞迁移能力。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 传代培养细胞干细胞表面标志物CD44、CD29、D73表达率分别为97.25%、99.36%和99.60%;分别置于3%、5%和21% O₂条件下培养4、7 d,5%低氧浓度实验组牙髓干细胞增殖最强,3%低氧浓度实验组牙髓干细胞增殖最弱,差异显著（P<0.05）,牙髓干细胞凋亡情况相比无显著差异（P>0.05）;21%常氧浓度对照组牙髓干细胞G1期占比显著低于3%和5%低氧浓度实验组（P<0.05）,S期细胞占比显著高于3%和5%低氧浓度实验组（P<0.05）;3%低氧浓度实验组牙髓干细胞迁移细胞最多,21%常氧浓度对照组牙髓干细胞迁移细胞最少,差异显著（P<0.05）。结论: 不同氧浓度下培养人牙髓干细胞,对其形态、增殖能力、迁移能力、细胞周期影响较大,但对细胞凋亡影响不大。     

Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞增殖能力的影响

目的: 初步研究Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖能力的影响。方法: 采用体外贴壁式培养法培养人牙髓干细胞,应用Rho激酶抑制剂Y-27632,根据培养条件,分为普通培养液培养组(Con)及普通培养液+抑制剂Y-27632培养组(Con+Y),采用MTT法检测两种培养条件下人牙髓干细胞培养24、48、72、96 h细胞活性;采用DAPI染色法及流式细胞定量检测技术(FCM)比较两组在培养48 h的细胞数量及细胞周期分布情况。结果: MTT结果显示,实验组hDPSCs细胞增殖曲线较对照组明显上移,且增殖高峰期提前;培养48 h,DAPI染色结果显示,实验组细胞总数量明显多于对照组;FCM结果显示,对照组G₀/G₁期细胞比例为(66.8±6.84)%,S期细胞比例为(25.17±0.62)%,实验组G0/G1期细胞比例为(58.59±1.76)%,S期细胞比例为(31.34±1.16)%,实验组S期细胞比例明显高于对照组(P<0.05)。 结论: Rho激酶抑制剂Y-27632促进人牙髓干细胞DNA合成、细胞分裂及增殖。     

载他克莫司可注射温敏水凝胶促牙髓干细胞成骨向分化作用研究

目的:研究载他克莫司可注射温敏水凝胶(FK506-TH)对人牙髓干细胞(hDPSCs)成骨分化的影响。方法:酶消化法体外分离培养hDPSCs,CCK-8法检测不同浓度FK506FK506-TH对hDPSCs增殖的影响,采用Real-time PCR、茜素红S和碱性磷酸酶(ALP)染色检测各组细胞成骨分化能力的影响。结果:FK506-TH能促进hDPSCs增殖(P<0.05),Real-time PCR数据表明,FK506-TH组细胞成骨基因的mRNA均明显高于FK506药物组和单纯水凝胶组(P<0.05),且FK506-TH细胞矿化结节及ALP活性较FK506药物组和单纯水凝胶组明显增加(P<0.001)。结论:FK506-TH可提高hDPSCs的增殖能力以及成骨分化的潜能。     

神经肽P物质对人牙髓干细胞生物学行为的影响

目的探讨神经肽P物质对人牙髓干细胞（hDPSC）生物学行为的影响。 方法组织块法分离、培养hDPSC,通过流式细胞术和茜素红染色鉴定hDPSC。用不同浓度的神经肽P物质[0（对照组）、0.1 nmol/L、10 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L]干预hDPSC,在第24、48、72和96 h通过细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞增殖能力;在48 h时通过Transwell实验检测细胞迁移能力。成血管诱导条件下干预14 d后通过小管形成实验检测细胞成管情况;通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测成管相关基因血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。采用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计学分析。 结果成功分离、培养hDPSC。流式细胞术结果显示,细胞表面标记物CD29、CD90、CD34和CD45表达率分别为99.90%、99.90%、0.40%和0.04%;茜素红结果显示,成骨诱导组形成较明显的矿化结节。CCK-8结果显示,对照组在48、72、96 h的相对增值率分别为（100.0 ± 0.4）%、（100.0 ± 0.7）%和（100.0 ± 1.9）%,实验组在48 h时开始促进细胞增殖,72、96 h各浓度实验组均显著促进hDPSC的增殖,差异具有统计学意义（F_{48 h} = 50.1,P_{48 h}<0.001;F_{72 h} = 323.5,P_{72 h}<0.001;F_{96 h} = 253.6,P_{96 h}<0.001）,最佳浓度10 μmol/L时,48、72和96 h的细胞增殖率分别为（119.0 ± 1.0）%、（148.4 ± 3.5）%和（140.8 ± 1.0）%;Transwell结果显示,与对照组穿膜数量（5.0 ± 1.4）相比,实验组均对hDPSC的迁移具有促进作用（F = 310.3,P<0.001）,最佳效应浓度为10 nmol/L,穿膜数量为（87.6 ± 8.3）;成血管诱导14 d后,小管形成实验结果显示,各浓度的P物质实验组与对照组相比均可促进hDPSC小管形成情况（F_{小管分支点数} = 43.7,P_{小管分支点数}<0.001;F_{相对小管长度} = 19.4,P_{相对小管长度} = 0.0001）;RT-PCR结果显示,0、0.1 nmol/L、10 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L实验组VEGFR2的相对表达量分别为（1.000 ± 0.023）、（1.129 ± 0.076）、（1.474 ± 0.101）、（1.285 ± 0.055）和（1.213 ± 0.160）;VEGF的相对表达量分别为（1.000 ± 0.026）、（1.211 ± 0.023）、（1.242 ± 0.070）、（1.679 ± 0.043）和（1.138 ± 0.156）,P物质组与对照组相比,差异均有统计学意义（F_VEGFR2 = 10.43,P_VEGFR2 = 0.001 4;F_VEGF = 29.87,P_VEGF<0.001）。 结论P物质对hDPSC的增殖、迁移和成血管能力具有一定促进作用。     

The effect of electromagnetic fields on survival and proliferation rate of dental pulp stem cells

Abstract

Aims: Extremely low-frequency electromagnetic fields (ELF-EMF) can affect biological systems and alter some cell functions like proliferation rate. Dental pulp tissue is known as a source of multipotent stromal stem cells (MSCs), which can be obtained by a less invasive and more available process compared to bone marrow-derived stem cells (BMSCs). This study aimed to consider the effect of ELF-EMF on proliferation rates of human dental pulp stem cells (hDPSCs).

Material and methods: ELF-EMF was generated by a system including autotransformer, multi-meter, solenoid coils, teslameter and its probe. The effect of ELF-EMF with the intensity of 0.5 and 1?mT and 50?Hz on the proliferation rate of hDPSCs was assessed in 20 and 40?min per day for 7?days. MTT assay and DAPI test were used to determine the growth and proliferation of DPSCs.

Results: Based on MTT, ELF-EMF has maximum effect with the intensity of 1?mT for 20?min/day on the proliferation of hDPSCs. The survival and proliferation rate in all exposure groups were significantly higher than the control group. Based on the data obtained from MTT and DAPI assay, the number of viable cells in the group exposed to 1?mT for 20?min/day was higher than other groups (p?<?.05).

Conclusions: Regarding to the results of this study, 0.5 and 1?mT ELF-EMF can enhance survival and proliferation rates of hDPSCs.     

GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响

目的:探索谷氨酸脱氢酶1 (Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hPDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用.方法:体外分离培养hPDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率.采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平.对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达.采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调.结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用.     

The Role of Integrin-α5 in the Proliferation and Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Introduction

It has been reported that integrin-α5 (ITGA5) activity is related to cell proliferation, differentiation, migration, and organ development. However, the involvement of ITGA5 in the biological functions of human dental pulp stem cells (hDPSCs) has not been explored. The aim of this study was to investigate the role of ITGA5 in the proliferation and odontogenic differentiation of hDPSCs.

Methods

We knocked down ITGA5 in hDPSCs using lentivirus-mediated ITGA5 short hairpin RNA (shRNA). Changes in the proliferation in hDPSCs infected with lentiviruses expressing ITGA5-specific shRNA or negative control shRNA were examined using the 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and 5-ethynyl-2′-deoxyuridine labeling. Both ITGA5 knockdown cells and shMock cells were cultured in mineralization medium for 3 weeks, and the differentiation of cells was detected with alizarin red S staining. The expression of odontogenic differentiation-related molecular markers was assessed using real-time polymerase chain reaction and Western blot assays.

Results

The knockdown of ITGA5 decreased the proliferation capacity of hDPSCs. ITGA5 shRNA promoted odontogenic differentiation of hDPSCs with the enhanced formation of mineralized nodules. It also up-regulated the messenger RNA expression of multiple markers of odontogenesis and the expression of dentin sialophosphoprotein protein.

Conclusions

These findings suggest that ITGA5 plays an important role in maintaining hDPSCs in a proliferative state. The inhibition of ITGA5 signaling promotes the odontogenic differentiation of hDPSCs.     

瘦素对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

目的 探讨瘦素(leptin)对体外培养的牙髓干细胞增殖、分化的影响.方法 体外培养牙髓干细胞,采用MTT法及流式细胞技术检测不同浓度瘦素对牙髓干细胞增殖作用的影响,通过碱性磷酸酶、Yon Kossa染色及矿化相关蛋白(DSP、OCN)的免疫组化染色来检测瘦素对牙髓干细胞分化的影响.结果 瘦素对牙髓干细胞增殖没有显著作用,但是对牙髓干细胞的ALP活性呈浓度依赖性促进.Von Kossa染色可见矿化结节形成,DSP及OCN表达阳性.结论 瘦素可促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化.     

牙本质非胶原蛋白对人牙髓干细胞增殖活性及矿化能力的影响

目的：明确牙本质非胶原蛋白（dentin non—collagenous proteins,dNCPs）对人牙髓干细胞（human dental pulp stemcells,hDPSCs）增殖及矿化能力的影响。方法：通过细胞活性噻唑蓝（MTT）比色法、碱性磷酸酶（ALP）活性检测、茜素红钙化结节染色和氯代十六烷基吡啶定量分析钙离子浓度,检测10¨g／mLdNCPs对hDPSCs增殖和矿化能力的影响。结果：dNCPs分别诱导1、3、5、7、9d,人牙髓干细胞增殖活性与对照组相比无显著性差异（P〉0．05）;诱导3、5、7d时,人牙髓干细胞ALP活性明显上调,与对照组相比有统计学差异（P〈0．01）;诱导2周后,茜素红染色显示10μg／mLdNCPs组出现较大钙化结节,定量分析显示,其形成钙化结节的能力明显高于对照组（P〈0．001）。结论：10μ∥mLdNCPs可明显促进人牙髓干细胞的矿化能力,对其增殖活性的影响则不明显。     

脐静脉内皮细胞与牙本质浸提液诱导的牙髓干细胞共培养成血管的研究

目的:探讨共培养牙本质浸提液(dentin extract, DE)诱导的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)在成血管方向的潜能。方法:制备人牙本质浸提液,分别诱导培养hDPSCs 7 d和14 d后,Real-time PCR和Western blot检测诱导后hDPSCs中牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的表达;血管形成实验共分为5组,分别是:HUVECs组、DE诱导后的hDPSCs组以及按5∶1、5∶5、5∶10比例共培养HUVECs和诱导后hDPSCs组,分别在第3、6、9h检测各组小管形成的相对长度和节点数目。结果:DE诱导的hDPSCs 在mRNA和蛋白水平上表达的DSP、DSPP和DMP-1显著提高(P＜0.05);体外小管形成实验结果示共培养组较早形成稳定的网状结构,在3 h时,HUVEc与诱导后hDPSCs比例为5∶1组形成的小管相对长度和相对分支点数明显高于HUVECs组(P＜0.05),而5∶5组和5∶10组低于HUVECs组(P＜0.05)。结论:牙本质浸提液诱导后的hDPSCs与HUVECs按一定比例共培养可促进血管结构的形成。