丝素蛋白-壳聚糖三维多孔支架材料生物相容性及促成骨性能研究

目的研究丝素蛋白-壳聚糖支架材料的生物相容性及成骨性能,为其在骨组织工程方面的应用提供理论挂础。方法采用冷冻干燥合并化学交联的方法制备出2组支架材料,实验组采用丝素蛋白-壳聚糖支架（质量比为2：3）,对照组采用壳聚糖支架。将MG-63成骨细胞接种于这2组支架上,通过Hoechst荧光染色观察其在支架材料上的生长,计算细胞粘附率和增殖率,最后通过矿化结节的形成以及MG-63成骨细胞分泌碱性磷酸酶能力来研究支架的成骨性能。以载玻片培养MG-63细胞为空白对照组。结果细胞培养1、3d时,对照组细胞粘附率分别为（26．63±0．57）％、（49．88±0．78）％,实验组细胞粘附率分别为（31．88±0．94）％、（62．13±0．36）％,实验组的细胞粘附率高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。细胞培养3d时,对照组和实验组细胞增确率检测的光镪度值分别为0．491±0．010、0．5964±0．008,实验组的细胞增殖率高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。实验组碱性磷酸酶活性和矿化结节的生长状况也均优于对照组。结论丝素蛋白-壳聚糖支架（质艟比为2：3）具有良好的生物相容性和优良的促成骨性能,对于骨组织工程研究有良好的应用前景。     

新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架体外细胞相容性的实验研究

目的　评价新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料的体外细胞相容性。方法　SD大鼠骨髓基质细胞 (BMSCs)经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架(实验组)、普通多孔羟基磷灰石陶瓷支架(对照组)体外复合培养。扫描电镜观察BMSCs在材料上的生长及生理功能表达情况;测定细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素的含量;流式细胞仪检测细胞的凋亡及周期、倍体,比较细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性。结果　BMSCs经体外诱导形成钙结节,Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。两组材料上皆有细胞附着生长,但实验组细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性均强于对照组。结论　SD大鼠BM- SCs与新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料有良好的细胞相容性。     

纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合膜的结构及与成骨样细胞相容性研究

目的观察纳米羟基磷灰石/聚酰氨66(nHA/PA66)复合膜的结构及其对成骨样细胞生物相容性的影响。方法以膨体聚四氟乙烯膜(e-PTFE)为对照组,扫描电镜和光学显微镜下观察两组膜的结构。在两组膜材料上分别接种MG63成骨样细胞并设空白对照。采用MTT法检测细胞的增殖活力,酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)表达,扫描电镜观察细胞在生物膜表面的增殖与粘附情况。结果 nHA/PA66膜分为正、反两面,正面为疏松多孔结构,反面为致密光滑、有少量微孔散在分布的结构。e-PTFE膜由成行排列,直径比较均一的长椭圆形的裂隙组成,正反面、断面结构基本一致。与空白对照组相比,MTT检测显示,nHA/PA66膜和e-PTFE膜对成骨样细胞增殖活力无显著性影响(P>0.05)。ALP活性也无显著性差异(P>0.05)。扫描电镜观察细胞在两种膜上生长良好,在nHA/PA66膜上细胞伸展更充分。结论 nHA/PA66膜对成骨样细胞生长无抑制作用,适于做引导骨再生膜材料,相比较e-PTFE,其具有更优良的结构及生物学性能。     

新型磷灰石-硅灰石生物活性玻璃陶瓷-半水硫酸钙复合材料的制备及研究

目的 研制一种新型磷灰石-硅灰石生物活性玻璃陶瓷-半水硫酸钙(apatite-wollastonite bioactive glass-ceramic-calcium sulphate hemihydrate,AW-BGC-CSH)复合材料,探讨其作为骨组织工程支架材料的可行性.方法 按AW-BGC与医用半水硫酸钙(calcium sulphate hemihydrate,CSH)的不同质量百分数(CSH分别占50%、40%、30%、20%)制备复合材料,研究其形态结构及力学性能;并将复合材料与成骨细胞体外复合培养,通过形态学观察以及检测细胞增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活力及微量蛋白含量等指标,评价AW-BGC-CSH复合材料与成骨细胞间的相互作用.以单纯培养基作为空白对照组.结果 复合材料为三维立体多孔结构,可在3-5 min内保持其可塑性,最高固化温度为36.4℃,抗压强度最高可达9.3 Mpa.成骨细胞在复合材料上生长良好,实验组复合材料的毒性级为0级.复合培养1、3、 5、 7 d后微量蛋白含量分别为(251±12)、(296±31)、(580±13)和(571±15)mg/L,ALP活性分别为(4.50±0.68)、(6.90±0.27)、(12.05±0.28)和(11.86±0.63)U/mg;与空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 新型AW-BGC-CSH复合材料具有三维立体结构、良好的可塑性和抗压强度,以及良好的生物相容性.     

纳米羟基磷灰石材料复合碱性成纤维细胞因子促进牙周组织再生的实验研究

目的:探讨新型纳米羟基磷灰石材料—纳米羟晶/胶原仿生骨材料(nHAC)作为生长因子载体和牙周组织工程支架材料应用的可行性,观察评价其对牙周组织再生修复的影响和意义。方法:将人牙周膜细胞(HPDLCs)接种于nHAC三维支架上复合培养,体外扫描电镜观察HPDLCs在nHAC支架上的附着、生长情况,并将碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与nHAC复合植入动物人工牙周组织缺损,表面覆盖聚四氟乙烯(e-PTFE)膜,以空白对照组和单纯置膜组作为对照。术后8周进行组织学观察和测量,分析评价其牙周组织的再生情况。结果:扫描电镜可见nHAC具有良好的多孔网状结构,PDLCs在nHAC支架上贴附紧密,生长旺盛,伸展充分,动物实验结果显示nHAC/bFGF/膜复合植入组较空白对照组和单纯置膜组有更多新生的牙槽骨、牙周膜和牙骨质生成,结果具有显著性差异。结论:nHAC具有良好的三维空间结构和细胞相容性,与bFGF复合植入牙周缺损后可显著促进牙周组织再生,提示nHAC有望成为理想的生长因子载体和牙周组织工程支架材料。     

一种新型纳米羟基磷灰石材料应用于牙周组织工程的可行性研究

目的:对一种新型纳米羟基磷灰石材料 -纳米羟晶 -胶原仿生骨材料 (nHAC)进行细胞相容性和细胞毒性的研究,以初步探讨其应用于牙周组织工程的可行性。方法:将体外培养的人牙周膜细胞(PDLCs)接种于nHAC三维支架上复合培养,采用细胞计数和扫描电镜观察PDLCs在nHAC支架上的附着、生长情况,并通过MTT测试法和碱性磷酸酶(ALP)活性检测法研究nHAC浸提液对PDLCs增殖和功能表达的影响。结果:人PDLCs在nHAC支架上形成良好贴附并增殖,扫描电镜可见nHAC具有良好的多孔网状结构,细胞在nHAC上生长旺盛,伸展充分,而PDLCs在不同浓度的材料浸提液中的生长、增殖及ALP活性与空白对照组相比无显著性差异。结论:nHAC具有良好的三维空间结构和细胞相容性,且无细胞毒性,有望成为牙周组织工程的支架材料。     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。     

纳米抗菌复合膜的结构及作为引导骨组织再生膜的生物相容性研究

目的 观察载银纳米羟磷灰石/二氧化钛/聚酰胺66（Ag-nHA-nTiO2/PA66）纳米抗菌复合膜的物理结构及对成骨样细胞生物相容性的影响。方法 扫描电镜（SEM）和光学显微镜下观察Ag-nHA-nTiO2/PA66膜和膨体聚四氟乙烯（e-PTFE）膜的结构,在两组膜材料上接种成骨样细胞MG63,另设空白对照组。甲基噻唑基四唑（MTT）法检测MG63细 胞的增殖曲线,酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶（ALP）的表达,SEM下观察细胞在生物膜表面的增殖和黏附情况。结果 Ag-nHA-nTiO2/PA66膜正面疏松多孔,反面光滑致密。e-PTFE膜正反面结构相同,由成行排列的长椭圆形裂隙组成。与空白对照组相比,MTT检测显示,两种膜对MG63细胞增殖活力差异无统计学意义（P>0.05）;ALP活性间差异也无统计学意义（P>0.05）。SEM下观察细胞在两种膜上生长良好,在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜上细胞伸展更充分。 结论 Ag-nHA-nTiO2/PA66膜对MG63细胞生长无抑制作用。与e-PTFE相比,其具有更优良的结构和生物学性能, 适于用作引导骨再生膜材料。     

氟-羟基磷灰石对骨肉瘤MG63细胞生物学性能的影响

目的 评价氟取代比例为20％的氟-羟基磷灰石(fluor-hydroxyapatite,FHA)对骨肉瘤MG63细胞增殖和成骨分化的影响,以期为FHA的临床应用提供依据.方法 采用化学沉淀法合成FHA,扫描电镜、X射线衍射仪、傅里叶红外光谱仪观察结构并表征.设置FHA组(培养基中加入FHA)、羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)组(培养基中加入HA)和空白对照组(单纯培养基),每组样本量为3,共培养骨肉瘤MG63细胞.甲基噻唑基四唑法检测3组细胞增殖能力,检测3组细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatese,ALP)活性.反转录PCR检测3组细胞成骨分化相关基因(Ⅰ型胶原、ALP、骨钙素和核心结合因子)mRNA表达情况.结果 FHA的X射线衍射图谱主晶相与HA标准图谱一致.培养3d后FHA组细胞增殖(A值为1.87±0.06)显著高于空白对照组(1.25±0.02)(P＜0.05),FHA组与HA组(1.84±0.03)差异无统计学意义(P＞0.05).培养3d后FHA组ALP活性(4.62±0.09)显著高于空白对照组(1.92±0.05)(P＜0.05).与空白对照组相比,FHA上调细胞Ⅰ型胶原、ALP、骨钙素mRNA表达,下调核心结合因子mRNA表达.结论 FHA对MG63细胞增殖和成骨分化相关基因mRNA的表达有促进作用,具有良好的生物相容性.     

形状记忆可吸收支架的制备及其在骨组织应用的体外研究

目的研究具有形状记忆功能的支架材料的制备方法,探讨其物理性能及生物相容性,为骨组织工程的应用作奠定基础。方法热压成形术合成孔隙大小及孔隙率适宜的形状记忆聚合物(SMP)支架,应用体式显微镜观察支架材料的形变过程,扫描电镜考察支架材料塑形前后的孔隙变化以及细胞在支架表面附着生长的情况,同时将兔骨髓间充质干细胞(BMSC)接种于支架材料,运用死活细胞染色方法检测该支架材料的生物相容性。数据分析采用方差分析,两两比较采用SNK检验。结果体式显微镜展现了材料自形变后的中间状态恢复到原始状态,形变恢复率约91%,合成的支架材料在人体温度(37℃)下具有形状记忆特性;扫描电镜下可见未形变的支架材料其具有良好的孔隙率(90.6±5.2)%,原始孔隙大小约165μm,压缩状态的孔隙大小约为33μm,同时BMSC与支架材料表面附着良好;死活细胞染色结果显示,BMSC在SMP支架表面培养1、7、14 d的活细胞率分别为(81.5±2.2)%、(86.3±1.9)%、(82.1±1.8)%,空白对照组1、7、14 d活细胞率分别为(82.3±1.7)%、(88.4±1.4)%、(83.7±2.1)%,两组间活细胞率差异无统计学意义(F=0.380,P=0.555)。而SMP支架组1、7、14 d的活细胞密度分别为(91±2.3)、(202±4.8)和(617±5.5)个/mm2,空白对照组1、7、14 d活细胞密度分别为(83±4.5)、(219±5.3)和(599±7.2)个/mm~2,均呈增长模式。结论制备所得支架材料孔隙均一,形变温度为37℃,具有良好形状记忆特性及生物相容性,能响应人体温度恢复到塑型前形状,在微创手术中有巨大的应用潜能。     

灯盏花联合机械牵张力对成骨细胞OPG和RANKL蛋白表达的影响

目的：研究灯盏花、机械牵张力以及灯盏花与机械牵张力联合作用下对体外培养的成骨细胞OPG和RANKL蛋白表达的影响,探讨灯盏花对正畸骨改建的作用机理。方法：体外培养成骨样细胞株MG63细胞,细胞的机械牵张力刺激采用SXG4201型四点弯曲细胞力学加载仪。分别单用机械牵张力刺激（2000 μstrain,0.5Hz）、单用灯盏花（1mg/mL）干预、以及机械牵张力（2000 μstrain,0.5Hz）和灯盏花（1mg/mL）联合干预MG63细胞不同时间（3h,6h,12h,24h）后,提取细胞总RNA和蛋白质,用Western blot方法检测MG63细胞OPG蛋白和RANKL蛋白的表达。结果：单用机械牵张力刺激MG63细胞后OPG蛋白表达上调,且呈时间依赖性,而RANKL蛋白表达无明显变化;单用灯盏花干预MG63细胞后OPG蛋白表达下调,RANKL蛋白表达增加;两者联合干预MG-63细胞后,OPG蛋白表达量减少,RANKL蛋白表达显著增加。结论：灯盏花能拮抗机械牵张力对成骨细胞OPG分泌的刺激作用,促进机械牵张力对成骨细胞RANKL分泌的刺激作用。     

不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石复合支架对人牙髓干细胞增殖及矿化能力影响研究

目的　探讨不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石（PLGA/HA）复合支架的降解速率及其对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）增殖及矿化能力的影响。方法    采用溶液浇筑/颗粒沥析技术构建含质量分数分别为10%、20%及30% HA的PLGA/HA复合支架的3个实验组,单纯PLGA支架作为对照组。采用降解实验检测支架的降解速率。将hDPSCs接种于不同比例的PLGA/HA复合支架进行培养,扫描电镜观察细胞形态,应用MTT法检测细胞增殖能力。hDPSCs接种于各组支架培养72 h后,将复合支架植入裸鼠体内,分别于饲养1个月及3个月后处死裸鼠取出支架,应用HE染色观察组织学形态,应用牙本质基质蛋白1（DMP1）免疫组化染色观察细胞的矿化程度。结果    10%HA组和20%HA组具有较适宜的降解速率。各组均具有较高的促hDPSCs增殖能力,促进效果随HA含量的增加而加强。HE染色和免疫组化染色结果显示,HA可促进hDPSCs在体内的成牙本质向分化,分化程度与HA含量成正比,20% HA组及30% HA组矿化程度均较佳。结论   含20%HA的PLGA/HA复合支架具有较佳的降解速率及促细胞增殖和矿化能力,是比较理想的细胞支架材料。     

不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石复合支架对人牙髓干细胞增殖及矿化能力影响研究

 目的　探讨不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石（PLGA/HA）复合支架的降解速率及其对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）增殖及矿化能力的影响。方法    采用溶液浇筑/颗粒沥析技术构建含质量分数分别为10%、20%及30% HA的PLGA/HA复合支架的3个实验组，单纯PLGA支架作为对照组。采用降解实验检测支架的降解速率。将hDPSCs接种于不同比例的PLGA/HA复合支架进行培养，扫描电镜观察细胞形态，应用MTT法检测细胞增殖能力。hDPSCs接种于各组支架培养72 h后，将复合支架植入裸鼠体内，分别于饲养1个月及3个月后处死裸鼠取出支架，应用HE染色观察组织学形态，应用牙本质基质蛋白1（DMP1）免疫组化染色观察细胞的矿化程度。结果    10%HA组和20%HA组具有较适宜的降解速率。各组均具有较高的促hDPSCs增殖能力，促进效果随HA含量的增加而加强。HE染色和免疫组化染色结果显示，HA可促进hDPSCs在体内的成牙本质向分化，分化程度与HA含量成正比，20% HA组及30% HA组矿化程度均较佳。结论   含20%HA的PLGA/HA复合支架具有较佳的降解速率及促细胞增殖和矿化能力，是比较理想的细胞支架材料。     

Osteoblasts and MG-63 osteosarcoma cells behave differently when in contact with ProRoot MTA and White MTA

AIM: To test the hypothesis that MG-63 osteosarcoma cells and primary osteoblasts react differently to ProRoot trade mark MTA (mineral trioxide aggregate) and White MTA by: (i) investigating the attachment of primary osteoblasts and MG-63 osteosarcoma cells to ProRoot trade mark MTA and White MTA; and (ii) comparing the osteogenic behaviour of both cell lines in contact with these endodontic materials. METHODOLOGY: Primary osteoblasts were harvested from foetal rat calvaria by sequential digestion and MG-63 osteosarcoma cells were purchased. Cells were exposed to ProRoot trade mark MTA and White MTA prepared according to the manufacturer's instructions. All samples and controls were prepared in quadruplicate. After 6, 9 and 13 days exposure to MTA, the cells were fixed and prepared for SEM examination. In addition, both the cell types were grown to confluence and exposed to beta-glycerophosphate and dexamethasone to assess mineralized nodule formation as a function of osteogenic behaviour. RESULTS: The number of cells on the surface of the culture dish and on top of the materials increased in all samples throughout the 3 time periods, except for White MTA where no primary osteoblasts were visible on top of the material by the end of 13 days. After exposing cells to differentiation medium nodules were observed in cultures of primary osteoblasts, but not of MG-63 osteosarcoma cells. CONCLUSIONS: Under the conditions of this study, whilst primary osteoblasts initially bound to White MTA, they did not survive on the surface by the end of 13 days. Primary osteoblasts formed mineralized nodules when exposed to differentiation medium, whilst MG-63 cells did not form nodules. As MG-63 cells do not behave osteogenically by forming mineralized nodules, and primary osteoblasts are more sensitive than MG-63 osteosarcoma cells to White MTA in cell culture, primary osteoblasts are more appropriate than MG-63 cells for testing endodontic materials in cell culture.     

人牙周膜细胞在透明质酸/胶原支架上的黏附与生长

目的研究人牙周膜细胞（PDLC）在胶原、透明质酸及透明质酸/胶原支架上的黏附、生长情况,以初步探讨透明质酸/胶原支架应用于牙周组织工程的可行性。方法将体外培养的人牙周膜细胞接种到碳化二亚胺交联的胶原、透明质酸及透明质酸/胶原支架上;MTT法检测支架对人牙周膜细胞黏附、生长的影响;并用倒置相差显微镜和扫描电镜观察形态变化。结果MTT结果显示胶原、透明质酸及透明质酸/胶原支架上人PDLC的黏附、生长情况,在第1、2、4天组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）,第7天组间差异无统计学意义（P>0.05）,且人牙周膜细胞数量透明质酸/胶原组均高于对照组;人牙周膜细胞在支架上生长良好。结论相对于胶原支架和透明质酸支架,透明质酸/胶原支架更有利于人牙周膜细胞的黏附,提示该材料具备成为牙周组织工程理想支架材料的潜力。     

新型HA-PEC纳米复合骨修复材料的研制及细胞相容性研究

目的:制备一种新型的HA-PEC纳米复合骨组织缺损修复材料,并评价其细胞相容性。方法:将含有Ca、P离子(Ca/P的摩尔比为1.67,Ca~(2+)的终浓度为6 mmol/L)的酸性壳聚糖(chitosan,CS)溶液滴加入磷酸化壳聚糖(phosphorylated chitosan,PCS)溶液中,控制反应条件,获得由羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)和壳聚糖-磷酸化壳聚糖聚电解质复合物(polyelectrolyte complex,PEC)共同组成的HA-PEC微粒。HA-PEC复合物与成骨细胞共同培养,观察细胞黏附、生长的情况。结果:纳米级的、低结晶度的HA均匀地分布在PEC纤维中,"HA-PEC微粒"具有类骨的微孔结构,可促进成骨细胞黏附、增殖、分化。结论:"HA-PEC"纳米复合材料具有良好的生物相容性和降解性,有望成为一种有前途的新型骨组织修复材料。     

MTA及GIC对MG-63细胞增殖和分化功能影响的实验研究

目的：比较玻璃离子粘固剂（glass ionomer cement,GIC）、无机三氧化复合物（mineral trioxide aggregate,MTA）对MG-63细胞增殖和分化功能的影响。方法：配制GIC、MTA两种材料的浸提液,浓度分别为10g/L、20g/L、40g/L,使用不同浸提液对MG-63细胞进行培养,对照组为DMEM培养基。72h后,分别测定不同浓度组细胞的增殖功能和碱性磷酸酶活性。结果：细胞增殖功能测定结果为MTA各浓度组的A值均较对照组高,并且随着浸提浓度的提高,A值增大,差别有统计学意义（P〈0.05）;GIC各浓度组的A值均较对照组低,随着浸提浓度的提高,A值减小,差别有统计学意义（P〈0.05）。细胞碱性磷酸酶活性测定结果为MTA组A值均较对照组高,与对照组进行单因素方差分析,其中20g/L、40g/L浓度组差别有统计学意义（P〈0.05）;GIC各浓度组A值均比对照组低,其中40g/L浓度组与对照组进行进行单因素方差分析,差别有统计学意义（P〈0.05）。结论：MTA与GIC相比能促进细胞的增殖与分化。