舌癌细胞系T-TFL的建立和生物学性状检测

背景基因治疗已成为恶性肿瘤研究领域的热点和发展趋势,但舌癌基因治疗的研究报道极少.目的构建含相关死亡结构域蛋白(FADD)及肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)基因功能结构域的融合基因TFL,稳定转染入人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113)中,检测建系细胞T-TFL的生物学性状,探讨一种更有利于舌癌患者治疗期及治疗后期内生活质量的治疗手段.设计以诊断为依据,前瞻性研究.地点和对象实验在第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科完成,研究对象为人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113),上海第二医科大学口腔医学院建系.干预反转录PCR获得人FADD及TNFR1基因cDNA,重组PCR法构建含二者功能结构域的融合基因TFL,通过阳离子脂质体法稳定转染TFL基因入Tca-8113细胞中.主要观察指标Western blot检测融合蛋白TNFR1/DED表达,通过形态学观察、生长曲线等检测T-TFL细胞的生物学性状.结果获得了人FADD及TNFR1基因并构建成功融合基因TFL,转染入Tca-8113细胞后,能表达融合蛋白TNFR1/DED活性,且T-TFL细胞与亲本Tca-8113细胞的生物学性状无明显差异.结论T-TFL细胞能表达融合蛋白TNFR1/DED活性,可以为进一步深入研究舌癌基因治疗提供实验基础.     

稳定转染融合基因TFL舌癌细胞系的建立及辐射敏感性实验

目的：构建含FADD及TNFR1基因功能结构域的融合基因TFL，稳定转染入人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca—8113)中，检测建系细胞T—TFL的生物学性状，并初步观察T—TFL细胞对辐射的敏感性。方法：反转录PCR获得人FADD及TNFR1基因cDNA，重组PCR法构建含二者功能结构域的融合基因TFL；阳离子脂质体法稳定转染TFL基因入Tca—8113细胞中，Westem blot检测融合蛋白TNFR1／DED表达，通过生长曲线检测T—TFL细胞的生物学性状；MTT法检测γ射线对T—TFL细胞的作用效应。结果：获得了人FADD及TNFR1基因并构建成功融合基因TFL，转染入Tca—8113细胞后，能表达融合蛋白TNFR1／DED活性，且T—TFL细胞与亲本Tca—8113细胞的生物学性状无明显差异，T—TFL细胞明显增强了对辐射的敏感性。结论：T—TFL细胞能增强对辐射的敏感性，为进一步临床应用提供实验基础。     

siRNA下调VEGF基因沉默对人舌癌细胞株Tca8113的生物学作用

目的利用siRNA干扰技术特异性抑制人舌癌细胞株Tca8113的VEGF基因表达,旨在对口腔舌鳞状细胞癌抗血管生成的基因治疗提供理论依据。方法体外构建两对针对VEGF基因的siRNA重组质粒,利用脂质体转染法导入Tca8113细胞内,MTT法观察转染后的Tca8113细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率的改变,RT-PCR技术和western Blot法检测VEGF蛋白表达量。结果本研究设计的两个靶位点siRNA能有效抑制Tca8113细胞增殖,流式细胞术结果显示G0/G1期细胞阻滞,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,细胞凋亡率增高。VEGF基因蛋白表达率降低,与对照组相比,差异有统计学意义P0.01。结论体外构建siRNA可特异有效的下调VEGF基因蛋白表达。瞬时转染siRNA可不同程度的抑制Tca8113细胞增殖和诱导凋亡。为口腔舌鳞状细胞癌抗血管生成基因治疗提供理论依据。     

nm23-H1基因转染对人舌癌Tca8113细胞株生物学行为的影响

目的研究nm23-H1基因转染对人舌癌Tca8113细胞株生物学行为的影响。方法采用脂质体转染法将真核表达载体pAdEasy-nm23-H1转染Tca8113细胞,分为Tca8113-Ad-nm23-H1组(转染pAdEasy-nm23-H1)、Tca8113-Ad组(转染空载体pAdEasy)和Tca8113组(未转染)。采用RT-PCR检测nm23-H1基因在细胞中的表达,噻唑蓝比色法检测转染前、后细胞体外增殖能力的变化,流式细胞术分析转染前、后细胞周期及凋亡的改变,采用Transwell小室和冲刷实验观察细胞侵袭、黏附、趋化运动能力的变化,克隆形成实验观察转染前、后细胞克隆形成能力。结果与Tca8113-Ad组和Tca8113组比较,Tca8113-Ad-nm23-H1组细胞体外增殖能力、细胞侵袭、黏附、趋化运动能力、克隆形成率及细胞S期比例下降(P<0.05);细胞G2/M期比例及凋亡率明显增高(P<0.05)。结论 nm23-H1基因转染后对人舌癌Tca8113细胞的增殖能力、侵袭转移能力均有明显抑制作用;nm23-H1基因可明显抑制人舌癌Tca8113细胞G2期向M期过渡,同时促进癌细胞凋亡。     

腺病毒5型E1A基因转染前后乳腺癌细胞相关指标水平的变化

目的 本研究旨在探讨E1A基因对乳腺癌细胞凋亡的影响，为乳腺癌E1A基因治疗的可行性提供理论和实验依据。方法 ①构建E1A基因真核表达质粒pEGFP-E1A：通过酶切反应获得E1A基因，琼脂糖凝胶回收后，连接入pEGFP-C1载体EcoR Ⅰ和BamHⅠ位点中。②E1A基因转染乳腺癌细胞系：脂质体介导将E1A基因转入乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞株，经筛选获得稳定表达E1A基因的转染试验组细胞。③RT-PCR检测E1A基因的mRNA表达、west—ern-blot检测E1A蛋白表达。流式细胞仪观察细胞凋亡率、免疫组化法检测HER-2／neu基因的表达水平，对比各组间的差异。结果 与对照组、空载体组相比，转染E1A基因后，E1ARNA和蛋白表达明显增高。SK-BR-3肿瘤细胞HER-2／neu的表达明显降低，凋亡率增高。结论 本实验成功构建并稳定表达了E1A基因质粒，明显抑制乳腺癌细胞的生长，说明E1A基因在乳腺癌基因治疗中有重要意义，为其临床应用提供了理论和实验依据。     

缺氧诱导因子1α对口腔鳞状上皮癌细胞株接受放射和化学药物治疗感受性的影响

背景：缺氧诱导因子1α是一种转录因子，缺氧环境下对哺乳动物细胞起重要的调控作用。然而缺氧诱导因子1α对口腔鳞状上皮癌细胞株的放疗和化疗感受性的作用有待研究。目的：观察缺氧诱导因子1α对口腔鳞状上皮癌细胞株接受放射和化学药物治疗感受性的影响。设计：观察对比实验。单位：首都医科大学附属北京朝阳医院。材料：口腔鳞状上皮癌细胞株-2，口腔鳞状上皮癌细胞株-4，口腔鳞状上皮癌细胞株-5，和口腔鳞状上皮癌细胞株-6来自人口腔鳞状上皮癌细胞（由日本高知大学医学部口腔外科建株）。方法：本实验于2004—09／2006-08于首都医科大学附属北京朝阳医院完成。将口腔鳞状上皮癌细胞株-2，口腔鳞状上皮癌细胞株-4，口腔鳞状上皮癌细胞株-5，和口腔鳞状E皮癌细胞株-6采用含小牛血清，左旋谷酰胺，青霉素，链霉素的改良DMEM培养液中培养。①从未处理和用30Gyγ射线，100μmol／L顺铂或100μmol／L5-氟脲嘧啶处理后的口腔鳞状上皮癌细胞株中提取细胞核蛋白。采用免疫印迹法检测缺氧诱导因子1α蛋白表达水平，同时采用定量PCR检测缺氧诱导因子1αmRNA的表达。②不同干预条件下细胞增殖抑制情况：将口腔鳞状上皮癌细胞株单细胞悬液以1&;#215;10^4／孔接种于96孔板中，每孔分别加入终浓度为100μmol／L的顺铂或5-氟尿嘧啶，或用30Gyγ射线处理细胞，培养48h后，采用用噻唑蓝比色法检测细胞增殖抑制情况。③不同干预条件下细胞凋亡分析：口腔鳞状上皮癌细胞株细胞用30Gyγ射线，100μmol／L顺铂或100μmol／L5-氟脲嘧啶处理24h后，用Propidium iodide和Annexin V—FITC染色，用流式细胞仪测定凋亡细胞数（仅分析γ射线，顺铂处理组）。④质粒构建和转染：将人缺氧诱导因子1α cDNA克隆至pcDNA3．1／V5-His TOPO表达载体。用脂质转染法将缺氧诱导因子1α cDNA暂时转染口腔鳞状上皮癌细胞株-2细胞。将缺氧诱导因子1α siRNA（有义序列为5’CUGAUGACCAGCAACUUGAtt3’）暂时转染口腔鳞状上皮癌细胞株-5细胞，设立空白对照，同时给于细胞增殖抑制情况观察，以及细胞凋亡分析（仅分析顺铂处理组），方法同前。主要观察指标：①不同口腔鳞状上皮癌细胞株缺氧诱导因子1α的mRNA和蛋白表达情况。②不同干预条件下口腔鳞状上皮癌细胞株增殖抑制及细胞凋亡情况。⑧缺氧诱导因子1α过表达或缺氧诱导因子1α基因敲除的转染细胞的蛋白水平检测。㈤转染细胞和对照口腔鳞状上皮癌细胞株细胞增殖抑制情况和细胞凋亡分析结果。结果：①不同口腔鳞状上皮癌细胞株间缺氧诱导因子1αmRNA和蛋白表达结果：口腔鳞状上皮癌细胞株-2，口腔鳞状上皮癌细胞株-4，口腔鳞状上皮癌细胞株-5和口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞缺氧诱导因子1αmRNA的相对表达水平分别为1、0，2．2，4.3和4．0。缺氧诱导因子1α的细胞总蛋白和细胞核蛋白的表达在口腔鳞状上皮癌细胞株-2和口腔鳞状上皮癌细胞株-4细胞中较弱，而在口腔鳞状上皮癌细胞株-5和口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞中较强。②不同干预条件下口腔鳞状上皮癌细胞株细胞增殖抑制及被诱导凋亡情况：经γ射线，顺铂及5-氟脲嘧啶处理后，口腔鳞状上皮癌细胞株-2细胞数分别下降至（39．5&;#177;3．2）％，（39．2&;#177;1．2）％和（47．9&;#177;3．6）％，口腔鳞状上皮癌细胞株-4细胞数分别下降至（53．9&;#177;6．6）％，（54.3&;#177;1.4）％，（54．8＋3．8）％。口腔鳞状上皮癌细胞株-5细胞数分别下降至（74．1&;#177;3．8）％，（76．5&;#177;9．1）％，（69．6&;#177;7．7）％，口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞数分别下降至（71.4&;#177;7．4）％，（84．4&;#177;8．8）％，（82．0&;#177;4．5）％。顺铂处理后，口腔鳞状上皮癌细胞株-2，口腔鳞状上皮癌细胞株-4，口腔鳞状上皮癌细胞株-5和口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞的凋亡细胞数分别为（50．9&;#177;1.3）％，（67.3&;#177;2．2）％，（12．2&;#177;0．8）％和（38．6&;#177;0．9）％。γ射线处理后，口腔鳞状上皮癌细胞株-2，口腔鳞状上皮癌细胞株-4，口腔鳞状上皮癌细胞株-5和口腔鳞状上皮癌细胞株-6细胞的凋亡细胞数分别为（21．2&;#177;1．1）％，（14．6&;#177;O．9）％，（9．7&;#177;1．0）％和（10．4&;#177;0．8）％。⑧不同干预条件下转染细胞增殖抑制及凋亡情况：经γ射线，顺铂及5-氟脲嘧啶处理后，转染了缺氧诱导因子1α表达载体的口腔鳞状上皮癌细胞株-2细胞数高于对照组（t=-4．693，-8．617，-6．721，P〈0．01）；转染了缺氧诱导因子1α siRNA的口腔鳞状上皮癌细胞株-5细胞数低于对照组细胞（t=5．800，5．595，4．253，P〈0．05～0．011。用顺铂处理24h后，转染缺氧诱导因子-1α的口腔鳞状上皮癌细胞株-2细胞凋亡数为（34．0&;#177;1．9）％，低于空白对照[（49．6&;#177;3．4）％，t=6．937，P〈0．01]。转染缺氧诱导因子1α siRNA的口腔鳞状上皮癌细胞株-5细胞凋亡数为（27．7&;#177;2.3）％。高于空白对照[（11．4&;#177;2．1）％，t=-8．941，P〈0．01]。结论：缺氧诱导因子1α表达与口腔鳞癌细胞对放、化疗感受性之间有负相关性。抑制癌细胞的缺氧诱导因子1α表达能增强癌细胞对放疗、化疗的感受性．     

氦—氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制

目的：探讨氦－氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制。方法：将培养瘢痕成纤维细胞随机分为转染组，转染对照组和非转染,志染组细胞与绿色荧光蛋白（GFP）质粒cDNA，含目的基因片段的表达载体质粒pcDNA3-FADD-DNcDNA共转,志染对照组细胞与GFP质粒cDNA，空载体质粒pcDNA3共转染，非转染组细胞没有进行转染，转染后24h分别对各组细胞进行氦－氖激光照射（100mW/cm^2照射30min)，1次／d，连续照射3d，然而采用TUNEL技术检测细胞凋亡，结果：转染组，转染对照组与非转染组细胞亡率分别为9．27％，15．73％和12．87％，转染组细胞凋亡率明显小于转染对照组（q=4.55,P&;lt;0.01)和非转染组（q＝4.14,P&;lt;0.05)。结论：FADD－DN基因转染能减少氦－氖激光诱导的瘢痕的瘢瘢痕成纤维细胞凋亡，Fas相关死亡域蛋白（FADD）可能是 －激光激活死亡信号途径的基本元件之一。     

JUP对人口腔鳞状细胞癌生物学特性及预后的影响及机制分析

目的分析心肌桥粒盘状珠蛋白(JUP)的表达水平对人口腔鳞状细胞癌细胞的相关生物学特性和预后的影响,并对其影响机制进行探讨。方法回顾性抽取2016年12月至2018年12月格尔木市人民医院口腔科收治的65例口腔鳞状细胞癌患者癌组织及距离癌组织病灶2 cm左右的癌旁组织标本为研究对象。定量即时聚合酶链锁反应(qRT-PCR)检测口腔鳞状细胞癌患者癌组织及癌旁组织中JUPmRNA的表达情况。构建JUP干扰(对照组:未感染细胞组;shNC组:无关序列片段对照组;shJUP组:JUP沉默慢病毒组)和过表达(对照组:未感染细胞组;NC组:空载体对照组;JUP过表达组:过表达组)载体,包装成慢病毒,感染人口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞,建立该基因沉默和过表达的稳转细胞株,并通过qRT-PCR和Western blot分别检测JUP在基因和蛋白水平上的表达情况。CCK-8和细胞划痕实验分别检测两种稳转细胞株的增殖、迁移以及侵袭能力。利用K-M曲线数据库资料分析JUP的表达与口腔鳞状细胞癌病人的预后相关性。结果 JUP基因在口腔鳞状细胞癌中的表达量较癌旁组织显著降低(P <0. 01)。与对照组细胞(sh NC)相比,稳定沉默JUP的人口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113,其增殖能力无显著差异(P> 0. 05);与对照组细胞(shNC)相比,稳定沉默JUP的人口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113(shJUP),其细胞凋亡能力明显降低(P <0. 05);与对照组(NC)相比,划痕愈合实验显示,外源性导入JUP的Tca8113细胞其迁移、侵袭能力显著下降(P <0. 05);K-M曲线结果显示低表达JUP与人口腔鳞状细胞癌病人的不良预后相关。结论 JUP的低表达与口腔鳞状细胞癌病人的转移密切相关,且与口腔鳞状细胞癌病人的不良预后相关。     

esp 1基因上调表达对肺腺癌细胞的生物学效应研究

目的：研究分离酶(seperase/estradiol-stimulated protein,esp1)在Spc-A-l细胞中对染色体分离的作用，为肿瘤的基因治疗探索新的治疗方法。方法：实验于2003-07／12在解放军第三军医大学分子遗传教研室完成。将含esp 1基因的EGFP-N1质粒转染到spe-A-1细胞，构建稳定的细胞系，检测其转染效率及对染色体分裂相的影响。结果：表达载体EGFP-N1-esp 1转染成功，稳定细胞系构建成功，染色体异常分裂相由众数68条减为57条。结论：esp 1的上调表达对于肿瘤的异常染色体分裂相有一定的抑制作用，对于肿瘤治疗有潜在的应用价值。     

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr／abl融合基因的小干扰RNA(siRNA)，并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株，以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照；同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照，流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率；实时定量RT—PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白V(Annexin V)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70％；化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达；特异性siRNA可以抑制细胞增殖，转染24h细胞增殖抑制率达47％，48h达56％；特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15．05％．48h组为19．47％，与对照组(1．00％)比较明显提高。结论在细胞水平上，化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因的表达，为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。     

Rac1基NRNAi慢病毒载体的构建与鉴定

背景：Rac1是通过信号转导来调节癌细胞的侵袭、增殖,它在各种肿瘤中都有表达。目的：构建RAC1基因RNA干扰慢病毒载体,并检测其干扰效率。方法：应用Western blot检测Rac1基因在舌癌细胞中的表达。针对筛选确定的Rac1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pMagic4.1载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后将质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,采用Real-Time PCR筛靶,将筛靶成功的质粒进行慢病毒包装,再感染Tca8113细胞。荧光定量PCR和Western blot检测鉴定Rac1基因表达的干扰效果以确定其生物活性。结果与结论：成功构建了RAC1干扰载体,Western blot检测显著抑制Rac1蛋白表达,经Real-time PCR检测pLVT447的抑制率达70%。成功的构建了Rac1基因RNAi慢病毒载体,为RNAi用于靶向Rac1的基因治疗舌癌（Tca8113）提供了有效的siRNA靶序列。     

骨组织工程中细胞因子基因修饰种子细胞来源研究：转染后骨形态发生蛋白—3成纤维细胞株的稳定表达

背景：骨形态发生蛋白(bone morphogenetic pmtein，BMP)是诱导和促进种子细胞向骨细胞方向转化的最重要的细胞因子之一。天然BMP难溶解于培养基，对培养的种子细胞无法有效发挥作用；可溶性重组BMP虽可溶解于培养基，但价格昂贵，而且难于适时、适量的作用于种子细胞。基因治疗为上述问题的解决提供了新的思路。目的：转染外源BMP—3基因入成纤维细胞，筛选获得稳定表达BMP—3的阳性成纤维细胞克隆。设计：单一样本研究。单位：解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所。材料：成纤维细胞(NIH3T3细胞)由第四军医大学口腔医学院司徒镇强教授提供。方法：2000—04／2003—11在全军重点实验室第四军医大学全军骨科研究所实验室完成。采用脂质体转染的方法将外源BMP—3基因转染入NIH3T3细胞，G418筛选后寻找细胞集落，分离、培养，免疫组织化学鉴定，BMP—3染色阳性者为阳性BMP—3表达细胞克隆。主要观察指标：①NIH3T3细胞筛选浓度。②转染阳性细胞克隆的筛选。③筛选的细胞克隆内BMP—3的表达。结果：成功将BMP—3基因转染入NIH3T3细胞，经免疫组化筛选出阳性BMP—3表达成纤维细胞的克隆，建立了BMP—3稳定表达成纤维细胞株。结论：将BMP—3基因真核表达载体转染入成纤维细胞，并经筛选获得了可稳定表达BMP—3的成纤维细胞株，为将来骨组织工程研究中使用细胞因子基因修饰的种子细胞的研究奠定了一定基础。     

survivin和PTEN基因蛋白在食管鳞状细胞癌的表达及临床意义

目的：探讨食管鳞状细胞癌组织中survivin和PTEN基因蛋白表达与食管鳞状细胞癌生物学行为的关系。方法：应用免疫组织化学方法，检测65例食管鳞状细胞癌组织中survivin和PTEN蛋白表达水平。结果：在食管鳞状细胞癌中survivin和PTEN表达阳性率分别为61．5％（40／65）和58．5％（38／65）。survivin和PTEN表达均与肿瘤分化、浸润、淋巴结转移和预后相关（P〈0．05）。结论：survivin和PTEN异常表达与食管鳞状细胞癌的病理生物学行为密切相关，可作为是预测食管鳞状细胞癌转移潜能和评估食管鳞状细胞癌患者预后的客观指标。     

小鼠CD40L基因的克隆与真核细胞表达研究

目的构建含有小鼠CD40L基因的重组真核表达载体，并鉴定其在转染细胞中的表达。方法自活化的T细胞经RT-PCR得到小鼠CD40L的cDNA基因，将其克隆入真核表达载体pCMV—Myc，获得重组质粒pCMV—Myc／CD40L，酶切及测序鉴定；脂质体法转染CHO细胞，使用RT-PCR及流式细胞技术分别从mRNA和蛋白水平对CD40L的表达进行检测。结果将pCMV-Myc／CD40L真核表达载体转染CHO细胞，RT-PCR和流式细胞仪检测证实小鼠CD40L在真核细胞中暂态表达。结论成功地建立表达小鼠CD40L基因的重组真核表达载体，为进一步研究其生物学特性及肿瘤的基因治疗提供了基础。     

葡萄糖调节蛋白78真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建

背景：葡萄糖调节蛋白78是存在于内质网上最多的分子伴侣蛋白,具有保护细胞对抗细胞调亡的作用。目的：构建携带并正确表达外源性人葡萄糖调节蛋白78基因的重组真核表达载体,建立葡萄糖调节蛋白78基因稳定转染的人视网膜色素上皮细胞系。方法：扩增人葡萄糖调节蛋白78全长编码序列,将该目的基因与真核表达载体PEGFP-N1进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,以PCR方法鉴定阳性克隆,并进行测序和分析比对,获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-grp78。通过阳离子脂质体介导将重组质粒pEGFP-grp78转染入体外培养的人视网膜色素上皮细胞,经G418筛选,建立稳定表达细胞系。结果与结论：体外培养的人视网膜色素上皮细胞株作为真核细胞表达系统,经荧光显微镜和RT-PCR方法检测,G418筛选的稳定转染细胞系中GFP大量表达,葡萄糖调节蛋白78mRNA的表达量是正常视网膜色素上皮细胞的4倍左右,表示脂质体介导的pEGFP-grp78质粒成功转染视网膜色素上皮细胞,并高效稳定表达葡萄糖调节蛋白78。     

靶向BIRC5,Bcl-2siRNA慢病毒表达载体最佳干扰序列的筛选

目的 针对设计合成构建的BIRC5和Bcl-2小分子干扰RNA(siRNA)的慢病毒质粒表达载体进行有效靶序列筛选,探讨其对靶基因的封闭和抑制作用.方法 将BIRC5和Bcl-2 siRNA慢病毒质粒表达载体通过脂质体介导,分别转染体外培养的Tca-8113细胞.采用半定量RT-PCR检测转染细胞BIRC5和Bcl-2 mRNA表达及Western blot检测蛋白表达水平.结果 BIRC5和Bcl-2 mRNA抑制率分别为35%～76%和30%～72%,所设计的siRNA序列不同程度降低和下调其mRNA及相应的蛋白表达,实验组与对照组比较差异有统计学显著性意义(P<0.05),阴性对照组无此作用(P>0.05).结论 设计合成的siRNA干扰序列能抑制其靶基因mRNA和蛋白的表达,不同的干扰靶点其抑制效果不同,本实验成功筛选出两对最佳干扰序列作为对肿瘤细胞基因治疗的实验研究.     

肿瘤抑制蛋白 FBW7在口腔鳞状细胞癌中表达的研究

目的检查肿瘤抑制蛋白FBW7在鳞状细胞癌（ OSCC）中的表达,初步探究FBW7表达与OS-CC细胞克隆形成能力的关系。方法收集19例OSCC患者的癌巢组织及对应癌旁组织,应用免疫组化染色与Real time RT-PCR技术检测FBW7在癌巢及对应癌旁组织中的表达情况。 Western blot 和Real time RT-PCR技术比较口腔鳞状细胞癌细胞系KV、CTST-1、CTST-2以及正常颊黏膜上皮细胞中FBW7蛋白和mRNA表达水平,分析FBW7表达与口腔鳞状细胞癌细胞系克隆形成能力的关系。结果免疫组化和Real time RT-PCR结果显示,FBW7蛋白及mRNA在对应癌旁组织中的表达水平明显高于癌巢组织（P＜0.05）,West-ern blot及Real time RT-PCR结果显示,FBW7蛋白和mRNA在口腔鳞癌细胞系中的表达水平明显低于正常口腔黏膜上皮细胞（ P＜0.05）。克隆形成实验结果表明, FBW7表达较高的舌癌细胞株的克隆形成数目较少,克隆形成能力较弱。结论 FBW7在口腔鳞状细胞癌组织和细胞系中表达显著降低,与口腔癌细胞系的克隆形成能力呈负相关。     

舌癌舌颌颈联合根治术患者28例的围术期护理

舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，男性多发，多数为鳞状细胞癌，特别是舌前2／3部位，由于舌体活动频繁，并有丰富的淋巴管和血循环，极易发生转移。治疗多采用综合治疗，手术为主要治疗方法。由于手术范围大，手术时间长，手术的危险性及术后并发症的发生也相应增加，护理工作的质量直接影响到治疗效果。2004年5月至2007年5月，本院对28例舌癌患者行舌颌颈联合根治术，现将术后护理体会报道如下。     

乙肝病毒S2S蛋白表达质粒NV—HB／s2s长期稳定转染细胞系（SP2／0—S2S）的建立

目的：建立乙肝病毒S2S蛋白表达质粒NV－HB／s2s转染小鼠骨髓瘤细胞SP2／0的长期稳定转染细胞系,为后期检测乙肝核酸疫苗的细胞免疫效果提供靶细胞。方法：利用改良磷酸钙法将NV－HB／s2s转染入SP2／0细胞,用G418抗性筛选粗筛出16株单克隆细胞株,分别用ELISA、Western-Blot、斑点杂交、细胞免疫组化、细胞原位杂交等方法检测目的抗原蛋白的表达及NV－HB／s2s在细胞中是否存在及定位。结果：获得一株NV－HB／s2s长期稳定转染的单克隆细胞株SP2／0－S2S,在细胞中检出了乙肝病毒HBsAg、preS2Ag的表达,并在细胞核中检出了NV－HB/s2s。结论：建立了乙肝病毒S2S蛋白表达质粒NV－HB／s2s转染小鼠髓瘤细胞SP2／0的长期稳定转染细胞系。     

人半月板纤维软骨细胞对人胰岛素样生长因子Ⅰ的效应反应

背景：人类半月板纤维软骨细胞可能会对有积极生物学效应的生长因子产生反应，例如人胰岛素样生长因子Ⅰ，半月板细胞也可能会成为将来临床基因治疗的有效供体。目的：拟观察人半月板纤维软骨细胞对人胰岛素样生长因子Ⅰ的效应反应。设计、时间及地点：开放性实验，于200710／200804在青岛大学附属医院骨科实验室完成。材料：收集半月板撕裂和盘状半月板患者关节镜手术中切取的半月板组织用于人半月板纤维软骨细胞培养。方法：利用聚合酶链式反应从人肝细胞cDNA文库中获得人胰岛素样生长因子Ⅰ基因，将其克隆入双顺反子真核表达载体pIRES2，EGFP中。将关节镜手术中切取的成人半月板组织，体外进行分离培养。利用阳离子脂质体FuGene6将人胰岛素样生长因子Ⅰ转染入人半月板纤维软骨细胞中。主要观察指标：转染人胰岛素样生长因子Ⅰ后增强型绿色荧光蛋白的表达；检测细胞上清中人胰岛素样生长因子Ⅰ的分泌浓度；流式细胞仪检测细胞转染后的变化。结果：基因测序及酶切，聚合酶链反应等均证实人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的正确克隆，并形成正确的真核表达载体plRES2-EGFP-hIGF—Ⅰ。人半月板纤维软骨细胞在接种40h后贴壁并伸展为成纤维细胞样，三角形或多角形外观。增强型绿色荧光蛋白的表达逐渐增加，在转染后56h达到峰值。细胞上清中人胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白质的浓度变化趋势类似增强型绿色荧光蛋白的表达，峰值可达22．68μg／L。蛋白免疫印迹、反转录聚合酶链反应和免疫组织化学染色均证实人胰岛素样生长因子I蛋白质的存在。转染后部分细胞表型发生变化，增殖加速。流式细胞仪检测转染后S期细胞比例增多。结论：人类半月板纤维软骨细胞可被阳离子脂质体安全有效地转染，转染的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因可分泌较高水平的生长因子并加速细胞的增殖。