感染性疾病多学科交叉研究专题基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在病原菌鉴定中的应用

目的 探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)在快速鉴定血流感染病原菌的应用价值,并分析MALDI-TOF MS方法鉴定病原菌的准确性.方法 收集321例血流感染患者的血液标本进行血培养,微生物室细菌培养结果均为阳性.从血培养阳性瓶中取病原菌至分离胶促凝管中,应用MALDI-TOF MS对富集的病原菌进行菌种鉴定.同时,对血培养瓶中的阳性标本进行常规培养,获得的纯菌落采用VITEK 2 COMPACT微生物分析系统进行检测,并将MALDI-TOF MS检测结果与VITEK 2 COMPACT结果进行对比.若检测结果有差异,则进一步进行基因测序法予以确定.结果 321例阳性血培养标本中共分离出180株革兰阴性杆菌,MALDI-TOF MS鉴定准确率为97.78％,无鉴定错误,但4株无鉴定结果;分离出的141株革兰阳性菌中,主要以革兰阳性球菌为主,MALDI-TOF MS鉴定准确率为84.39％,1株蜡样芽胞杆菌误鉴定为大肠埃希菌,出现了菌属水平鉴定错误,其余为种类鉴定错误.结论 与传统血培养及生化鉴定比较,MALDI-TOF MS在血流感染中的鉴定符合率较高,且鉴定方法简便、迅速.     

MALDI-TOF MS在临床微生物检测中的应用

目的探讨应用基质辅助激光解吸电离飞行时间技术质谱(MALDI-TOF MS)在临床微生物快速检测中的应用价值。方法收集新疆昌吉回族自治州人民医院近两年的分离菌株525株,分别分离自痰、尿、血液、分泌物、脓液等临床标本,其中革兰阴性(G-)细菌225株,革兰阳性(G+)细菌225株,酵母菌75株。将MALDI-TOF MS与VITEK2 Compact全自动微生物分析系统(VITEK2 Compact)鉴定结果进行比较。结果 G-细菌鉴定符合率为96.4%(217/225),G+细菌鉴定符合率为94.2%(212/225),酵母菌鉴定符合率为94.7%(71/75)。结论 MALDI-TOF MS技术快速、简便、准确且价格低廉,在快速鉴定临床常见病原菌方面,尤其是在危重症患者的快速检测方面具有广阔的应用前景,为临床救治争取了宝贵的时间。然而目前该技术的应用仍有一定的局限性,其检测的准确性受被测菌纯度、实验操作等影响,且对某些菌种的鉴定准确性不高,对病毒检测的过程较复杂[1],因此MALDI-TOF MS技术仍需进一步的探索研究。     

MALDI-TOF MS结合短时培养法在阳性血培养病原菌鉴定中的临床应用

目的评估基质辅助激光电离解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)结合短时培养法在阳性血培养病原菌鉴定中的应用价值。方法前瞻性收集北京友谊医院2017年3月至10月的162例单一病原菌血培养阳性标本,取3 ml培养液离心后刮取分离胶表层浓集的病原菌,血平板培养1~4 h,直接用菌膜涂靶板,MALDI-TOF MS菌株鉴定,同时与常规培养后再鉴定的传统方法比较菌种鉴定结果的准确性。结果共收集革兰阳性细菌73株,革兰阴性细菌89株。与传统培养法相比,MALDI-TOF MS结合短时培养法的鉴定时间由1~2 d缩短至1~4 h,革兰阳性细菌和革兰阴性细菌的鉴定准确率分别为87.7%和98.9%。结论用MALDI-TOF MS结合短时培养法可以大大缩短阳性血培养病原菌鉴定时间,尤其适用于革兰阴性杆菌所致的血流感染。该方法操作简单,结果可靠,有良好的临床应用价值。     

AUTOF MS 1000 质谱鉴定系统对临床实验室常见菌株鉴定能力的评估

目的　评估Autof MS 1000 质谱鉴定系统对临床实验室常见菌株的鉴定能力。方法　参考CLSI M52 标准对 Autof MS 1000 质谱鉴定系统进行评估。菌株鉴定的评估指标包括准确度和精密度。准确度评估以Bruker MALDI-TOF 作为参比设备,以Autof MS 1000 为待评估设备,选取231 株能够涵盖实验室80% ～ 90% 的常见分离菌株及1 株室间 质评菌株作为检测标本,包括革兰氏阳性需氧菌77 株,革兰氏阴性需氧菌95 株,厌氧菌30 株,酵母样真菌30 株,待 评估设备鉴定结果与参比设备鉴定结果一致时判断为相符,若结果不一致则以测序方法（细菌为16S RNA,真菌为ITS 区测序）鉴定结果为准。精密度评估为选取12 株室内质控菌株和临床分离菌株作为检测标本,在Autof MS 1000 质谱 鉴定系统上进行重复性测试,每株菌重复检测3 次,判断其鉴定结果的一致性。以准确度大于90％、精密度大于95％ 为判断合格标准。结果　232 株临床实验室常见分离菌株鉴定结果准确度为100%;12 株室内质控菌株和临床分离菌株 重复性检测结果的精密度为100%。结论　Autof MS 1000 质谱鉴定系统对临床实验室常见菌株鉴定的准确度和精密度 都很高,并且具有快速、低耗及易操作等优势,建议可在临床微生物实验室推广使用。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术鉴定临床非发酵革兰阴性杆菌

目的 比较基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)和Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定系统对临床分离非发酵革兰阴性杆菌鉴定的一致性。方法 收集徐州医科大学附属医院2015年11月至2016年3月临床分离非发酵革兰阴性杆菌537株;分别采用MALDI-TOF MS和Vitek 2Compact全自动细菌鉴定系统进行鉴定,并比较分析两种鉴定方法结果的一致性。结果 在537株非发酵革兰阴性杆菌中,MALDI-TOF MS可将527株(98.1%)鉴定至种,10株仅鉴定至属;Vitek 2 Compact可将537株(100%)全部鉴定至种。MALDI-TOF MS与Vitek 2 Compact鉴定结果相比较,在种的水平上520株(96.8%)一致,在属的水平上533株(99.3%)一致,两种方法鉴定结果完全不一致4株(0.7%)。结论 MALDI-TOF MS对临床分离非发酵革兰阴性杆菌具有较好的鉴定能力,其快速准确及价廉的特性具备临床推广价值。     

MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性病原的临床应用

目的了解基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)直接快速检测血培养报阳样本的可行性。方法收集同济大学附属同济医院报阳血培养样本682例,从血培养瓶直接抽取血液至分离胶采血管离心富集细菌后,采用MALDI-TOF MS进行直接鉴定(快速质谱法)。同时对报阳血培养标本进行涂片镜检及转种培养后,分别采用Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏仪及MALDI-TOF MS对培养菌落进行鉴定,比较两者鉴定结果的一致性,结果不一致的菌株采用16S rDNA基因测序进行验证。结果682例血培养阳性样本中,有664例检出单数菌,其中539例(81.2%)快速质谱法可准确鉴定(种/属),122例(18.4%)未鉴定出(种/属),仅3例(0.5%)鉴定错误,分别为泛菌属、肺炎克雷伯菌和头状葡萄球菌。664株菌株中,革兰阴性菌367株,革兰阳性菌286株,念珠菌11株,以转种培养后质谱鉴定结果为标准,革兰阴性菌、革兰阳性菌、念珠菌快速质谱法的鉴定准确率(种/属)分别为85.8%/6.0%、65.0%/3.1%、63.6%/0;革兰阴性杆菌的鉴定准确率显著高于革兰阳性球菌和真菌,差异有统计学意义(χ²=57.967,P<0.01;χ²=7.21,P<0.05)。革兰阴性菌中,肠杆菌科、非发酵菌及其他革兰阴性菌鉴定准确率(种/属)分别为89.0%/5.0%、65.0%/10.0%、66.7%/22.2%。革兰阳性菌中,葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属和其他革兰阳性菌鉴定准确率(属/种)分别为70.9%/1.1%、71.4%/2.4%、40.5%/10.8%、50%/7.1%。有18例样本检出复数菌,快速质谱法从其中14例中检出复数菌,鉴定准确率为77.8%,均只鉴定到种。结论快速质谱法检测血培养报阳样本具有可行性,对单数菌的鉴定错误概率非常低,且对临床常见病原菌鉴定准确率均>70%。但对复数菌鉴定效果不佳。临床可根据实际需求选择合适的细菌鉴定方法。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱微生物鉴定系统性能验证方案的建立

目的建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)在常规临床微生物鉴定中的性能验证方法,指导临床实验室规范微生物鉴定程序。方法选取标准菌株、质控菌株和临床菌株共115株,包含革兰阳/阴性球菌30株、革兰阳/阴性杆菌31株、真菌30株,厌氧菌、苛养菌各12株,所有菌株均经Vitek Compact鉴定和/或细菌16S r DNA、真菌ITS DNA测序分析验证。任意选择3种MALDI-TOF MS微生物鉴定系统厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱,采用检测系统推荐方法进行菌株鉴定,进行准确度验证试验。精密度验证:选取标准菌株和临床菌株10株,1位操作者使用3个检测系统对10株菌株分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d; 3位操作者使用3个检测系统对10株菌株每d分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d,从而验证鉴定结果的重复性。结果厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱对标准/质控菌株(除外厌氧菌)的鉴定符合率为100%;对临床菌株的属水平鉴定符合率为100%;对革兰阴/阳性杆菌的种水平鉴定符合率分别为100%、100%、96.77%;对革兰阳性球菌的种水平鉴定符合率分别为96.67%、96.67%、100%;对真菌的种水平鉴定符合率均为90%一致;对苛养菌的种水平鉴定符合率均为100%;对厌氧菌鉴定符合率为91.67%种水平一致。精密度验证试验结果重复性100%。结论 3种MALDI-TOF MS系统在革兰阳/阴性球菌、革兰阳/阴性杆菌、真菌、苛养菌鉴定的准确度和精密度符合要求,验证通过。本文建立的微生物鉴定质谱仪性能验证方案可满足综合性医院临床微生物实验室常规鉴定基本要求。     

梅里埃MALDI-TOF-MS 系统与VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定仪对临床常见病原菌鉴定的一致性分析

目的　分析梅里埃基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）系统与VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定仪对临床常见病原菌鉴定的一致性。方法　收集福建医科大学孟超肝胆医院2018 年6 月~ 2019 年3 月来自临床不同标本分离的非重复菌株300 株,分别采用梅里埃MALDI-TOF-MS 系统和VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定仪对病原菌进行鉴定,结果不一致菌株采用16SrDNA 基因测序予以确认,比较两种鉴定方法的准确性与一致性,评估两种方法在鉴定16 株大肠埃希菌的时间和经济成本。结果　300 株临床分离菌中,鉴定到种水平的菌株MALDI-TOF-MS 有268 株(89.33%),VITEK 2 Compact 有266 株(88.67%);鉴定到属水平的菌株MALDI-TOF-MS 有297 株(99.00%),VITEK 2 Compact 有297 株(99.00%);两种方法在种属鉴定的一致性分别为82.67% 与98.33%,MALDI-TOF-MS 的准确性略高于VITEK 2 Compact。两种方法鉴定不一致菌株有39 株(13.00%),与16SrDNA 测序鉴定结果相比,MALDI-TOF MS 的准确率(79.49%) 高于VITEK 2Compact(58.97%)。对16 株大肠埃希菌的鉴定,MALDI-TOF-MS 耗时较VITEK 2 Compact 少3.5h,且成本仅为VITEK2 Compact 的2/5。结论　MALDI-TOF MS 与VITEK 2 Compact 对于临床常见病原菌的鉴定结果较为一致,但MALDITOFMS 准确率更高,且更快速与经济。     

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在病原菌鉴定中的应用

目的探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)在快速鉴定血流感染病原菌的应用价值,并分析MALDI-TOF MS方法鉴定病原菌的准确性。方法收集321例血流感染患者的血液标本进行血培养,微生物室细菌培养结果均为阳性。从血培养阳性瓶中取病原菌至分离胶促凝管中,应用MALDI-TOF MS对富集的病原菌进行菌种鉴定。同时,对血培养瓶中的阳性标本进行常规培养,获得的纯菌落采用VITEK 2 COMPACT微生物分析系统进行检测,并将MALDI-TOF MS检测结果与VITEK 2 COMPACT结果进行对比。若检测结果有差异,则进一步进行基因测序法予以确定。结果 321例阳性血培养标本中共分离出180株革兰阴性杆菌, MALDI-TOF MS鉴定准确率为97.78%,无鉴定错误,但4株无鉴定结果;分离出的141株革兰阳性菌中,主要以革兰阳性球菌为主, MALDI-TOF MS鉴定准确率为84.39%, 1株蜡样芽胞杆菌误鉴定为大肠埃希菌,出现了菌属水平鉴定错误,其余为种类鉴定错误。结论与传统血培养及生化鉴定比较, MALDI-TOF MS在血流感染中的鉴定符合率较高,且鉴定方法简便、迅速。     

应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定常见细菌和酵母菌

目的 应用MALDI-TOF MS鉴定临床常见病原菌.方法 复苏560株临床分离株,其中革兰阳性细菌(G+ )260株、革兰阴性细菌(G-)180株、酵母菌60株、肠道致病菌60株.MALDI-TOF MS鉴定结果与Vitek2 Compact全自动微生物鉴定系统比对,结果差异菌株采用16S rDNA测序验证.结果 MALDI-TOF MS与Vitek2 Compact鉴定结果比较,G+细菌鉴定符合率为94.6％( 246/260),G-细菌鉴定符合率为96.7％ (174/180),酵母菌鉴定符合率为95.0％ (57/60),肠道致病菌鉴定符合率为93.3％( 56/60).15株鉴定结果不符的菌株经16S rDNA测序确认,结果与Vitek2Compact和MALDI-TOF MS鉴定符合率分别为26.7％ (4/15)和66.7％( 10/15).结论 MALDI-TOF MS可用于常见病原微生物鉴定,其快速、低成本的特点具有推广价值.     

串联质谱和高效液相色谱-串联质谱二次筛查联合应用于新生儿MMA筛查

目的探讨串联质谱和高效液相色谱-串联质谱二次筛查联合应用在甲基丙二酸血症(MMA)中的筛查价值。方法收集新生儿串联质谱初筛结果中C3、C3/C2、C3/C0单一或多个指标异常的新生儿干血滤纸片标本,用高效液相色谱-串联质谱的方法定量检测原始血片中甲基丙二酸、甲基枸橼酸和高半胱氨酸,对二次筛查后疑似阳性的新生儿进行召回复查,并进行尿气相色谱/质谱检测。临床诊断患儿进一步予以基因检测进行确诊。结果共收集423例C3、C3/C2、C3/C0单一或多个指标异常的新生儿筛查标本,初筛阳性率约为1%,行联合筛查检测结果发现8例标本中甲基丙二酸和同型半胱氨酸表达水平明显升高,召回复查尿气相色谱质谱提示甲基丙二酸轻度升高。结论串联质谱和高效液相色谱-串联质谱联合应用可以提高新生儿MMA筛查的阳性预测值、降低假阳性率,在新生儿遗传代谢病筛查中具有重要价值。     

LC–MS/MS progress in newborn screening

Newborn screening programs detect treatable disorders in infants before they become symptomatic. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) has greatly increased the screening possibilities by monitoring levels of amino acids and acylcarnitines. After the initial screening step, LC–MS/MS can also be used in screening positive samples as a second tier test to differentiate between true and false positive samples.As the list of disorders screened for by LC-tandem MS increases, questions arise about screening for untreatable disorders, such as some lysosomal storage diseases (LSDs). For LSDs screening methods are being developed and tested more quickly than treatments are becoming available. This goes against one of the main tenets of newborn screening which requires that a treatment be available.LC–MS/MS can detect several disorders with a single injection, which is important in high throughput laboratories. Measuring different amino acids and acylcarnitines can be used to detect up to 45 different inherited disorders depending on how diseases are counted. The LSD assays are designed in a similar way to detect multiple disorders with common sample preparation and a single injection. The clinical implications of applying this technology to NBS on a large scale in many jurisdictions across the world are discussed.     

LC-MS/MS systematic toxicological analysis: comparison of MS/MS spectra obtained with different instruments and settings

OBJECTIVES: To compare the mass spectra obtained using a linear-ion-trap (LIT) tandem mass spectrometer (QTRAP) operated in the "enhanced product ion scan" (EPI) mode with those obtained in the classical triple-quadrupole product ion scan (PIS) mode run on the same as well as on two other instruments (TSQ-Quantum and Quattro-Micro). DESIGN AND METHODS: After tentative standardization of ion fragmentation and transmission in both polarities using a reference compound (glafenine) on the three instruments, eight test compounds detected in the positive mode and five in the negative mode were systematically infused in different ionization sources and spectral acquisition performed over approximately 5 s. The relative intensity of the ions present in the resulting spectra was quantitatively and statistically compared. Also, the intra-day and inter-day variabilities of these relative intensities, as well as the effect of increasing compound concentration, were studied using QTRAP operated in EPI mode. RESULTS: The EPI and PIS modes operated on a single LIT MS/MS instrument resulted in significant differences in relative ion intensities in both polarities, and so did the other two instruments despite prior standardization with glafenine. Some fragments could be absent in certain spectra, but no unexpected or unique fragments showed up. Intra-day variability was smaller in the LIT EPI than in the regular PIS mode and in the positive than in the negative polarity. In EPI mode, both intra- and inter-day variabilities increased when the relative intensity decreased. The effect of increasing concentration on the relative intensity of major and minor ions was small but significant in both polarities. Finally, contamination and cleansing of the ionization source also had noticeable effects on MS/MS spectra, though the cause is unclear. CONCLUSIONS: MS/MS spectra do not offer the expected inter-instrument reproducibility despite an attempt at standardizing the fragmentation conditions using a reference compound. However, although the inter-instrument differences in ion relative intensity were significant, the spectra obtained looked almost similar. This suggests that in library searching algorithms, higher weight should be assigned for the m/z ratios than for their relative intensity in the spectra.     

Continence in MS

Urinary and faecal incontinence can be problems in patients with multiple sclerosis. This article updates readers on the types of MS and its medical management and examines the products and drugs available in the treatment of incontinence.     

ID-LC/MS/MS方法测量血清未结合雌三醇的协作研究

摘要：目的用同位素稀释液相色谱串联质谱（ID-LC/MS/MS）候选参考方法进行实验室间血清未结合雌三醇（uE3）协作研究,通过该研究进一步确认方法的性能特征（正确度和精密度）,并将该方法在国内参考实验室推广,推动uE3标准化进程。方法依据ISO/WD 15725-1和GB/T 6379标准,拟定我国血清uE3协作研究方案。协作研究分为两个阶段：初步试验和正式试验,共9家参考实验室参加。按要求收集5个浓度水平样品并进行均匀性评价,分发到各实验室,每个样品重复测量5次,连续测量3天。计算各实验室测量结果的偏移和精密度。测量结果采用格拉布斯（Grubbs）检验和柯克伦（Cochran）检验,识别离群值和离群实验室。根据合格实验室的结果计算靶值,并向离群实验室和偏出允许范围的实验室提供整改建议。结果（1）样品均匀性评价,所有样品测量结果计算F值均小于F0.05（9, 20）临界值,样品中uE3是均匀的。（2）初步试验：Grubbs检验,1个实验室测量结果为离群值;Cochran检验2个实验室检验结果为离群值。剔除离群值后计算靶值,分别为2017E301:（22.08&#177;0.24）nmol/L;2017E302：（33.46&#177;1.67）nmol/L。2个实验室结果超出允许范围。（3）正式试验：Grubbs检验,所有实验室测量结果均未检出离群值。Cochran检验3个实验室数据出现离群值。剔除离群值后计算靶值,分别为2017E303:（10.36&#177;0.35）nmol/L;2017E304:（15.47&#177;0.26）nmol/L;2017E305:（46.97&#177;1.19）nmol/L。;各实验室间测量结果不精密度分别为（1.14%～2.21%,0.79%～1.93%,0.60%～2.09%）,测量结果偏移分别为（-6.18%～4.83%,-2.26%～2.39%,-4.19%～4.07%）。结论通过组织开展协作研究,确认了各参考实验室通过协作研究方案能够快速建立并运行uE3候选参考方法,除个别实验室外各实验室的检测性能满足预定要求（不精密度&lt;3.0%,偏移&lt;7.5%）,进一步确认了该方法的性能和各实验室运行参考方法的能力。通过初步研究和正式研究对研究方案的各实验环节进行了验证和完善;推动了uE3项目参考方法在我国参考实验室的运行,为后续厂商试剂主校准品联合定值或标准物质研制搭建了平台,促进uE3项目的标准化。