食管鳞癌细胞中五聚素3基因的表达及甲基化

目的研究食管鳞状细胞癌(ESCC)中五聚素3(PTX3)基因的表达以及基因启动子区甲基化状态对其表达的影响。方法采用RT-PCR、甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐测序等方法对ESCC细胞进行检测PTX3基因mRNA的表达、基因启动子区甲基化状态。应用甲基转移酶抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-DC)去甲基化处理对该基因表达的影响。结论 RT-PCR结果显示PTX3 mRNA在细胞株TE-11、EC109、EC9706、KYSE30、KYSE510均不表达,在KYSE410,Het-1A细胞株中有PTX3 mRNA表达。MSP结果显示TE-11、EC109、EC9706、KYSE30、KYSE510存在PTX3基因甲基化,而KYSE410,Het-1A细胞株中不存在PTX3基因甲基化。甲基化测序结果进一步证实了MSP结果结果,28个CpG位点中,TE-11、EC109、EC9706、KYSE30、KYSE510甲基化程度分别为64.3%,81.0%,94.5%,78.5%及81.0%,而KYSE410,Het-1A不存在甲基化。ESCC细胞株PTX3基因启动子处于异常的高甲基化状态,经5-Aza-DC处理后,高甲基化的PTX3基因启动子去甲基化,处理前PTX3基因启动子高甲基化的细胞株其mRNA均不表达,去甲基化处理后能重新激活该基因表达。结论 PTX3基因启动子高甲基化是PTX3表达失活的主要原因之一,PTX3基因启动子甲基化检测可作为ESCC的潜在肿瘤标志物之一。     

ROCK抑制剂对TE13细胞生长及迁移能力的影响

目的通过在体外用Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶(ROCK)特异性抑制剂Y-27632处理人食管癌细胞株TE13,观察Y-27632对TE13的生长及迁移能力的影响,并探讨其可能机制。方法体外培养人食管癌株TE13,分别用不同浓度的Y-27632(2.5、5、10、20μmol/L)处理细胞24 h,对照组加等体积PBS,采用细胞计数、MTT检测细胞生长情况,采用划痕实验观察细胞的迁移能力,采用Western blot检测小窝蛋白(cav)-1的表达水平。结果 Y-27632可以促进细胞的生长与迁移能力,随着时间的增加促进效果越明显,与对照组比较存在明显差异(P<0.05)。Y-27632可以上调cav-1表达水平。结论 ROCK信号通路参与TE13细胞生长与迁移的调节,Y-27632可以增加TE13细胞的生长及迁移能力,其机制可能与上调cav-1的表达有关。     

敲减microRNA-205靶向PTEN抑制食管癌细胞TE1的增殖并促进细胞凋亡

目的:探讨miRNA-205对食管癌细胞株TE1增殖和凋亡能力的影响及其作用机制。方法:实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western印迹检测正常食管黏膜细胞Het-1A和不同食管癌细胞株(KYSE70,TE12,TE1)中miRNA-205的mRNA及蛋白表达水平。转染miRNA-205抑制剂下调TE1细胞中miRNA-205的表达,采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖能力、细胞周期和细胞凋亡情况;Western印迹检测细胞增殖和细胞凋亡相关CDK2,cyclin D1,P21,Bcl-2,cleavedcaspase-3,caspase-3,p-Rb,Rb,p-Akt和Akt的蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因分析法预测及验证其可能的靶基因。结果:MiRNA-205在各型食管癌细胞中高表达。沉默miRNA-205后,TE1细胞的增殖能力降低并表现为细胞周期阻滞,而细胞凋亡率显著升高(P0.05)。同时细胞中cyclinD1,CDK2,bcl-2,p-Rb及p-Akt的蛋白表达水平均显著降低,p21及cleaved-caspase-3的蛋白表达水平显著升高。双荧光素酶报告基因分析显示PTEN是miRNA-205的可能作用靶点,TE1中共转染miRNA-205抑制剂和PTENsiRNA可部分逆转miRNA-205介导细胞增殖抑制及凋亡诱导作用。结论:沉默miRNA-205可靶向PTEN抑制食管癌细胞株TE1的增殖,并促进其凋亡,提示miRNA-205可作为食管癌诊疗的一个潜在作用靶点。     

中晚期食管癌AKR1C3、LEF1表达与放疗敏感性及预后的关系分析

目的研究中晚期食管癌醛固酮类还原酶家族1成员C3(AKR1C3)、淋巴细胞增强结合因子1(LEF1)表达与放疗敏感性及预后的关系。方法回顾性选择2017年1~12月期间唐山市人民医院收治的中晚期食管癌并接受调强放疗的患者作为研究对象。采用免疫组织化学检测食管癌中AKR1C3、LEF1的表达。放疗4周后,根据疗效评估结果分为放疗敏感组49例,放疗抵抗组25例。比较放疗敏感组与放疗抵抗组AKR1C3及LEF1表达、临床病理特征的差异。Logistics回归分析放疗敏感性影响因素。随访生存情况,比较不同AKR1C3、LEF1表达的食管癌患者预后差异。结果放疗抵抗组患者食管癌中AKR1C3及LEF1的阳性率、肿瘤最大横径≥4 cm及低未分化的患者比率分别为80.00%、84.00%、48.00%、56.00%,显著高于放疗敏感组(44.90%、48.98%、22.45%、30.61%),差异有统计学意义(P<0.05);经Logistics回归分析,AKR1C3、LEF1、肿瘤最大横径、分化程度是放疗敏感性的影响因素(P<0.05);经Kaplan-Meier曲线分析,AKR1C3及LEF1阳性表达的食管癌患者累积生存率低于AKR1C3、LEF1阴性表达的食管癌(P<0.05)。结论中晚期食管癌中AKR1C3、LEF1阳性表达与放疗抵抗及生存时间缩短有关。     

鼻咽癌细胞放射敏感性与Bcl-2及Bak表达的关系

目的:探讨鼻咽癌细胞株放射敏感性与Bcl-2及Bak蛋白表达的关系。方法:利用免疫荧光技术及流式细胞仪检测Bcl-2及Bak蛋白在两株鼻咽癌细胞株中的表达,并检测照射后Bcl-2、Bak的阳性表达率以及细胞凋亡率。结果:免疫荧光显示两株鼻咽癌细胞中均存在Bcl-2及Bak蛋白的表达,并主要定位于细胞浆中;照射前两株鼻咽癌细胞Bcl-2的表达率分别为CNE-1(87.6±1.2)%,CNE-2(87.7±0.8)%,Bak的表达率分别为CNE-1(11.5±0.8)%,CNE-2(13.5±0.9)%;照射后两株鼻咽癌细胞的凋亡率及Bak的表达随时间变化呈上升趋势,二者呈正相关,而Bcl-2的表达变化与细胞凋亡率的变化无明显相关。结论:在鼻咽癌细胞株CNE-1及CNE-2中,细胞的内在放射敏感性与Bak的表达相关,而与Bcl-2的表达无明显相关。     

spo0A对艰难梭菌毒素A/B蛋白表达的调节作用

目的研究spo0A基因对艰难梭菌毒素A和毒素B蛋白表达的调控作用。方法采用ClosTron基因敲除技术构建艰难梭菌C25菌株spo0A基因突变模型。实时定量反转录PCR方法测不同生长时期(培养后5、12、24、48 h)突变株和亲代株的毒素基因tcdA、tcdB和毒素调控基因tcdC、tcdR、tcdE的表达量,分别用酶联免疫吸附试验(ELISA)和细胞毒中和试验测定细菌培养液中毒素A和毒素B的含量。结果C25菌株spo0A基因突变株在培养5、12、24 h后,其毒素A和毒素B的含量均明显高于亲代株,培养后48 h突变株毒素A含量高于亲代株,毒素B含量与亲代株无明显差异。spo0A基因突变株在培养12、24、48 h后,tcdA、tcdB、tcdE、tcdR基因表达量均高于亲代株;突变菌株tcdC基因的表达无明显高于或低于亲代株。结论spo0A基因对艰难梭菌毒素A和毒素B的表达起负调控作用,其作用可能与抑制tcdE、tcdR基因的表达相关。     

T24膀胱癌细胞ARID1A基因的表达与细胞增殖活力相关性研究

目的探讨AT丰富结合域1A(ARID1A)基因的表达与膀胱癌细胞T24增殖活力的关系,为进一步基因功能研究提供基础。方法利用梯度稀释法分离获得膀胱移行癌细胞系T24的高增殖亚克隆细胞株,体外评价细胞株和亲代细胞系增殖活力差异,检测细胞周期调控基因CCND1和膀胱癌肿瘤干细胞标志因子CD44。检测染色质重建复合物SWI/SNF亚基基因ARID1A在亚克隆和亲代细胞系的转录表达水平差异。结果分离得到65个T24的亚克隆细胞株,其中T24-9亚克隆细胞株不同于亲代的梭形形态,呈细小的圆形形态,增殖能力明显强于亲代,CC-ND1、ARID1A和CD44的mRNA表达量均有增加。结论 T24细胞系中的含有高增殖活力的干细胞细胞亚群,染色质重建复合物基因ARID1A转录活跃,可能增加ARID1A突变的风险。     

沉默Gab1抑制人胆管癌TFK-1细胞增殖的可能机制

目的探讨沉默Grb2相关结合蛋白1(Grb2-associated binding proteins 1, Gab1)提高放射线照射效果对人胆管癌TFK-1细胞增殖的抑制作用及可能机制。方法对数生长期人胆管癌TFK-1细胞随机分为放射组(转染小干扰RNA-NC质粒)、观察组(转染小干扰RNA-Gab1质粒)和对照组(转染小干扰RNA-NC质粒)。转染后培养48 h,放射组、观察组应用8 Gy X线照射24 h,对照组不进行X线照射。取X线照射24 h的细胞,采用CCK-8法检测细胞活力,平板细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力,实时荧光定量PCR法检测Gab1 mRNA相对表达量,Western Blot法检测Gab1、PI3K、Akt蛋白相对表达量。结果 X线照射24 h,放射组、观察组细胞活力吸光度值(0.52±0.05、0.41±0.04)、细胞增殖形成的菌落数[(214.32±6.47)、(164.34±6.03)个]、Gab1 mRNA相对表达量(4.05±0.36、0.83±0.18)、Gab1蛋白相对表达量(3.05±0.36、2.03±0.18)、PI3K蛋白相对表达量(1.31±0.10、0.83±0.18)、Akt蛋白相对表达量(3.54±0.22、1.15±0.18)均低于对照组[0.65±0.04、(289.54±8.53)个、5.55±0.21、3.85±0.21、1.96±0.09、4.36±0.24](P0.05),且观察组低于放射组(P0.05)。结论沉默Gab1可提高放射线照射对人胆管癌TFK-1细胞活力及增殖的抑制作用,其机制可能与下调PI3K/Akt表达有关。     

HSP90抑制剂对食管鳞癌细胞株TE-1凋亡的影响及作用机制

目的探讨抑制热休克蛋白90(Hsp90)对食管鳞癌细胞株TE-1凋亡的影响。方法采用不同浓度(0.25、0.5、1.0、2.0μmol/L)、不同时间(24、48、72 h)HSP90抑制剂17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素(17-AAG)处理食管鳞癌细胞株TE-1,分别采用MTT法、流式细胞仪及western blot检测细胞增殖、细胞凋亡及Hsp90、Hsp70、Akt、Fas蛋白表达。结果 17-AAG对TE-1细胞体外增殖抑制率和细胞凋亡率有明显促进作用,并呈现时间-剂量依赖性。17-AAG处理后TE-1细胞Hsp90、Akt蛋白表达明显降低,Hsp70、Fas蛋白表达明显上调。结论 17-AAG可显著抑制TE-1增殖,促进凋亡,其机制可能是通过抑制Hsp90活性、影响其相关信号通路所致。     

乏氧诱导因子预测肺鳞癌放疗敏感性研究

目的 探讨乏氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α,H1F-1α)预测肺鳞癌放疗敏感性的价值.方法 对数期人肺鳞癌细胞,按放疗照射时间分为24 h组和48 h组,2组分别采用0、2、10 Gy照射剂量单次X线照射24 h和48 h.照射后采用Western blot检测肺鳞癌细胞HIF-1α蛋白表达情况,采用逆转录PCR检测肺鳞癌细胞HIF-1α基因表达情况,比较2组肺鳞癌细胞放疗前、后HIF-1α阳性表达率、微血管密度和细胞凋亡率.结果 48 h组肺鳞癌细胞在照射0、2、10 Gy剂量时HIF-1α mRNA((14±2)％、(37±2)％、(69±3)％)和蛋白表达量((16±1)％、(70±5)％、(97±13)％)均明显高于24h组((10±1)％、(29±5)％、(41±6)％,(13±2)％、(65±4)％、(89±10)％),且10 Gy剂量时高于0、2 Gy剂量,2 Gy剂量高于0 Gy剂量(P＜0.05);放疗前24h组肺鳞癌细胞HIF-1α阳性表达率(12.5％)、微血管密度(40.78±5.25)和细胞凋亡率((2.10±0.43)％)与48 h组(12.5％、42.90±7.54、(2.08±0.39)％)比较差异均无统计学意义(P＞0.05),放疗后48 h组肺鳞癌细胞HIF-1α阳性表达率(87.5％)、微血管密度(83.31±4.67)和细胞凋亡率((4.04±1.22)％)均高于24 h组(62.5％、61.22±9.48、(2.23±0.57)％)(P＜0.05),2组放疗后均较放疗前明显增高(P＜0.05).结论 放射剂量越大、放射时间越长,肺鳞癌中HIF-1α阳性表达量越高,对放疗越不敏感;HIF-1α与微血管密度、细胞凋亡密切相关.     

X射线照射对MRE11在鼻咽癌细胞株CNE1中表达的影响

目的 研究X射线照射后肿瘤细胞中MRE11基因及其蛋白表达的规律,并探讨其与肿瘤放疗失败的相关性,为提高肿瘤放射治疗疗效开辟新途径,提供新的靶点。方法 选取人鼻咽癌CNE1细胞株进行体外培养及X线照射。按单次照射0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy剂量分组,照射后4 h收集,利用RT-PCR技术检测MRE11 m RNA的表达;CNE1细胞株单次照射4 Gy于0 h、1.5 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h时间点收集固定,利用免疫荧光技术检测MRE11蛋白的表达,并采用Image-Pro Plus 5.0软件分析测定各组荧光的平均光密度值(m OD)。结果 RT-PCR检测CNE1细胞株分别经0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy X线照射后4 h,各组之间MRE11 m RNA表达无统计学差异。免疫荧光技术检测CNE1细胞株经4 Gy X线照射后0 h、1.5 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h时间点MRE11蛋白的表达,荧光强度先增强后减弱,4 h荧光强度最强。结论 CNE1细胞株MRE11 m RNA的表达与X线照射剂量递增无相关性。但CNE1细胞株经X线照射后MRE11蛋白的表达随时间的延长先增强后减弱,且在照射4 h表达最强,24 h后恢复到未照射水平。     

肺炎链球菌通过Wnt信号通路介导肺腺癌细胞A549损伤的机制研究

目的研究肺炎链球菌刺激对肺腺癌细胞A549损伤的影响及作用机制。方法体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,分为对照组和肺炎链球菌R6刺激组。R6刺激组将肺炎链球菌按照1×10~8个/ml的量加入A549细胞中进行刺激,对照组加入等体积的曲古抑素A(TSA)处理作为对照。分别处理8 h、16 h、24 h、32 h,MTT检测处理各时间点A549细胞存活情况;流式细胞仪检测R6刺激24 h后A549细胞凋亡情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测R6刺激24 h后炎症因子白介素6(IL-6)、IL-10含量变化;Western-blot检测R6刺激24 h后A549细胞凋亡相关蛋白及Wnt通路蛋白表达。结果 R6刺激显著抑制A549细胞存活,与对照组相比,差异具有显著性(P0.05),R6刺激24 h对A549细胞存活抑制效果最明显。R6刺激24 h后,A549细胞凋亡率增高,与对照组相比,差异具有显著性(P0.05)。R6刺激24 h后促炎因子IL-6含量显著增加,抗炎因子IL-10含量明显降低,与对照组相比,差异具有显著性(P0.05)。Western-blot结果显示R6刺激后,促凋亡因子Bax、Cleaved-caspase3蛋白表达显著升高,抑凋亡因子Bcl-2表达明显下降,与对照组相比,差异具有显著性(P0.05),Wnt通路蛋白β-catenin、p-GSK-3β表达明显升高,p-β-catenin、GSK-3β表达明显下降,与对照组相比,差异具有显著性(P0.05)。结论肺炎链球菌刺激会对肺腺癌细胞A549损伤造成损伤,这一过程与Wnt信号通路的激活有关。     

LINC01503 调控ERK 磷酸化促进食管鳞状细胞癌放疗抵抗的机制研究

目的 探究长链非编码核糖核酸 (LncRNA) LINC01503调控细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）通路磷酸化促进食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）放疗抵抗的作用机制。方法 收集 2014年 6月～2017年 12月内蒙古自治区人民医院 ESCC患者癌组织及癌旁组织标本 79例,采用实时荧光定量 PCR检测 LINC01503在 ESCC组织中的表达水平,分析 LINC01503与 ESCC患者临床病理参数、放疗敏感性及预后的关系。构建 ESCC放疗抵抗细胞株 KYSE150R,检测 KYSE150R细胞中 LINC01503的表达;转染 siRNA下调 KYSE150R中 LINC01503的表达。 CCK8实验检测各组细胞放疗敏感性;流式细胞试验检测各组细胞周期和细胞凋亡;Western blot检测各组细胞中 ERK1/2,PERK1/2,细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）,细胞周期素依赖性激酶 4（cyclin dependent kinase 4,CDK4）,凋亡蛋白 Bcl-2和 Bax蛋白表达。结果 与癌旁组织相比, LINC01503在 ESCC组织中表达上调（4.15±1.21 vs 0.96±0.43）,差异有统计学意义（t=22.083,P<0.001）。LINC01503高表达与患者 T分期、淋巴结转移、 TNM分期、放疗抵抗有关,差异均有统计学意义（t=2.322～2.939,均 P<0.05）。LINC01503预测预后的曲线下面积为 0.780（95%CI:0.676～0.884）,灵敏度和特异度分别为 81.58%,67.05%。LINC01503高表达组 5年生存率低于 LINC01503低表达组 [41.86%（18/43）vs 63.89%（23/36）],差异有统计学意义（χ2=4.430,P=0.035）。与 si-NC组相比, si-LINC01503组 KYSE150R细胞的放疗敏感性增加,差异均有统计学意义（t=17.391～33.692,均 P<0.001）;si-LINC01503组 KYSE150R细胞周期阻滞在 G0/G1期（61.47%±3.60% vs 52.15%±2.11%）,细胞凋亡增加（31.95%±2.40% vs 3.68%±0.47%）,差异均有统计学意义（t=4.602,20.022;P=0.004, 0.002）;PERK1/2（0.24±0.03 vs 1.25±0.09）,cyclin D1（0.18±0.06 vs 1.40±0.14）,CDK4（0.87±0.09 vs 1.37±0.16）和 Bcl-2（0.16±0.03 vs 0.85±0.07）蛋白表达降低, Bax蛋白表达增加（0.69±0.06 vs 0.22±0.05）,差异均有统计学意义（t=4.718～18.440,均 P<0.05）。结论 LINC01503通过促进 ERK磷酸化调控细胞周期和凋亡促进 ESCC细胞放疗抵抗,是逆转 ESCC放疗抵抗的潜在分子靶点。     

几种不同物质杀伤肿瘤细胞的体外实验研究

目的:探讨蒸馏水、酒精、5-FU、丝裂霉素对胃癌BGC-823与食管癌TE-13细胞株体外抑制作用.方法:应用BGC-823、TE-13两种肿瘤细胞株常规培养,分为常温蒸馏水、43 ℃蒸馏水、40%酒精、75%酒精、5-FU、丝裂霉素6组,另设阴性对照组.各组加入不同物质作用5 min后,每孔加MTT20 μl,作用4 h后测值,重复四次,计算平均抑制率.结果:蒸馏水和酒精对BGC-823、TE-13两种瘤细胞生长均有抑制作用,5-FU、丝裂霉素对BGC-823、TE-13两种细胞均无出现抑制作用.结论:蒸馏水和酒精在体外对胃癌BGC-823与食管癌TE-13细胞株有明显的抑制作用.为此,在恶性肿瘤手术中可用蒸馏水冲洗胸、腹腔及伤口,亦可用蒸馏水或酒精处理术中污染的器械、缝针等,均可达到较好的肿瘤细胞抑制效果.     

β-连环素及其信号通路在肝癌中的研究进展

β-连环素(β-catenin)是一种由CTNNB1基因编码的具有介导细胞间黏附及信号转导等多重功能的重要分子,其通过Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。近年来,大量的研究证实经典Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在肝癌中具有重要作用,而作为Wnt信号通路关键分子的β-catenin的异常表达与肝癌的发生、发展及预后密切相关。现对β-catenin和Wnt/β-catenin信号通路在肝癌中的作用及目前研究状况作一简要综述,为进一步阐明肝癌中β-catenin及信号通路的作用机制及以Wnt/β-catenin信号通路为靶点的临床治疗提供理论依据。     

人三阴性乳腺癌细胞耐药株的建立及特性研究

目的建立人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的多西紫杉醇(Doc)耐药模型(MDA-MB-231/Doc)和表阿霉素(Epi)耐药模型(MDA-MB-231/Epi),探讨其生物学特性。方法采用Doc和EPi低浓度逐步加量诱导法历时12个月分别建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药细胞株。通过细胞形态学观察、MTT法和流式细胞术分析、比较其生物学特性,实时荧光定量PCR检测多药耐药基因(MDR1)mRNA表达,Western Blot法检测P糖蛋白(P-gp)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)的表达状况。结果所构建的MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药株可分别在12nmol/L Doc和800nmol/L Epi中稳定生长,在相同的药物浓度下,耐药细胞株的生长增殖率明显高于亲代细胞,其耐药指数分别为亲代敏感细胞的8.32倍和64.93倍,且相互呈交叉耐药状态。与亲代细胞相比,两株耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、处于S期的细胞减少,随撤药时间的延长,细胞的增殖速度加快。两株耐药株的MDR1基因表达水平增高,分别为亲代细胞的4.05倍和5.96倍,P-gp表达为阳性。与MCF-7细胞株相比,MDA-MB-231细胞株ER、PR、HER2表达阴性,是典型的三阴性乳腺癌细胞株。结论成功建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi的耐药细胞株,其生长及耐药性稳定。     

HSP抑制剂对食管鳞癌细胞株 TE-凋亡的影响及作用机制研究

目的探讨抑制热休克蛋白90（Hsp90）对食管鳞癌细胞株TE-1凋亡的影响。方法采用不同浓度（0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L）、不同时间（24、48、72 h）HSP90抑制剂17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素(17-AAG)处理食管鳞癌细胞株TE-1,分别采用MTT法、流式细胞仪及western blot检测细胞增殖、细胞凋亡及Hsp90、Hsp70、Akt、Fas蛋白表达。 结果17-AAG对TE-1细胞体外增殖抑制率和细胞凋亡率有明显促进作用,并呈现时间-剂量依赖性。17-AAG 处理后TE-1 细胞Hsp90、Akt 蛋白表达明显降低,Hsp70、Fas蛋白表达明显上调。 结论17-AAG可显著抑制TE-1增殖,促进凋亡,其机制可能是通过抑制Hsp90活性、影响其相关信号通路所致。       

白藜芦醇通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制体外胃癌细胞生长的研究

目的探讨白藜芦醇(Res)对胃腺癌细胞(AGS)生长的影响及其与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法体外培养胃癌细胞株AGS,并以不同浓度Res(25、50、100μmol/L)干预24、48、72 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞抑制率;不同浓度Res干预24 h流式细胞仪检测细胞周期,细胞免疫组化检测Wnt1、β-catenin、Lgr5的表达情况。实验数据以x±s表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果不同浓度Res(25、50、100μmol/L)干预24、48、72 h后,AGS细胞的状态变差,细胞形态变圆密度及数量减少,贴壁较差,细胞增殖抑制率分别为:25μmol/L Res作用24 h组(0.2033±0.0207)、48 h组(0.3949±0.0199)、72 h组(0.5102±0.0155);50μmol/L Res作用24 h组(0.3554±0.0207)、48 h组(0.5157±0.0321)、72 h组(0.6167±0.0248);100μmol/L Res作用24 h组(0.5005±0.0199)、48 h组(0.6251±0.0299)、72 h组(0.7271±0.0147),细胞增殖抑制率呈时间依赖性与剂量依赖性(P<0.05);不同浓度Res作用24 h后,检测G1期细胞所占比分别为空白组(48.33±0.21)%、25μmol/L Res作用组(52.61±0.41)%、50μmol/L Res作用组(58.53±0.48)%、100μmol/L Res作用组(71.16±0.20)%,细胞周期阻滞在G0/G1期(P<0.05);不同浓度Res干预24 h后100μmol/L组(207.36±0.52)、50μmol/L组(202.65±0.53)、25μmol/L组(197.13±1.07)Wnt1灰度值均高于对照组(191.40±0.28)(P<0.05);100μmol/L组(206.51±0.68)、50μmol/L组(200.49±0.30)、25μmol/L组(196.53±0.59)β-catenin灰度值均高于对照组(191.98±0.30)(P<0.05),100μmol/L组(209.22±0.51)、50μmol/L组(204.53±0.92)、25μmol/L组(195.7±60.90)Lgr5灰度值均高于对照组(188.16±0.86)(P<0.05)。结论 Res可抑制胃癌细胞AGS的生长作用,其机制可能通过减少Wnt/β-catenin信号通路的活化而产生的。     

PI3KI/Akt1在辐射诱导的乳腺癌细胞自噬发生中表达调控及作用机制

目的研究不同剂量X线诱导乳腺癌细胞株MCF-7自噬发生过程中Akt表达的变化以及探讨小分子干扰RNA沉默Akt基因后对自噬的影响及可能的作用机制。方法采用实时荧光定量PCR方法检测MCF-7中Akt基因表达,Western blot方法检测Akt蛋白表达;实时荧光定量PCR方法检测Akt过表达和沉默模型中MAP1LC3B基因表达。结果正常照射组MCF-7细胞量效研究表明,在4、8、16 h Akt1表达分别在24、、8Gy区间内呈剂量依赖下降变化,照射后Akt1总体表达均低于假照组(P0.01);32 h量效结果表明,Akt1表达明显呈剂量依赖下降变化,4、8、12Gy有显著性差异(P0.05)。时间效应研究表明,48、、12Gy时程研究Akt1表达量均于8 h降至最低,差异显著(P0.05),照射后Akt1基因总体变化均低于假照组。正常照射组MCF-7细胞Akt1蛋白表达情况为,照射后2 h Akt1蛋白表达即有明显下降趋势,24 h达至最低值;4Gy时效研究表明,照射后0.5 h Akt1蛋白表达明显下降,8 h达至最低值;8 Gy时效研究表明,照射后Akt1蛋白表达在0.5-4 h区间内呈时间依赖下降趋势,4 h达至最低值。Akt1 siRNA模型照射组量效研究表明,MAP1LC3B表达在8、163、2 h均有不同程度升高变化,12 Gy达至最大值(P0.05);时间效应关系表明,2、48、Gy MAP1LC3B表达在16 h3、2 h上升变化显著(P0.05),12 Gy时效表明,8、163、2 h MAP1LC3B表达呈剂量依赖上升变化,于32 h达至最大值(P0.05)。结论 X线可能通过抑制PI3KI/AKT转导通路活性来促进乳腺癌细胞株MCF-7发生自噬。     

WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究

本研究探讨WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性,为开展基于WT1基因调控的白血病基因治疗奠定基础。以EGFP做报告基因,构建含有WT1基因启动子和增强子的重组表达载体;利用脂质体和电穿孔技术将重组质粒转染13个细胞株,包括WT1基因高表达的白血病细胞株(K562、NB4、THP-1、SHI-1),WT1基因低表达的白血病细胞株(U937和Jurkat);非造血细胞株中WT1基因高表达的MCF-7、T47D、293株细胞和WT1基因低表达的ECV304、SMMC7721、HT-29、SHG44细胞株;利用流式细胞术检测转基因细胞稳定表达EGFP的平均荧光强度。以平均荧光强度代表启动子和(或)增强子的转录活性。结果表明:通过基因重组技术构建了含有WT1基因启动子的表达载体pEWP,以及含有WT1基因启动子和增强子的表达载体pEWPA。就启动子的转录活性而言,在非白血病细胞株中,ECV304细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体(pEGFP-1)的16.54±2.45倍,明显高于白血病细胞株(p<0.05);MCF-7和SHG44细胞次之,分别为9.46±1.10和7.29±0.73倍,HT-29细胞表达最低,仅为0.99±0.02倍。在人类血病细胞株中,K562细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体pEGFP-1的2.93±0.27倍,明显高于Jurkat和SHI-1细胞株(p<0.05)。后二者分别为0.74±0.03和0.84±0.09倍。pEWPA可以使HT-29、SHI-1和K562细胞中WT1基因启动子的转录活性增强,分别增强到4.81、3.06和1.01倍。结论:WT1基因启动子的转录活性与细胞内在WT1基因的表达水平不相关,增强子增强部分细胞株中WT1基因启动子的转录活性,但不具有造血组织特异性。