兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化

目的：体外分离培养成人脂肪组织来源的间充质干细胞，探索其基本生物学特性及向心肌细胞诱导分化的潜能，为心肌再生提供理想的自体干细胞来源方法：实验于2005—01／12在解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心完成。取本院微创外科中心一急性单纯性阑尾炎患者大网膜脂肪组织（取得家属同意并告知仅用作实验室研究）。体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并传代扩增培养。采用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态学特点，四氮唑蓝比色法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期及CD44、CD34的表达，第4代细胞用5-氮胞苷诱导使其向心肌细胞分化，免疫细胞化学鉴定心肌样细胞。 结果：①分离培养的脂肪间充质干细胞经传代纯化后细胞形态呈均一梭形生长，电镜显示细胞较为幼稚，核大，核仁明显，常染色质多，异染色质少，细胞器结构及种类简单，以粗面内质网和线粒体为主。②细胞生长曲线呈“S”形，第1和2天为细胞生长潜伏期，第3天开始进入对数生长期，第7天达顶点，群体细胞倍增时间为18～20h。③流式细胞仪检测91．83％细胞CD44表达阳性、CD34阴性。④细胞周期分析显示76．2％细胞处于G0／G1期，S期细胞占8．7％，G2／M细胞占15．1％。⑤5-氮胞苷诱导后4周免疫细胞化学显示部分细胞缝隙连接蛋白-43表达阳性，表达率约为（29．0&;#177;1．2）％。 结论：成人脂肪组织存在细胞活力旺盛的间充质干细胞且易于体外分离扩增，并在体外一定条件下具有向心肌细胞分化的潜能，可望成为心肌再生医学理想的自体干细胞种子来源。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化

目的:体外分离培养成人脂肪组织来源的间充质干细胞,探索其基本生物学特性及向心肌细胞诱导分化的潜能,为心肌再生提供理想的自体干细胞来源。方法:实验于2005-01/12在解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心完成。取本院微创外科中心一急性单纯性阑尾炎患者大网膜脂肪组织(取得家属同意并告知仅用作实验室研究)。体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并传代扩增培养。采用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态学特点,四氮唑蓝比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及CD44、CD34的表达,第4代细胞用5-氮胞苷诱导使其向心肌细胞分化,免疫细胞化学鉴定心肌样细胞。结果:①分离培养的脂肪间充质干细胞经传代纯化后细胞形态呈均一梭形生长,电镜显示细胞较为幼稚,核大,核仁明显,常染色质多,异染色质少,细胞器结构及种类简单,以粗面内质网和线粒体为主。②细胞生长曲线呈“S”形,第1和2天为细胞生长潜伏期,第3天开始进入对数生长期,第7天达顶点,群体细胞倍增时间为18～20h。③流式细胞仪检测91.83%细胞CD44表达阳性、CD34阴性。④细胞周期分析显示76.2%细胞处于G0/G1期,S期细胞占8.7%,G2/M细胞占15.1%。⑤5-氮胞苷诱导后4周免疫细胞化学显示部分细胞缝隙连接蛋白-43表达阳性,表达率约为(29.0±1.2)%。结论:成人脂肪组织存在细胞活力旺盛的间充质干细胞且易于体外分离扩增,并在体外一定条件下具有向心肌细胞分化的潜能,可望成为心肌再生医学理想的自体干细胞种子来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞

背景：体外分离培养出生长状态好、高纯度、增殖能力强和数量充足的大鼠骨髓间充质干细胞,是将其作为种子细胞用于组织和细胞移植的重要前提。 目的：建立简便、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法,并观察其生物学特性。 方法：采用全骨髓法将 SD 大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外分离培养,贴壁接种法进行细胞纯化、传代。观察细胞生长形态及特征,绘制细胞生长曲线,检测细胞表面标记物,采用体外诱导剂诱导细胞分别向成骨、成软骨、成脂方向分化。 结果与结论：全骨髓贴壁接种法分离培养的骨髓间充质干细胞生长旺盛、纯度高,细胞生长形态呈长梭形,极性排列,细胞生长呈S形生长曲线,群体倍增时间为29 h,细胞在连续传10代后仍具有较强的增殖能力。第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物CD44、CD29、CD90均呈阳性表达,CD45、CD34、CD11b则呈阴性表达。第3代骨髓间充质干细胞分别经成骨、成软骨、成脂诱导剂诱导后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、von-kossa矿化结节染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色均呈阳性。结果验证全骨髓贴壁接种法是一种简便可靠的体外分离培养方法,能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,经实验鉴定第3代骨髓间充质干细胞生物活性最佳,且具有多向诱导分化能力,适合作为后续实验的种子细胞。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景:培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提.目的:寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统.第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性.提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验.     

密度梯度离心及贴壁分离筛选相结合分离培养大鼠骨髓间充质干细胞

背景：在正常情况下骨髓来源间充质干细胞含量很少,且易与其他细胞相混杂,因此,建立一种简便可行的体外培养扩增方法,获得大量稳定的骨髓间充质干细胞具有重要的理论意义和应用价值。目的：建立一种简便可行的体外培养扩增方法,获得大量稳定的骨髓间充质干细胞。方法：采用密度梯度离心法及贴壁分离筛选法相结合体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。倒置光学显微镜下观察细胞形态变化,透射电镜观察细胞亚微结构,锥虫蓝拒染法计算活细胞数,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,免疫细胞化学检测c-kit和CD45的表达,流式细胞仪分析CD45的表达情况。结果与结论：①接种后24 h倒置光学显微镜下可见有细胞贴壁并伸出伪足,4 d时可见有细胞集落形成,14 d时细胞可达到90%融合。经传代后细胞趋于一致,为纤维样细胞,呈漩涡或火焰状生长。②透射电镜下可见第3代骨髓间充质干细胞体积较小核大,核仁明显。染色质分布稀疏,电子密度低。细胞表面有微绒毛,胞质稀松,内有丰富核糖体,而内质网、线粒体、高尔基复合体等细胞器少见,提示细胞处于原始未分化状态。③第3代骨髓间充质干细胞接种后第1天细胞数量有所减少,第2天细胞开始增长,第3天细胞进入指数增生期,第7天进入平台期,第9天细胞数量开始下降,绘制的生长曲线呈“S”形。④第3代骨髓间充质干细胞经DNA染色后采用流式细胞仪测定其DNA含量证明S期细胞比率为21.1%。⑤免疫细胞化学染色和流式细胞术证明c-kit阳性细胞比率为53.3%,CD45表达阳性率为1.68%。⑥骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化16 d后,细胞的胞体呈椭圆形,有短突起彼此相连,胞浆较暗,提示可能富含粗面内质网和高尔基复合体,并具有分泌类骨质的功能。结果证明?     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化及免疫组化鉴定

目的建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,体外诱导其向神经元样细胞方向分化。方法应用细胞培养技术从大鼠股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,以形态学方法鉴定间充质干细胞,在倒置显微镜下观察细胞的形态特征,利用含10 ng/ml bFGF的LG-DMEM及含200μmol/L BHA、2%DMSO的无血清DMEM诱导其向神经元样细胞分化,并通过免疫组化方法鉴定。结果经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,类似于成纤维细胞;成神经元诱导24 h后,多数MSCs变为典型的神经元样细胞,胞体向胞核收缩并有较多的长突起,免疫组化显示神经元特异性标志NSE、神经巢蛋白Nestin染色阳性。结论体外成功的进行了MSCs原代及传代培养,细胞生长稳定、增殖迅速并可多次传代,经诱导后具有向神经元样细胞分化潜能。     

应用免疫磁珠负选法分离与纯化小鼠骨髓间充质干细胞

目的:拟建立体外分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞的新方法,从而得到高纯度的骨髓间充质干细胞。方法:实验于2002-09/2005-03在解放军第二军医大学附属长海医院烧伤科实验室完成。①选取清洁级7d龄FVB/N小鼠15只,利用免疫磁珠法(CD11b负选)从小鼠的骨髓细胞中分离纯化骨髓间充质干细胞:颈椎脱臼处死后无菌条件下取出小鼠双侧股骨,消毒离断后去除上清及脂肪层,吹打成单细胞悬液后接种于培养基中。贴壁细胞达到90%左右融合后,用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸进行消化,将悬浮的细胞与CD11b抗体避光反应2min,移入已预置入磁场的LD管,不加压通过,收集管中的细胞成分,用培养基重悬并吹打成单细胞悬液后以1×109L-1～2×109L-1的密度接种于培养基中培养。②培养传代后流式细胞仪检测细胞周期、表面标记物,并利用诱导剂观察其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞的能力。结果:①细胞形态学观察:免疫磁珠法获得的细胞几乎无圆形细胞夹杂,贴壁率高,形态单一呈典型成纤维样、漩涡状生长,体外增殖迅速。②细胞生长曲线绘制情况:细胞贴壁后一两天为细胞生长缓滞期,之后进入对数增长期,六七天后进入平台期。③细胞周期分析结果:G0/G1期细胞约86%,S G2 M期约14%。④细胞表面标记物检测结果:第3代骨髓间充质干细胞3%表达CD45,68.7%表达CD29,3%表达CD34,89.6%表达CD105。⑤骨髓间充质干细胞向脂肪细胞与成骨细胞定向分化情况:在地塞米松、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、吲哚美辛等诱导剂作用下,脂肪细胞 成骨细胞诱导组细胞第5天开始油红O染色显示细胞核呈蓝色,细胞内脂滴呈橙色;在β-甘油磷酸钠、2-磷酸-抗坏血酸等诱导剂的作用下,第10天开始AKP染色显示细胞内有致密颗粒形成,VonKossa染色显示钙盐沉积。结论:本实验通过免疫磁珠法(CD11b负选)成功地从FVB/N小鼠骨髓细胞中分离纯化出骨髓间充质干细胞。根据表面标记物的检测结果提示该法获得的细胞纯度高、周期性慢、多分化潜能,符合干细胞特性。     

脂肪源干细胞向血管内皮细胞的分化

背景：脂肪来源干细胞在体内储备丰富,体外增殖快速,具有多向分化潜能,是目前组织工程种子细胞的研究热点。近年来越来越多的研究表明脂肪干细胞在一定条件下可被诱导分化为内皮细胞,促进血管生成。t目的：观察兔脂肪干细胞体外分离培养及诱导分化为血管内皮细胞的生物学特性。方法：取兔附睾处脂肪,采用胶原酶消化分离获得脂肪干细胞,体外培养至第3代后加入血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合诱导分化,对诱导前后细胞进行形态学观察、生长曲线测定、免疫组织化学染色及流式细胞仪表型检测。结果与结论：兔脂肪干细胞生长旺盛,第3代兔脂肪干细胞呈成纤维细胞样,生长曲线呈“S”型,15代以内细胞形态未见明显变化。免疫荧光法检测Vimentin阳性,流式细胞仪检测CD44表达阳性,CD31表达阴性;诱导后细胞CD31表达阳性,CD44表达阴性。第3代兔脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化21d显微镜下呈铺路石样形态,血管内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原染色细胞阳性,透射电镜下可见W-P小体。提示脂肪干细胞在体外可诱导分化为血管内皮细胞,可为组织工程血管提供理想的种子细胞。     

滑膜间充质干细胞分离纯化后的生物学特性

背景：大量的研究报道证明滑膜间充质干细胞在细胞形态、免疫表型、集落形成能力和分化潜能等方面与骨髓间充质干细胞相似,但在向软骨分化的能力上,滑膜间充质干细胞明显优于骨髓间充质干细胞。目的：探讨滑膜间充质干细胞作为半月板软骨组织工程种子细胞的可行性。方法：通过有限稀释单克隆培养法将滑膜间充质干细胞从兔滑膜组织中分离出来并加以纯化,在体外培养条件下对其形态学、超微结构、分子表型、增殖动力学、核型以及致瘤性等进行分析。结果与结论：从兔滑膜细胞中分离纯化出滑膜间充质干细胞,体外单层培养具有极强的增殖能力,在第6天时达到生长的最高峰,倍增时间为（30．2±2．4）h。流式细胞术检测滑膜间充质干细胞表达间充质干细胞一些分子标记CD44、CD90。DNA含量检测、染色体核型分析、荷瘤实验结果表明,分离纯化的滑膜间充质干细胞是正常的二倍体细胞,无致瘤性,因此可作为半月板组织工程的种子细胞。     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞作为骨、软骨创伤缺损及退变修复的种子细胞越来越受到关注。目的：分析人骨形态发生蛋白2基因转染对白色封闭群大鼠（SD大鼠）骨髓间充质干细胞的影响。方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞并体外扩增,通过腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况及蛋白质水平来测定转染后人骨形态发生蛋白2的表达,碱性磷酸酶定量测定鉴定成骨活性及MTT法评估人骨形态发生蛋白2转染对骨髓间充质干细胞的影响。结果与结论：从SD大鼠骨髓提取物中分离培养的细胞形态为梭形,呈铺路石状、漩涡状生长,经流式细胞仪检测及多项分化能力鉴定符合骨髓间充质干细胞的特征;经转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞表达人骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶;MTT法检测转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）。说明人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞后可以持续、高效表达入骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶,在体外明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。     

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景：人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。目的：验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。方法：构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果与结论：测序及酶切证实真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6h检测到有EGFP的表达,至60h达到高峰,转染效率为（16±3）％。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60h达到22．65υg／L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。     

不同年龄段大鼠脊髓源性神经干细胞的体外培养及鉴定

背景：不同年龄段神经千细胞的增殖及分化特性目前未见报道。目的：观察不同年龄段人鼠脊髓源性神经干细胞的体外分离、培养及鉴定。方法：取不同年龄大鼠的脊髓,制成单细胞悬液,用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和B27的DMEM／F12培养基,以细胞浓度5.0×10^5L^-1进行原代培养,每隔3d传代1次。结果与结论：不同年龄段大鼠的脊髓中均可培养出细胞,其形态为结构紧密、大小不等的悬浮细胞球,称之为“神经干细胞球”;经过传代后单细胞又迅速增殖成球且数目明显增多。提示不同年龄段大鼠脊髓中均能够在体外培养出神经细胞球。     

低强度脉冲超声波对SD大鼠前软骨干细胞增殖及细胞外基质mRNA表达的影响

背景：研究证明低强度脉冲超声波不仅可以促进骨折愈合,而且还对软骨细胞增殖和细胞外基质分泌具有一定的调节作用。目的：进一步验证低强度脉冲超声波对大鼠前软骨干细胞增殖及细胞外基质分泌的影响。方法：分离新生大鼠乳鼠的前软骨干细胞,鉴定后第3代细胞培养,分为空白对照组、5,12,20min/d组4组。以低强度脉冲超声波刺激后继续培养细胞24h。分别于刺激后第1,3,5天用CCK-8法检测细胞增殖。另以低强度脉冲超声波刺激后间隔30min提取总RNA,用RT-PCR法检测Ⅱ型胶原、Aggrecan、转化生长因子β1及Sox9基因的表达。结果与结论：低强度脉冲超声波对大鼠前软骨干细胞的增殖有促进作用,与对照组相比第1天时20min/d组增殖明显（P〈0.05）。大鼠前软骨干细胞Ⅱ型胶原、Aggrecan、转化生长因子β1及Sox9基因mRAN的表达均有明显增加,刺激天数越多mRAN的表达量越多,以20min/d组增高最为明显。提示低强度脉冲超声波可以促进SD大鼠前软骨干细胞的增殖能力,并可以促进细胞外基质mRAN的表达,这一效应可能是通过转化生长因子β1及Sox9基因所介导的。     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞（P〈0.01）。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

兔激素性股骨头坏死模型骨髓间充质干细胞的培养

背景：自体干细胞移植治疗已经成为目前组织工程和再生医学研究的重点。但对于兔激素性股骨头坏死模型自体骨髓移植中骨髓间充质干细胞的体外培养研究鲜有报道。目的：抽提兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞,并行体外扩增和表型鉴定。方法：取成年大耳白兔10只,对照组2只不给任何药物;模型组8只每周2次臀肌注射甲基强的松龙8mg/kg制备兔激素性股骨头坏死模型。体外分离培养骨髓间充质干细胞;应用流式细胞仪分别检测第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD34、CD44的表达。结果与结论：经过大量激素作用后,MR灌注成像及病理切片结果显示兔激素性股骨头坏死模型组造模成功。模型组原代骨髓间充质干细胞4h内仅有少量细胞贴壁,12d左右细胞铺满瓶底的85%-90%,传代培养生长良好;第4代骨髓间充质干细胞生长曲线呈典型S型,第4-7天处于高速增殖期,与对照组生长曲线相近;经流式细胞术鉴定,第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD34表达呈阴性,CD29,CD44表达呈阳性,证明所培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞。提示兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞具有较强的生长和增殖能力,可用于干细胞标记及进一步自体移植治疗。     

应用免疫磁珠负选法分离与纯化小鼠骨髓间充质干细胞

目的：拟建立体外分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞的新方法，从而得到高纯度的骨髓间充质干细胞。 方法：实验于2002—09／2005-03在解放军第二军医大学附属长海医院烧伤科实验室完成。①选取清洁级7d龄FVB／N小鼠15只，利用免疫磁珠法（CD11b负选）从小鼠的骨髓细胞中分离纯化骨髓间充质干细胞：颈椎脱臼处死后无菌条件下取出小鼠双侧股骨，消毒离断后去除上清及脂肪层，吹打成单细胞悬液后接种于培养基中。贴壁细胞达到90％左右融合后，用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸进行消化，将悬浮的细胞与CD11b抗体避光反应2min。移入已预置入磁场的LD管，不加压通过，收集管中的细胞成分，用培养基重悬并吹打成单细胞悬液后以1×10^9L^-1-2×10^9L^-1的密度接种于培养基中培养。②培养传代后流式细胞仪检测细胞周期、表面标记物，并利用诱导剂观察其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞的能力。 结果：①细胞形态学观察：免疫磁珠法获得的细胞几乎无圆形细胞夹杂。贴壁率高。形态单一呈典型成纤维样、漩涡状生长。体外增殖迅速。②细胞生长曲线绘制情况：细胞贴壁后一两天为细胞生长缓滞期，之后进入对数增长期，六七天后进入平台期。③细胞周期分析结果：G0／G1期细胞约86％，S＋G2＋M期约14％。④细胞袭面标记物检测结果：第3代骨髓间充质干细胞3％表达CD45，68．7％表达CD29，3％表达CD34，89．6％表达CD105。⑤骨髓间充质干细胞向脂肪细胞与成骨细胞定向分化情况：在地塞米松、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、吲哚美辛等诱导剂作用下，脂肪细胞＋成骨细胞诱导组细胞第5天开始油红O染色显示细胞核呈蓝色，细胞内脂滴呈橙色；在β-甘油磷酸钠、2-磷酸-抗坏血酸等诱导剂的作用下，第10天开始AKP染色显示细胞内有致密颗粒形成，Von Kossa染色显?     

人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性

背景:高效、稳定地获得大量较高纯度的人脂肪干细胞,是其在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。目的:探索体外培养脂肪干细胞的适宜条件,从而提高其增殖能力。方法:采用胶原酶消化的方法,从人腹部皮下块状脂肪中分离出脂肪干细胞,经贴壁筛选法纯化细胞、低糖培养基体外培养扩增。Giesam染色后观察细胞形态;绘制细胞生长曲线并进行细胞周期分析,观察分析传代后染色体核型改变;选取第3代脂肪干细胞做流式细胞鉴定、EdU细胞增殖能力检测以及克隆形成实验。结果与结论:分离培养的原代脂肪干细胞形态不一,经传代后的细胞形态趋于长梭形,排列紧密呈漩涡状生长。细胞生长曲线呈S形,细胞周期分析及EdU掺入法结果显示体外培养的脂肪干细胞具有较强的增殖能力。经染色体核型分析结果提示,体外培养不会引起脂肪干细胞的核型改变。第3代脂肪干细胞经流式细胞仪检测CD29,CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34和CD45呈阴性;克隆形成率为8.8%;在一定的诱导条件下,脂肪干细胞能够向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果说明采用胶原酶消化法可成功分离培养人脂肪干细胞,且具有较强的增殖能力。