干细胞的生物学特性：异基因骨髓细胞防治小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病

目的:研究可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰的粒-巨噬细胞集落刺激因子短期培养的异基因骨髓细胞,对小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病的防治及与移植物抗白血病的关系.方法:实验于2002-06/2003-03在第二军医大学免疫研究所完成.选择纯种近交系C57BL/6小鼠作为供,BALB/c小鼠作为受,用^60Coγ射线照射后,随机分为5组,每组10只.①未处理组:接受照射后,尾静脉注射磷酸盐缓冲液.②移植物抗宿主病组:照射后移植骨髓细胞和脾细胞.③粒-巨噬细胞集落刺激因子组:照射后移植粒-巨噬细胞集落刺激因子培养的骨髓细胞和脾细胞.④LacZ基因修饰组:照射后移植粒-巨噬细胞集落刺激因子培养后LacZ基因修饰的骨髓细胞和脾细胞.⑤可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组:照射后移植粒-巨噬细胞集落刺激因子培养后可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰的骨髓细胞和脾细胞.经上述处理后主要观察:①各组小鼠生存期.②隔3日鼠尾静脉采血检测各组小鼠外周血白细胞的变化,以观察不同方法对造血功能恢复的影响.③各组小鼠脾脏淋巴细胞杀伤活性的改变.结果:纳入BALB/c小鼠50只,均进入结果分析.①小鼠生存期:可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组平均存活期较移植物抗宿主病组明显延长(35 d,12.5 d,P＜0.05).②小鼠脾脏淋巴细胞杀伤活性的改变:可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组小鼠脾脏淋巴细胞杀伤同种肿瘤细胞的活性明显高于LacZ基因修饰组和粒-巨噬细胞集落刺激因子组.③对造血功能恢复的影响:处理后各组小鼠外周血白细胞计数均明显降低.6 d白细胞开始逐渐回升,尤以移植粒-巨噬细胞集落刺激因子组、LacZ基因修饰组和可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组小鼠白细胞回升明显.结论:可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰的骨髓细胞能有效地抑制移植物抗宿主病的产生,有利于骨髓移植小鼠恢复造血功能.骨髓细胞异基因移植是一种有效防治移植物抗宿主病的新方法.     

同种异体肢体移植特异性免疫耐受诱导方案

背景:通过诱导受体产生免疫耐受能够解决移植领域存在的许多问题,如长期应用免疫抑制剂带来的毒副作用,慢性排斥反应等.目的:观察联合应用亚致死量放射线照射、氟达拉滨及骨髓腔内骨髓移植对诱导大鼠同种异体肢体移植产生特异性免疫耐受的影响.设计、时间及地点:随机同期对照动物实验,于2004-01/2008-12在哈尔滨医科大学完成.材料:40只雄性Wistar大鼠随机分成4组:单纯移植组、氟达拉滨组、骨髓移植组、氟达拉滨+骨髓移植组,每组各10只.40只SD大鼠为骨髓移植供体.供体DA大鼠用于皮肤移植实验.方法:制作同种异体右后肢移植模型,单纯移植组仅进行肢体移植:氟达拉滨组在肢体移植前1 d,受体给予亚致死量,~60(Co)照射及腹腔内注射氟达拉滨50 mg/kg;骨髓移植组肢体移植当天受体接受供体骨髓腔内骨髓移植1×10~(12) L~(-1),10 μL;氟达拉滨+骨髓移植组受体联合应用亚致死量照射、注射氟达拉滨及骨髓腔内骨髓移植.主要观察指标:观察移植物排斥反应征象及存活情况,并对氟达拉滨+骨髓移植组产生免疫耐受大鼠进行SD大鼠及DA大鼠皮肤移植及脾细胞中细胞因子mRNA检测.结果:与其他实验组比较,氟达拉滨+骨髓移植组移植物发生排斥反应的时间及存活时间均显著延长(P＜0.01).氟达拉滨+骨髓移植组大鼠仅对第3方DA大鼠的皮肤呈现强烈的免疫反应,移植皮肤初为水疱、渗出,逐渐溃疡、糜烂、焦痂、变黑坏死.与单纯移植组比较,氟达拉滨+骨髓移植组大鼠Th1型细胞因子的表达明显降低,而Th2型细胞因子的表达明显增高.结论:氟达拉滨与骨髓移植联合方案可以诱导大鼠同种异体肢体移植产生特异性免疫耐受.     

PTD-mFoxp3融合蛋白对异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响

本研究探讨静脉输注PTD—mFoxp3融合蛋白对同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响。10周龄C57BL／6小鼠为受体并随机分为A、B、c3组,每组10只,移植当天（第0天）接受直线加速器x射线6．0Gy全身照射,4-6h内输注供体BALB／c鼠全骨髓细胞3×10^7＋脾细胞1．5×10^7个。A组于移植前2d和移植后0、1、3、5、7、9、11、13d间断多次输入生理盐水,B组输入mFoxp3蛋白,c组输注等量PTD．mFoxp3融合蛋白。移植后每天观察受体有无移植物抗宿主病的表现;取受体肝脏、空肠上端组织做病理学检查,判断组织损伤及淋巴细胞浸润程度;用ELISA法检测受体外周血中炎性因子IL-2及INF．1浓度;流式细胞术测定长期存活受体外周血供体细胞的比例。结果表明,照射后60d内A、B和c组受体平均生存期分别为（32．95±5．48）d、（38．00±5．45）d和（55．30±3．15）d;病理组织学观察示,A组和B组的小肠及肝脏发生明显的损伤,符合GVHD的表现,c组的病理损伤较轻;酶联免疫吸附测定表明,c组IL-2及IFN-γ浓度明显低于A和B组;长期存活的受体形成了稳定的嵌合体状态,移植后60dA、B、C组活存动物供体细胞比例分别为（79．46±1．80）％、（79．13±2．23）％和（85．92±2．82）％。结论：PTD-mFoxp3融合蛋白可有效降低同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的发生,并减轻其临床表现,降低死亡率。     

小鼠移植物抗宿主病模型的建立

背景：小鼠移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植的主要并发症,表现为多系统损害（皮肤、食管、胃肠、肝脏等）的全身性疾病,是造成异基因造血干细胞移植后死亡的重要原因之一。目的：探讨建立小鼠移植物抗宿主病模型的方法,为实验性研究药物防治移植物抗宿主病提供有效的动物模型。方法：选择C57BL/6（H-2b）→BALB/C（H-2d）作为完全异基因移植供、受体。通过注射移植供鼠脾脏淋巴细胞及骨髓细胞数以建立移植物抗宿主病模型。根据临床表现、病理检查等判断移植物抗宿主病模型是否建立。结果与结论：给予5×106个以上的供鼠脾细胞的小鼠都发生了急性移植物抗宿主病,但小鼠移植物抗宿主病出现的时间、存活期不同。提示,输入5×106个供鼠脾细胞可有效建立移植物抗宿主病模型,小鼠异基因骨髓移植动物模型是可靠的,可用于移植物抗宿主病防治的实验性研究。     

小鼠移植物抗宿主病模型的建立

背景:小鼠移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植的主要并发症,表现为多系统损害(皮肤、食管、胃肠、肝脏等)的全身性疾病,是造成异基因造血干细胞移植后死亡的重要原因之一。目的:探讨建立小鼠移植物抗宿主病模型的方法,为实验性研究药物防治移植物抗宿主病提供有效的动物模型。方法:选择C57BL/6(H-2b)→BALB/C(H-2d)作为完全异基因移植供、受体。通过注射移植供鼠脾脏淋巴细胞及骨髓细胞数以建立移植物抗宿主病模型。根据临床表现、病理检查等判断移植物抗宿主病模型是否建立。结果与结论:给予5×106个以上的供鼠脾细胞的小鼠都发生了急性移植物抗宿主病,但小鼠移植物抗宿主病出现的时间、存活期不同。提示,输入5×106个供鼠脾细胞可有效建立移植物抗宿主病模型,小鼠异基因骨髓移植动物模型是可靠的,可用于移植物抗宿主病防治的实验性研究。     

同种与异种胎胸腺混合移植诱导供者皮肤移植免疫耐受

目的:探讨同种异种胎胸腺混合移植达到供者皮肤移植的耐受。方法:实验于2003-03/12在第三军医大学创伤、烧伤、复合伤实验室完成。将F344大鼠胎胸腺和C57BL/6小鼠胎胸腺混合移植到BALB/C裸小鼠的双肾包膜下4个月后,用流式细胞仪技术检测裸小鼠外周血中CD3+和CD4+T细胞,用单向混合淋巴细胞培养了解T细胞对ConA以及同种异种淋巴细胞的反应性,异基因皮肤移植观察皮肤移植物存活期。结果:①混合移植胎胸腺4个月后,受者裸小鼠外周血中CD3+和CD4+T细胞占总白细胞的25.9%,正常裸小鼠外周血中CD3+和CD4+量极少(2.43%)。②受者T细胞对ConA以及无关的SD鼠异种淋巴细胞的反应性强(刺激指数分别为23.23与12.75),而对供者F344及C57BL/6淋巴细胞不发生增殖反应(刺激指数分别为1.12与0.98)。③受者对供者F344及C57BL/6鼠皮肤移植物86d不发生排斥,而对无关的SD鼠皮肤移植物15d即发生排斥。结论:受体对胸腺供体来源的F344和C57BL/6皮肤及宿主本身的BALB/C皮肤移植耐受,而对无关的SD鼠皮肤移植物较短时间内即发生了排斥,并且抗DNA自身抗体水平与正常鼠相似。表明同种和异种胸腺混合移植后受体可重建有免疫功能的T淋巴细胞,并能诱导供者特异性免疫耐受的发生。     

肝损伤Balb—c小鼠用于细胞移植治疗的有效亚致死放疗剂量

目的:探索肝损伤Balb-c小鼠适合的亚致死性放疗剂量,为细胞移植治疗用于肝病动物模型提供预处理方案。方法:实验于2004-10/2005-06在中山大学附属第一医院神经科实验室和中山大学实验动物中心完成。供体鼠为48只雄性Balb-c小鼠,受体鼠为24只雌性Balb-c小鼠。24只雌性受体鼠以2-乙酰氨基芴法建立肝损伤模型,根据γ射线照射剂量按随机数字表法分为4组,即γ射线8Gy,7Gy,6Gy和5Gy照射组,每组6只。放疗后当天接受带有CM-Dil荧光标记的供体雄性小鼠骨髓干细胞移植,每只受体小鼠移植骨髓干细胞1.0×107个。移植后追踪12周,观察受体鼠的一般情况及移植物抗宿主病反应,检测干细胞示踪剂CM-DiI(积分吸光度值)和供体雄性Sry基因(Sry与β-actin扩增产物积分吸光度比值)在受体鼠肝脏中的表达,以明确供体细胞在受体鼠肝脏存活情况。结果:放疗后γ射线8Gy照射组小鼠在放疗后4～10d内全部死亡,γ射线7Gy照射组死亡4只,共14只小鼠进入结果分析。①移植后受体鼠的移植物抗宿主病情况比较:γ射线7Gy照射组移植后第1周时移植物抗宿主病症状明显,4周后完全消失;γ射线5,6Gy照射组移植物抗宿主病症状轻微,持续3周消失。②各组受体小鼠肝脏中的CM-DiI分布情况比较:γ射线5,6,7Gy照射组CM-DiI积分吸光度值分别为2.86±0.72,2.65±0.55,2.53±0.42,3组相比差异无显著性意义(P>0.05)。③各组受体小鼠肝脏中雄性Sry基因的表达情况比较:γ射线7,6和5Gy照射组Sry与β-actin扩增产物积分吸光度比值分别为0.194±0.015,0.213±0.031,0.208±0.027,各组间差异无显著性意义(P>0.05)。结论:鉴于外周血细胞被供体细胞取代量随着放疗剂量增加而增加的理论,肝损伤Balb-c小鼠模型用于细胞移植研究的适合亚致死性放疗剂量是6Gy。     

口服耐受与免疫抑制药物对移植后移植物抗宿主病抑制作用比较

背景:移植物抗宿主病是导致异基因外周血造血干细胞移植失败的主要原因,口服耐受是研究治疗移植物抗宿主病的新模式.目的:探讨骨髓移植前供鼠经口服受鼠脾淋巴细胞诱导耐受是否能增加异基因骨髓移植后受鼠对供者移植物的免疫耐受,从而减轻移植物抗宿主病,并与目前常用于预防移植物抗宿主病的免疫抑制药物比较作用效果.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-12在东南大学医学院中心实验室完成.材料:供鼠为雄性纯种近交系小鼠C57BL/6J(H-2~b),受鼠为雌性纯种近交系小鼠BALB/c(H-2~b).方法:用主要组织相容性抗原完全不合的纯种近交系小鼠建立异基因骨髓移植,移植物抗宿主病动物模型,小鼠共分5组,分别给予不同的急性移植物抗宿主病预防方案:①口服耐受组:移植前口服受鼠脾淋巴细胞相当于10 μg蛋白,隔天1次,共3次.②雷帕霉素组:1.5 mg/(kg·d)灌胃,从移植后第1天(+1 d)开始用药.③环孢索Al+甲氨蝶呤组:环孢素A 1.5 mg/(kg·d)腹腔注射,从移植后+1 d开始用药,当小鼠的胃肠功能逐渐恢复后,改为环孢素A 5 mg/(kg·d)灌胃,甲氨蝶呤0.4 mg/(kg·d)腹腔注射,移植后+1,+3,+6,+11 d用药.④空白对照组:移植后未用药.⑤辐照不移植组:照射后未予骨髓移植.主要观察指标:各组小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病的出现情况及免疫耐受指标差异.结果:移植后小鼠出现典型的移植物抗宿主病症状,空白对照组小鼠死亡高峰在移植后第14-18天,死亡率接近100%.口服耐受组、雷帕霉素组和环孢素A+甲氨蝶呤组小鼠急性移植物抗宿主病症状明显减轻,平均生存时间较空白对照组显著延长(P<0.05);小鼠急性移植物抗宿主病病理表现减轻,口服耐受组病理变化少于其他各组;流式细胞仪监测CD4~+/CD8~+比值增加,CD4~+CD25~+细胞增加,口服耐受组增加明显;ELISA检测移植物抗宿主病产生相应细胞因子减低,且口服耐受组明显减轻.MTT结果显示,口服耐受组免疫耐受显著增强,淋巴细胞增殖明显降低.结论:口服耐受可以显著抑制体外T淋巴细胞增殖效应,增强小鼠对骨髓移植的免疫耐受,减轻移植物抗宿主病症状和病理损害程度,延长平均生存时间;与目前常用于预防移植物抗宿主病的免疫抑制药物比较,减轻移植物抗宿主病的作用更强.     

干细胞的生物学特性:异基因骨髓细胞防治小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病

目的:研究可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰的粒-巨噬细胞集落刺激因子短期培养的异基因骨髓细胞,对小鼠骨髓移植后移植物抗宿主病的防治及与移植物抗白血病的关系。方法:实验于2002-06/2003-03在第二军医大学免疫研究所完成。选择纯种近交系C57BL/6小鼠作为供者,BALB/c小鼠作为受者,用60Coγ射线照射后,随机分为5组,每组10只。①未处理组:接受照射后,尾静脉注射磷酸盐缓冲液。②移植物抗宿主病组:照射后移植骨髓细胞和脾细胞。③粒-巨噬细胞集落刺激因子组:照射后移植粒-巨噬细胞集落刺激因子培养的骨髓细胞和脾细胞。④LacZ基因修饰组:照射后移植粒-巨噬细胞集落刺激因子培养后LacZ基因修饰的骨髓细胞和脾细胞。⑤可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组:照射后移植粒-巨噬细胞集落刺激因子培养后可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰的骨髓细胞和脾细胞。经上述处理后主要观察:①各组小鼠生存期。②隔3日鼠尾静脉采血检测各组小鼠外周血白细胞的变化,以观察不同方法对造血功能恢复的影响。③各组小鼠脾脏淋巴细胞杀伤活性的改变。结果:纳入BALB/c小鼠50只,均进入结果分析。①小鼠生存期:可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰组平均存活期较移植物抗宿主病组明显延长(35d,12.5d,P<0.05)。②小鼠脾脏淋巴细胞杀伤活性的     

移植物化学修饰减轻小鼠半相合骨髓移植后的急性移植物抗宿主病

背景:甲氧基聚乙二醇是一种无免疫原性的兼性聚合分子,可以共价结合方式修饰各种蛋白质,减少其免疫原性.因此,在进行半相合造血干细胞移植时,若能用甲氧基聚乙二醇对移植物的T细胞进行化学修饰,阻断其激活的途径,就可能减轻移植物抗宿主病反应,提高移植成功率.目的:构建小鼠半相合骨髓移植模型,观察甲氧基聚乙二醇修饰移植物对小鼠H2半相合骨髓移植后移植物抗宿主病的影响.设计、时间及地点:随机化配对设计实验,于2003-03/11在解放军总医院医学动物实验中心和小儿内科实验室完成.材料:纳入20只8～10周龄雄性近交系BALB/cH-2d小鼠作为供鼠,60只8-10周龄杂交获得的雌性CB6 F1代".m小鼠作为受鼠.甲氧基聚乙二醇为美国Sigma公司产品.方法:常规制备供鼠骨髓及脾细胞混合悬液.受鼠行总剂量8.0 GY60Co γ射线全身均匀照射,照射后随机分为3组,每组20只.照射对照组每只受鼠经尾静脉输入RPMI-1640培养摹基0.5 mL,单纯移植组照射后12 h内经尾静脉输入未处理的半相合供鼠骨髓及脾细胞混合悬液0.5 mL,修饰移植组照射后12 h内经尾静脉输入甲氧基聚乙二醇修饰的半相合供鼠骨髓及脾细胞混合悬液0.5mL.主要观察指标:移植后观察动物存活率、急性移植物抗宿主病理表现及存活小鼠的染色体核型.结果:照射对照组小鼠均在2周内死亡;修饰移植组小鼠30 d存活率显著高于单纯移植组(75%,40%,x2=5.01,P=0.025).取死亡小鼠的爪垫皮肤、肝及小肠肠管作病理组织学检查,修饰移植组急性移植物抗宿主病病理表现减轻,Thomas病理分级轻于单纯移植组.移植后75 d应片j染色体C带显色法检测存活受鼠的嵌合体,证实为完全供者型植入.结论:甲氧基聚乙二醇修饰移植物可明显减轻急性移植物抗宿主病,提高半相合骨髓移植存活率.