蜂胶水提液影响血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖的作用

目的：观察蜂胶水提液对血管紧张素Ⅱ诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖作用的影响。方法：实验于2005-03／2006-04在泰山医学院基础医学研究所完成。组织块法培养人脐动脉平滑肌细胞。取3～5代细胞进行实验。将培养的人脐动脉平滑肌细胞随机分为4组：①对照组：不加任何药物。②模型组：加入100nmol／L的血管紧张素Ⅱ。③蜂胶组：分别加入50mg／L、100mg／L、200mg,／L的蜂胶水提液预处理2h后，再加入终浓度为100nmol／L的血管紧张素Ⅱ。④氯沙坦组：加入1．5μmol／L的氯沙坦预处理2h后，再加入终浓度为100nmol／L的血管紧张素Ⅱ。同步化后，按分组分别加入处理药物孵育24h，倒置显微镜下动态观察细胞形态学的变化，同时计数细胞存活率，并用血细胞计数板计数各组细胞。采用流式细胞仪检测细胞周期，并分析细胞不同周期所占比例。采用免疫细胞化学检测增殖细胞核抗原。计算增殖细胞核抗原阳性细胞百分率。增殖细胞核抗原阳性细胞百分率（％）=增殖细胞核抗原阳性细胞总数／血管平滑肌细胞总数&;#215;100％。结果：①相差倒置显微镜下观察各组细胞加药前后形态学无明显变化，细胞存活率均达95．0％以上。②模型组细胞计数高于对照组和氯沙坦组（P〈0．01），100mg／L和200mg／L蜂胶组低于模型组（P〈0．01）；50mg／L和100mg／L蜂胶组高于氯沙坦组（P〈0．01），200mg／L蜂胶组与氯沙坦组差异无显著性（P〉0．05）。③模型组G0／G1期细胞百分比低于对照组、氯沙坦组（P〈0．01）；100mg／L和200mg／L蜂胶组高于模型组（P〈0.01）150mg／L蜂胶组低于氯沙坦组（P〈0.05），100mg／L、200mg／L蜂胶组与氯沙坦组差异显著性（P〉0．05）。④模型组增殖细胞核抗原阳性率高于对照组、氯沙坦组（P〈0．01）；100mg／L和200mg／L蜂胶组低于模型组（P〈0．01），蜂胶各浓度组与氯沙坦组间差异无显著性意义。结论：血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞的增殖，氯沙坦能阻滞该作用；一定浓度的蜂胶水提液可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞的增殖，其机制可能与限制细胞由G1期向S期转变及增殖细胞核抗原的表达有关。     

血管平滑肌细胞增殖及分泌内皮素水平与氯沙坦和依拉普利的影响

目的:观察血管紧张素ⅡAT1受体阻滞剂氯沙坦及转换酶抑制剂依拉普利对培养的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及对血管平滑肌细胞分泌内皮素水平的影响。方法:实验于2004-03/11在华中科技大学生命学院生物物理与生物化学研究所实验室及武汉市七医院检验科完成。取大白鼠腹主动脉平滑肌细胞,用贴块法进行血管平滑肌细胞原代培养,进行消化传代后,取生长状态良好的3～6代血管平滑肌细胞,分别用含0.1,1.0,10,100μmol/L不同浓度的氯沙坦(氯沙坦组)和依拉普利(依拉普利组)的培养液培养,测定细胞倍增时间(TD=t犤log2/(logNt-logN0)犦,TD:细胞倍增时间,t:培养时间,No:接种后的细胞数,Nt:培养t小时后的细胞数),进行细胞增殖核抗原免疫组织化学检测,并计算增殖指数(增殖指数=增殖细胞核抗原阳性细胞核个数/400)。用均相竞争放射免疫分析法测定血管平滑肌细胞上清液内皮素-1的含量。结果:①培养的血管平滑肌细胞倍增时间:随氯沙坦和依拉普利浓度的逐渐增加,血管平滑肌细胞倍增时间逐渐延长(P<0.01),两组比较差异无显著性意义(P>0.05)。②增殖指数:氯沙坦组和依拉普利组增殖指数均显著降低(P<0.05或P<0.01),且呈剂量依赖性,两组间比较差异无显著性意义(P>0.05)。③培养的血管平滑肌细胞上清液内皮素-1的含量:氯沙坦组和依拉普利组在一定剂量范围内(氯沙坦组0.1～100μmol/L,依拉普利组1.0～100μmol/L)内皮素水平显著降低(P<0.05或P<0.01),两组之间比较,氯沙坦组显著低于依拉普利组(P<0.05)。结论:血管紧张素ⅡAT1受体抑制氯沙坦与血管紧张素转换酶抑制剂依拉普利均能有效抑制体外培养的血管平滑肌细胞增殖,两者作用差异无显者性,氯沙坦和依拉普利均能有效降低血管平滑肌细胞分泌内皮素水平,前者作用更显著。     

血管平滑肌细胞增殖及分泌内皮素水平与氯沙坦和依拉普利的影响

目的：观察血管紧张素Ⅱ AT1受体阻滞剂氯沙坦及转换酶抑制剂依拉普利对培养的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及对血管平滑肌细胞分泌内皮素水平的影响。方法：实验于2004-03／11在华中科技大学生命学院生物物理与生物化学研究所实验室及武汉市七医院检验科完成。取大白鼠腹主动脉平滑肌细胞，用贴块法进行血管平滑肌细胞原代培养，进行消化传代后,取生长状态良好的3-6代血管平滑肌细胞，分别用含0．1，1．0，10，100μmol／l。不同浓度的氯沙坦（氯沙坦组）和依拉普利（依拉普利组）的培养液培养，测定细胞倍增时间（T1=t[log2／（logN1-logN0）]，TD：细胞倍增时间，t：培养时间，No：接种后的细胞数，M：培养t小时后的细胞数），进行细胞增殖核抗原免疫组织化学检测，并计算增殖指数（增殖指数=增殖细胞核抗原阳性细胞核个数／400）。用均相竞争放射免疫分析法测定血管平滑肌细胞上清液内皮素-1的含量。 结果：①培养的血管平滑肌细胞倍增时间：随氯沙坦和依拉普利浓度的逐渐增加，血管平滑肌细胞倍增时间逐渐延长（P〈0．01），两组比较差异无显著性意义（P〉0．05）。②增殖指数：氯沙坦组和依拉普利组增殖指数均显著降低（P〈0．05或P〈0．01），且呈剂量依赖性，两组间比较差异无显著性意义（P〉0．05）。③培养的血管平滑肌细胞上清液内皮素-1的含量：氯沙坦组和依拉普利组在一定剂量范围内（氯沙坦组0．1～100μmol／L，依拉普利组1．0～100μmol／L）内皮素水平显著降低（P〈0．05或P〈0．01），两组之间比较，氯沙坦组显著低于依拉普利组（P〈0．05）。 结论：血管紧张素ⅡAT1受体抑制氯沙坦与血管紧张素转换酶抑制剂依拉普利均能有效抑制体外培养的血管平滑肌细胞增殖，两者作用差异无显者性，氯沙坦和依拉普利均能有效降低血管平滑肌细胞分泌内皮素水平，前者作用更显著。     

血管紧张素Ⅱ受体1反义核酸抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞心钠素合成

目的:探讨血管紧张素Ⅱ受体1反义寡核苷酸(AT1-AS-ODNs)对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞心钠素合成的生物学效应。方法:实验于2004-07/2005-07在武汉大学人民医院心血管国家重点实验室进行。体外培养乳鼠心肌细胞,将其分为4组:①对照组:无血清Opti-MEM培养48h。②血管紧张素Ⅱ组:无血清Opti-MEM培养24h 10-6mol/L血管紧张素Ⅱ刺激24h。③AT1-AS-ODNs组:200nmol/LAT1-AS-ODNs孵育24h 10-6mol/L血管紧张素Ⅱ刺激24h。④顺义序列组:200nmol/LAT1-S-ODNs孵育24h 10-6mol/L血管紧张素Ⅱ刺激24h。显微荧光技术检测脂质体包裹的AT1-AS-ODNs在心肌细胞内分布;免疫沉淀法检测血管紧张素Ⅱ受体1,2蛋白表达水平;放射性免疫法检测心钠素(ANF)表达。结果:①在脂质体的包裹下,AT1-AS-ODNs成功转染心肌细胞,120min转染效率为60%。②血管紧张素Ⅱ组血管紧张素Ⅱ受体1,2蛋白表达水平较对照组低25%,21%(P<0.05),AT1R-AS-ODNs组血管紧张素Ⅱ受体1蛋白表达水平下调60.7%(P<0.01),血管紧张素Ⅱ受体2蛋白表达水平无改变。③血管紧张素Ⅱ组心钠素表达明显高于对照组[(780±38),(430±23)μg/L,P<0.01]。AT1-AS-ODNs组心钠素表达为(589±19)μg/L,明显低于血管紧张素Ⅱ组(P<0.01),顺义序列组与对照组相比差异不显著(P>0.05)。结论:AT1-AS-ODNs可成功转染心肌细胞,通过特异性抑制血管紧张素Ⅱ受体1蛋白表达,拮抗血管紧张素Ⅱ的生物学效应。     

肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ剌激血管平滑肌细胞增殖及胶原生成的影响

目的:观察肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ剌激血管平滑肌细胞增殖及胶原生成的影响。方法:实验于2003-09/2004-09在南方医科大学珠江医院中心实验室进行。①采用组织贴壁法培养大鼠血管平滑肌细胞。②实验分组:空白对照组;1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6mol/L血管紧张素Ⅱ组;1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6mol/L肾上腺髓质素N端20肽组;1×10-7mol/L血管紧张素Ⅱ (1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6mol/L)肾上腺髓质素N端20肽组。③以3H脯氨酸掺入试验测定血管平滑肌细胞的胶原合成功能,以四氮唑盐法测定细胞增殖情况。分别观察不同浓度肾上腺髓质素N端20肽、血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞增殖及合成胶原的影响。结果:①肾上腺髓质素N端20肽及血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞的胶原合成功能的作用:肾上腺髓质素N端20肽组的3H脯氨酸掺入率与对照组相比(P>0.05),差异均无显著性。随着血管紧张素Ⅱ浓度的增高,血管平滑肌细胞的3H脯氨酸掺入率呈递增趋势。血管紧张素Ⅱ 肾上腺髓质素N端20肽组的3H脯氨酸掺入率在血管紧张素Ⅱ浓度不变的情况下,随着肾上腺髓质素N端20肽浓度的增高,血管平滑肌细胞的3H脯氨酸掺入率呈递减趋势,各组之间差异有显著意义(P<0.01)。②肾上腺髓质素N端20肽及血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞增殖的影响:随着肾上腺髓质素N端20肽浓度的增高,四氮唑盐比色值差异无显著性(P均>0.05)。随着血管紧张素Ⅱ浓度的增高,四氮唑盐比色值增也明显增高,各组间差异有显著性意义(P均<0.01)。血管紧张素Ⅱ 肾上腺髓质素N端20肽组中,在血管紧张素Ⅱ浓度不变的情况下,随着肾上腺髓质素N端20肽浓度的增高,四氮唑盐比色值均显著降低(P<0.01)。结论:肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ剌激血管平滑肌细胞增生及胶原的生成起明显抑制作用。     

血管紧张素Ⅱ诱导RIN-m细胞凋亡的实验研究

目的:以不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及AngⅡ1型受体(AT1受体)拮抗剂氯沙坦作用于RIN-m细胞(来源于射线诱导的褐鼠胰岛素细胞瘤),观察RIN-m合成及分泌胰岛素功能及细胞凋亡的情况.为进一步在临床中研究血管紧张素受体拮抗剂对糖代谢的改善作用提供实验证据.方法:细胞的培养及干预:RIN-m细胞(40～50代)接种于3 mL含5.6 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培养液中.A组加入10μL生理盐水,B、C、D、E组加入终浓度分别为0.1、1、10及100 nmol/L的AngⅡ,F组在加入100 nmol/L的血管紧张素Ⅱ醋酸盐前10 mim给予氯沙坦1 μmol/L.各组处理后继续置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中48 h.RIN-m细胞行流式细胞仪(Annexin V/FITC)及TUNEL检测凋亡.结果:两种凋亡检测结果大致相似,TUNNEL检测各组凋亡率分别为(7.50±1.18)%,(8.15±0.97)%,(12.67±1.35)%,(15.88±1.75)%,(20.66±0.80)%,(7.74±0.84)%;流式细胞仪检测各组凋亡率分别为(7.62±0.87)%,(8.74±1.31)%,(14.64±1.48)%,(16.47±0.88)%,(20.51±1.03)%,(7.63±0.79)%.AngⅡ干预组凋亡率高于空白对照组,并呈剂量-效应依赖关系,氯沙坦预处理+AngⅡ组与空白对照组比较差异无统计学意义(P=0.98).结论:AngⅡ可能通过与胰岛β细胞表面AT1受体结合而诱导RIN-m细胞凋亡,氯沙坦可抑制AngⅡ的促凋亡作用.     

血管内皮细胞内皮素分泌功能与茶多酚及血管紧张素Ⅱ的相关性

背景:内皮素是一种强效血管收缩物质,血管紧张素Ⅱ可以刺激血管内皮细胞分泌内皮素,通过检测血液或细胞培养液中的内皮素含量,可以间接反映血管内皮细胞的功能及损伤情况,因此,增强血管内皮细胞对损伤因素的抵抗作用意义重大.茶多酚是茶叶药效的主要活性成分,具有抗动脉粥样硬化、对抗血管内皮细胞损伤、预防心血管疾病等作用.目的:通过建立血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞损伤模型,观察了血管紧张素Ⅱ作用不同时间后血管内皮细胞分泌内皮素含量的变化以及不同浓度的茶多酚对这种变化的影响,以探讨茶多酚对血管内皮细胞的保护作用.设计:观察性实验.单位:解放军海军总医院航空潜水医学中心.材料:实验于2005-03/09在解放军海军总医院航空潜水医学中心实验室完成.主要材料:血管紧张素Ⅱ(Sigma公司);茶多酚(浙江大学茶学系);血管内皮细胞(美国CBI公司的人大动脉血管内皮细胞体系).方法:将培养的血管内皮细胞分为4个组:①对照组:不加特殊试剂,加入等体积的细胞培养液,分别在加液前和加液后0.5,6,24 h提取上清液100μL.②血管紧张素Ⅱ组:在细胞培养液中加入血管紧张素Ⅱ,使培养液中血管紧张素Ⅱ的终浓度为10-7 mol/L,余同对照组.③高浓度茶多酚 血管紧张素Ⅱ组:将茶多酚加入细胞培养液中,使培养液中茶多酚终浓度为50 mg/L,余同血管紧张素Ⅱ组.④低浓度茶多酚 血管紧张素Ⅱ组:加入茶多酚,使培养液中茶多酚终浓度为25 mg/L,余同血管紧张素Ⅱ组.采用放射免疫法测定血管紧张素Ⅱ及茶多酚作用前及作用后0.5,6,24 h各组细胞培养上清中的内皮素含量.主要观察指标:内皮素含量.结果:①血管紧张素Ⅱ组培养上清的内皮素含量显著高于对照组(P＜0.01).②高浓度茶多酚在作用6 h和24 h 后,内皮素含量较血管紧张素Ⅱ组显著下降(P＜0.01);而低浓度茶多酚在各作用时间点均较高浓度茶多酚组及血管紧张素Ⅱ组显著下降(P＜0.01).结论:茶多酚对血管紧张素Ⅱ所致血管内皮细胞分泌内皮素的功能具有抑制作用,提示茶多酚对血管内皮细胞具有保护作用;且低浓度茶多酚的保护作用要强于高浓度茶多酚.     

丹参酮ⅡA对心肌细胞肥大的影响

目的:观察丹参酮ⅡA对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大及原癌基因c-fosmRNA表达的影响。方法:实验于2005-09/12在十堰市人民医院临床研究所完成。①将100只出生后1周内乳鼠心肌细胞原代培养24h后,按随机数字表法分为6组:对照组:心肌细胞培养液中未加入任何药物;血管紧张素Ⅱ组:心肌细胞培养液中加入1×10-6mol/L血管紧张素Ⅱ;血管紧张素Ⅱ 丹参酮ⅡA组:心肌细胞培养液中预先加入1×10-5mol/L丹参酮ⅡA作用30min后,再加入1×10-6mol/L血管紧张素Ⅱ(中国药品生物制品检定所提供,批号0766-200010);血管紧张素Ⅱ 缬沙坦组:心肌细胞培养液中预先加入1×10-6mol/L缬沙坦后,再加入1×10-6mol/L血管紧张素Ⅱ;丹参酮ⅡA组:心肌细胞培养液中加入1×10-5mol/L丹参酮ⅡA;缬沙坦组:心肌细胞培养液中加入1×10-6mol/L缬沙坦。所有实验均重复3次。②持续加药作用7d后采用流式细胞仪检测心肌细胞总蛋白含量。采用3H-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白质合成速率。采用反转录聚合酶链式反应检测心肌细胞原癌基因c-fosmRNA表达。③计量资料差异比较采用单因素方差分析。结果:①血管紧张素Ⅱ可以使心肌细胞蛋白总量增多(P<0.01),预先加入丹参酮ⅡA或缬沙坦作用30min,可阻断血管紧张素Ⅱ的作用(P<0.01)。②血管紧张素Ⅱ作用24h后,血管紧张素Ⅱ组心肌细胞合成速率明显高于对照组[(1900±97),(1205±75)min-1,P<0.01],丹参酮ⅡA和缬沙坦本身对心肌细胞蛋白质的合成没有影响,但能抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞蛋白质合成速率的增加(P<0.01)。③在培养液中加入血管紧张素Ⅱ作用30min后,c-fosmRNA的表达显著增强(P<0.01),预先加入丹参酮ⅡA或缬沙坦作用30min,可阻断血管紧张素Ⅱ的作用(P<0.01),而丹参酮ⅡA和缬沙坦本身对原癌基因c-fosmRNA的表达无影响。结论:丹参酮ⅡA可以抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大,这与其抑制了原癌基因c-fos的表达有关。     

阻断局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节对大鼠肺间质纤维化肿瘤坏死因子α表达的影响

目的:观察阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节对实验性肺纤维化大鼠肺组织肿瘤坏死因子α的影响。方法:实验于2005-08/2006-08在南华大学附属第一医院临床研究所及南华大学医学院组胚、生理实验室完成。取6周龄SD大鼠50只,随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组、螺内酯组和氯沙坦组,每组10只。正常对照组气管内注入生理盐水,其他40只SD大鼠气管内注入博莱霉素5mg/kg复制肺纤维化模型。次日胃管内灌注血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利60mg/kg(卡托普利组)、血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体阻断剂氯沙坦10mg/kg(氯沙坦组)、醛固酮受体拮抗剂螺内酯100mg/kg(螺内酯组)、等量生理盐水(模型组和正常对照组),1次/d。各组动物均于给药后第28天处死,通过苏木精-伊红染色和Mallory染色观察肺组织病理变化,用免疫组织化学法和图像分析系统定量检测肺组织肿瘤坏死因子α的表达。结果:41只大鼠进入结果分析。①肿瘤坏死因子α蛋白表达:模型组高于正常对照组(166.82±4.14,61.44±1.94,P<0.01),卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组低于模型组(107.50±4.60,113.64±8.47,118.00±7.14,P<0.01),各用药组间无差异。②模型组肺泡炎程度、肺纤维化程度显著高于正常对照组(P<0.01,0.05),卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组较模型组好转(P<0.01),各用药组间无差异。结论:肺局部肾素-血管紧张素-醛固酮不同环节可能通过刺激肺部肿瘤坏死因子α表达而发挥致纤维化作用,阻断其不同环节可阻止肿瘤坏死因子α水平升高,抑制肺纤维化形成。     

肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞增殖及胶原生成的影响

目的观察肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞增殖及胶原生成的影响.方法实验于2003-09/2004-09在南方医科大学珠江医院中心实验室进行.①采用组织贴壁法培养大鼠血管平滑肌细胞.②实验分组空白对照组;1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6mol/L血管紧张素Ⅱ组;1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6mol/L肾上腺髓质素N端20肽组;1×10-7mol/L血管紧张素Ⅱ+(1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6mol/L)肾上腺髓质素N端20肽组.③以3H脯氨酸掺入试验测定血管平滑肌细胞的胶原合成功能,以四氮唑盐法测定细胞增殖情况.分别观察不同浓度肾上腺髓质素N端20肽、血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞增殖及合成胶原的影响.结果①肾上腺髓质素N端20肽及血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞的胶原合成功能的作用肾上腺髓质素N端20肽组的3H脯氨酸掺入率与对照组相比(P＞0.05),差异均无显著性.随着血管紧张素Ⅱ浓度的增高,血管平滑肌细胞的3H脯氨酸掺入率呈递增趋势.血管紧张素Ⅱ+肾上腺髓质素N端20肽组的3H脯氨酸掺入率在血管紧张素Ⅱ浓度不变的情况下,随着肾上腺髓质素N端20肽浓度的增高,血管平滑肌细胞的3H脯氨酸掺入率呈递减趋势,各组之间差异有显著意义(P＜0.01).②肾上腺髓质素N端20肽及血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞增殖的影响随着肾上腺髓质素N端20肽浓度的增高,四氮唑盐比色值差异无显著性(P均＞0.05).随着血管紧张素Ⅱ浓度的增高,四氮唑盐比色值增也明显增高,各组间差异有显著性意义(P均＜0.01).血管紧张素Ⅱ+肾上腺髓质素N端20肽组中,在血管紧张素Ⅱ浓度不变的情况下,随着肾上腺髓质素N端20肽浓度的增高,四氮唑盐比色值均显著降低(P＜0.01).结论肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ剌激血管平滑肌细胞增生及胶原的生成起明显抑制作用.     

微小RNA-146a影响血管平滑肌细胞增殖和凋亡的机制

背景:微小RNA-146a通过负调控核因子κB信号通路介导免疫细胞和肿瘤细胞的增殖,但是否参与血管平滑肌细胞的增殖或凋亡未见研究报道。目的:观察微小RNA-146a对血管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制。方法:采用脂质体2000将50nmol/L微小RNA-146a反义寡核苷酸转染至大鼠血管平滑肌细胞,以转染错义链及PBS的细胞作为对照。结果与结论:微小RNA-146a反义寡核苷酸转染48h后,血管平滑肌细胞增殖减少(P<0.01)、凋亡增多(P<0.05),细胞的微小RNA-146a水平明显降低(P<0.01),核因子κBp65、增殖细胞核抗原蛋白表达明显降低(P<0.05)。说明微小RNA-146a可以促进血管平滑肌细胞的增殖,抑制凋亡,其机制与增加核因子κBp65表达有关。     

丹参酮ⅡA对大鼠血管平滑肌细胞的增殖作用

目的:观察丹参酮ⅡA对高糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用,分析该作用与丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的关系。方法:实验于2004-01/2005-06在东南大学医学院发育与疾病相关基因实验室完成。①取大鼠胸主动脉,用组织贴壁法原代培养大鼠血管平滑肌细胞并传代,实验使用第4～8代细胞。②按实验分组干预细胞,正常对照组,培养液含5mmol/L葡萄糖;高糖组,培养液含30mmol/L葡萄糖;高糖对照组,培养液含30mmol/L葡萄糖 10g/L二甲亚砜;丹参酮ⅡA组,培养液含30mmol/L葡萄糖 0.5mg/L丹参酮ⅡA;U0126组,培养液含30mmol/L葡萄糖 25μmol/LU0126。③用二步法测定0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0mg/L丹参酮ⅡA对血管平滑肌细胞的毒性。④BrdU掺入DNA的ELISA法测定细胞内DNA合成水平。⑤同位素示踪法测定丝裂原活化蛋白激酶活性。结果:①高糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞呈现快速增殖状态。②当丹参酮ⅡA剂量大于1.0mg/L时,有一定的细胞毒性。四甲基噻唑蓝法测定结果表明1.0,2.0,5.0,10.0mg/L丹参酮ⅡA组血管平滑肌细胞线粒体脱氢酶活性明显低于正常对照组(分别为0.654±0.023,0.580±0.032,0.465±0.041,0.376±0.053,0.840±0.085,P<0.01),表明此浓度可造成细胞功能障碍,有明显的细胞毒性。③随着丹参酮ⅡA作用浓度的增加,细胞内BrdU掺入DNA的量逐渐下降,0.03125mg/L丹参酮ⅡA与高糖对照组相比差异有显著性意义(分别为0.958±0.086,1.059±0.047,P<0.05),0.0625,0.125,0.25,0.5mg/L丹参酮ⅡA与高糖对照组相比差异有非常显著性意义(分别为0.865±0.058,0.781±0.099,0.738±0.071,0.616±0.028,1.059±0.047,P<0.01)。④高糖组血管平滑肌细胞内丝裂原活化蛋白激酶的活性相对于正常对照组显著升高[分别为(1048.59±94.78),(395.82±43.53)μkat/g,P<0.01],丹参酮ⅡA组和U0126组丝裂原活化蛋白激酶活性低于高糖组[分别为(450.55±50.47),(417.30±62.96),(1048.59±94.78)μkat/g,P<0.01]。结论:丹参酮ⅡA对高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖具有明显抑制作用的机制可能是其部分阻断了丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路。     

糖尿病大鼠肾组织核因子κB活性与血管紧张素系统的关系

背景:目前已知血管紧张素Ⅱ在糖尿病肾病发病中起重要作用。因此,核因子κB对糖尿病大鼠肾组织血管紧张素系统可能有调节作用。目的:观察抑制核因子κB活性与糖尿病大鼠肾组织血管紧张素Ⅱ及其1型受体mRNA表达的关系。设计:完全随机分组设计,对照实验。材料:实验于2000-03/04在中山医科大学实验动物中心完成。选用51只纯种清洁级雄性Wistar大鼠。方法:①对其中39只大鼠进行造模,采用链脲佐菌素溶于枸橼酸缓冲液穴0.1mmol/L,pH=4.5雪,按60mg/kg腹腔内注射,制备糖尿病模型,空腹血糖维持在13.9mmol/L以上则模型制备成功。随机将造模后39只大鼠分为3组:模型组穴n=17,未给予其他干预措施,正常饲养雪和吡咯烷二硫基甲酸酯(核因子κB活性抑制剂)干预组眼n=22,腹腔内注射吡咯烷二硫基甲酸酯(剂量20mg/kg),2次/d演。其余12只为正常对照组,未造成糖尿病模型,正常饲养。②各组饲养18周后取出肾脏,电泳迁移率变动分析技术检测核因子κB活性,采用反转录聚合酶链反应法检测血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA表达,采用放射免疫分析法检测血管紧张素Ⅰ与血管紧张素Ⅱ含量。37℃水浴后的血管紧张素Ⅰ水平减去4℃检测的血管紧张素Ⅰ水平则为肾素活性。③计量资料差异性比较采用单因素方差分析,非正态分布资料经正态转换后再作统计学处理。主要观察指标:各组大鼠肾组织血管紧张素Ⅰ,Ⅱ含量和肾素、核因子κB活性及血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA表达比较。结果:正常对照组、模型组、吡咯烷二硫基甲酸酯干预组大鼠各脱失1,6,13只,进入结果分析11,11,9只。①核因子κB活性:模型组明显高于正常对照组和吡咯烷二硫基甲酸酯干预组(P<0.01),正常对照组与吡咯烷二硫基甲酸酯干预组相近。②肾组织肾素活性:3组相近。③肾组织血管紧张素Ⅰ含量:模型组明显高于正常对照组和吡咯烷二硫基甲酸酯组(P<0.01)。④肾组织血管紧张素Ⅱ含量:模型组与正常对照组相近,吡咯烷二硫基甲酸酯组明显低于模型组和正常对照组(P<0.01)。血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA表达:模型组明显低于正常对照组(P<0.01);吡咯烷二硫基甲酸酯组明显低于模型组和正常对照组(P<0.01)。结论:糖尿病大鼠肾组织核因子κB活性增加,抑制核因子κB活性后可导致糖尿病大鼠肾组织血管紧张素Ⅱ水平及血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA表达下降。     

蜂胶对高脂饲料诱导的动脉粥样硬化家兔的干预效应

目的：观察蜂胶对高脂诱导的动脉粥样硬化的干预作用.方法：实验于2003-05/11在泰山医学院动物室、诊断学实验室和形态学实验室完成.选择雄性新西兰家兔24只,随机分为4组,对照组、模型组、蜂胶组及卡托普利组各6只.①对照组：喂饲基础颗粒饲料.②模型组：喂饲高脂饲料（基础颗粒饲料＋100 g/L猪油＋10 g/L胆固醇）.③蜂胶组：在喂饲高脂饲料的基础上,灌胃蜂胶0.35 g/d.④卡托普利组：在喂饲高脂饲料的基础上,灌胃给予卡托普利15 mg/d.每只家兔约食饲料110～140 g/d,12周末处死,取血清及动脉标本待查.①测定血清总胆固醇,三酰甘油,高、低密度脂蛋白胆固醇水平采用酶法.②测定血清超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮水平测分别采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法、硝酸还原酶法.③组织学观察：麻醉处死动物后立即解剖分离主动脉,记录主动脉壁粥样斑块大小.截取主动脉降部切片后光镜下观察主动脉壁及内膜损伤程度.④免疫组化法检测：增殖细胞核抗原染色、原位细胞凋亡染色均使用链酶亲和素-过氧化物酶法.把增殖细胞核抗原切片及原位细胞凋亡切片放在光镜下各取10个视野,计数每个视野斑块中的阳性细胞数均值作为阳性细胞数.把苏木精-伊红切片放在光镜下取与前面切片相同部位的10个视野,计数每个视野斑块中所有细胞数的均值作为细胞总数.增殖指数=增殖细胞核抗原染色阳性细胞数/细胞总数&;#215;100%;凋亡指数=原位细胞凋亡染色阳性细胞数/细胞总数&;#215;100%.结果：所有家兔全部进入结果分析,无脱落.①各组家兔动脉粥样硬化的病理改变：模型组出现典型动脉粥样硬化病理变化,全部动脉内皮下层明显增生、增厚,为多量泡沫细胞聚集形成,伴有纤维组织、无定型物质及钙盐沉积.蜂胶组也有病理改变,但内皮下仅轻、中度增生,泡沫细胞聚集,未见纤维组织和无定型物质.②各组家兔血脂水平的比较：蜂胶组、卡托普利组家兔的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平均明显低于模型组（P＜0.01）,而蜂胶组显著低于卡托普利组（P＜0.01）.卡托普利组、蜂胶组家兔的三酰甘油水平显著低于模型组（P＜0.05～0.01）.③各组家兔血清超氧化物歧化酶、丙二醛及一氧化氮水平的影响：蜂胶组家兔超氧化物歧化酶水平明显高于模型组和卡托普利组（P＜0.01）.蜂胶组血清丙二醛含量显著低于模型组和卡托普利组（P＜0.05～0.01）.蜂胶组、卡托普利组血清NO2^-/NO3^-含量显著高于模型组（P＜0.05）.④各组家兔免疫组化法检测结果：蜂胶组、卡托普利组家兔的增殖指数、凋亡指数均显著低于模型组（P＜0.01）.结论：蜂胶能有效地预防实验性动脉粥样硬化的形成,其作用途径可能和其降低斑块细胞的增殖和凋亡以及降脂、抗氧化、保护内皮作用有关.     

血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖过程中呋喃二氢吡啶二羧酸酯的抑制作用

背景血管平滑肌细胞是血管壁的主要细胞成份之一,在动脉粥样硬化中所起的病理作用已得到证实和认同.如何抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移而起到预防冠心病的作用已成为人们研究的热点问题之一.目的观察呋喃二氢吡啶二羧酸酯对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖的影响.设计以体外培养的兔胸主动脉血管平滑肌细胞为研究对象进行随机对照研究.单位一所军医大学附属医院心脏内科.材料实验于2003-08/2004-06在第四军医大学西京医院心脏内科实验室完成,选用新西兰兔5只,将动物细胞随机分为对照组,血管紧张素Ⅱ组,血管紧张素Ⅱ+吡啶二羧酸酯组.方法高脂喂养新西兰兔,再用球囊损伤其胸主动脉内摸,取胸主动脉分离血管平滑肌细胞进行培养,实验采用培养的兔血管平滑肌细胞,应用3H-TdR掺入法,观察在血管紧张素Ⅱ促进血管平滑肌细胞增殖过程中,呋喃二氢吡啶二羧酸酯对血管平滑肌细胞DNA合成的影响及其时间效应.主要观察指标记录各组细胞3H-TdR掺入的放射强度,显示兔血管平滑肌细胞增殖过程中DNA的合成情况.结果血管紧张素Ⅱ可促进兔血管平滑肌细胞DNA的合成,36 h时细胞DNA的合成达到高峰,与对照组相比差异有显著性意义(358.00±49.01 vs 272.42±54.96,P＜0.01).呋喃二氢吡啶二羧酸酯对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用,并呈现出明显的浓度依赖关系,即随着呋喃二氢吡啶二羧酸酯浓度的升高其血管平滑肌细胞增殖的抑制率也逐渐增加,36 h时78.40 μmol/L的呋喃二氢吡啶二羧酸酯与0.08 μmol/L的呋喃二氢吡啶二羧酸酯相比其抑制作用明显增强(281.50±15.28 vs 349.25±32.10,P＜0.05).结论呋喃二氢吡啶二羧酸酯可明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的兔血管平滑肌细胞增殖,并存在一定的量效依赖关系及时间反应性,为动脉粥样硬化的一级康复预防提供了理论依据.     

猪主动脉内皮细胞在血管紧张素作用下血管活性物质变化及丹参酮ⅡA的保护效应

背景:导致血管内皮细胞损伤的因素中,肾素-血管紧张素系统、尤其是局部肾素-血管紧张素系统所产生的血管紧张素Ⅱ起着重要的病理生理作用。目的:观察丹参酮ⅡA对血管紧张素Ⅱ作用下的血管内皮细胞分泌一氧化氮及其内皮型一氧化氮合酶基因表达的影响和细胞内游离钙离子浓度水平的改变,探讨丹参酮ⅡA对血管内皮细胞的保护作用。设计:观察对比实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊内科。材料:实验于2006-03/10在华中科技大学同济医学院基础医学实验中心完成。实验用猪主动脉由同济医学院病理生理教研室提供。方法:采用硝酸还原法、逆转录聚合酶链反应,分别检测不同浓度(10-8～10-6mol/L)作用不同时间(1,6,24h)的血管紧张素Ⅱ对培养的猪主动脉内皮细胞产生一氧化氮及其内皮型一氧化氮合酶mRNA表达的影响;然后比较在10-6mol/L的血管紧张素Ⅱ作用的不同点(0,6h)加入50mg/L浓度的丹参酮ⅡA,分别检测作用1,6,24h后内皮细胞的一氧化氮生成和内皮型一氧化氮合酶的基因表达变化。用激光共聚焦扫描显像系统检测内皮细胞内游离钙离子浓度水平的变化。主要观察指标:①一氧化氮含量。②内皮型一氧化氮合酶mRNA表达。③游离钙离子浓度。结果:①随着血管紧张素Ⅱ浓度的增加、作用时间的延长,内皮细胞一氧化氮的产生及内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达呈顺序下降(P<0.01)。②丹参酮ⅡA各组一氧化氮的产生及内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达明显高于血管紧张素Ⅱ组,在丹参酮ⅡA作用1,6h,血管紧张素Ⅱ 丹参酮ⅡA组一氧化氮的产生及内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达明显高于血管紧张素Ⅱ6h 丹参酮ⅡA组(P<0.05);随着作用时间延长至24h,两组间差异无显著性(P>0.05)。③主动脉内皮细胞游离钙离子浓度:血管紧张素Ⅱ组显著高于空白对照组(P<0.01),丹参酮 血管紧张素Ⅱ组显著低于血管紧张素Ⅱ组(P<0.05)。结论:丹参酮ⅡA可抑制血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞分泌一氧化氮以及细胞内皮型一氧化氮合酶基因表达的负性作用,可能通过多种途径对血管内皮细胞及其功能起到保护作用。     

球囊损伤血管内皮后AT-1受体mRNA的变化及AT1R拮抗剂的作用

目的 研究球囊致血管损伤后血管内膜增生的过程、血管紧张素ⅡAT－1受体mRNA的变化及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（氯沙坦）对它们的影响。方法 球囊剥脱大鼠主动脉内皮，并随机分为对照组（n=24）、手术组（n=24）和氯沙坦治疗组（n=24）和氯沙坦治疗组（n＝24）。分别在术后3、7、14和28d，取主动脉，通过组织学检查和逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术检测内膜增生的情况、血管紧张素ⅡAT－1受体mRNA的水平及非肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂氯沙坦（30mg/kg/d）对它们的影响。结果 ①AT－1受体mRNA于术后3d已明显增高，并持续至术后14d。②内皮损伤后3d已有增殖的血管平滑肌细胞（VSMC）移行至内膜层；损伤后7d内膜开始增生；伤后14d VSMC的增殖及内膜增生更为明显；术后28dVSMC的增殖明显减弱，细胞外基质增加，内膜继续增生。③使用氯沙坦后AT－1受体mRNA的表达增加，但VSMC的移行、增殖减弱，骨膜增生程度减轻。结论 血管损伤后内膜增生的过程中AT－1受体mRNA的表达增加，氯沙坦增加AT－1受体mRNA的表达，但能抑制内膜增生的程度。     

灯盏花素对糖尿病大鼠早期肾皮质一氧化氮和血管紧张素Ⅱ水平的影响

目的:以肾脏肥大指数、肾小球形态结构、一氧化氮和血管紧张素Ⅱ水平为指标,观察灯盏花素对糖尿病大鼠早期肾脏的保护作用。方法:实验于2006-03/06在遵义医学院珠海校区中心实验室完成。实验分组:雄性Wistar大鼠34只,腹腔单次注射链脲佐菌素65mg/kg制备糖尿病大鼠模型,将造模成功(血糖≥16.65mmol/L)30只大鼠随机分为糖尿病组和灯盏花素治疗组,每组10只;另设正常对照组10只。实验过程:灯盏花素治疗组给予20mg/(kg·d)腹腔注射灯盏花素注射液持续4周,糖尿病组及正常对照组给予同体积的生理盐水。实验评估:①4周后计算肾脏肥大指数(肾脏肥大指数=双侧肾质量/体质量׉)。②苏木精-伊红染色观察肾小球病理形态变化。③硝酸还原酶法测定血清及肾皮质组织一氧化氮水平。④放免法测血浆及肾皮质组织血管紧张素Ⅱ水平。结果:参加实验34只大鼠,有4只未达糖尿病成模标准,最终30只大鼠进入结果分析。①肾脏肥大指数:糖尿病模型组、灯盏花素治疗组显著高于正常对照组[(13.29±4.73)/1000,(11.07±2.19)/1000,(4.78±0.06)/1000,P<0.01],灯盏花素治疗组低于糖尿病模型组(P<0.05)。②肾小球病理形态:正常对照组大鼠肾小球血管袢薄而清晰,内皮细胞和系膜细胞数目正常;糖尿病大鼠肾小球血管壁可见玻璃样变性,基底膜增厚,系膜基质增生;灯盏花素治疗后肾小球血管壁未见明显变性,基底膜未见明显增厚,其病理变化明显改善。③血清及肾皮质组织一氧化氮水平:糖尿病模型组、灯盏花素治疗组显著高于正常对照组[血清一氧化氮水平:(31.36±4.21),(27.03±3.54),(25.21±3.39)μmol/L,P<0.05;肾皮质组织一氧化氮水平:(1.95±0.25),(1.27±0.32),(0.73±0.12)μmol/g,P<0.01]。灯盏花素治疗组低于糖尿病模型组(P<0.05,P<0.01)。④血浆和肾皮质组织血管紧张素Ⅱ水平:糖尿病模型组显著高于正常对照组[血浆血管紧张素Ⅱ水平:(693.98±297.22),(356.48±85.21)ng/L,P<0.05;肾皮质组织血管紧张素Ⅱ水平:(6964.56±2128.48),(3127.07±1519.98)pg/g,P<0.01]。灯盏花素治疗组低于糖尿病模型组(P<0.05)。结论:灯盏花素在降低糖尿病大鼠肾脏肥大和改善肾脏形态结构的同时还可降低外周血及肾皮质组织一氧化氮与血管紧张素Ⅱ水平,在一定程度上可改善糖尿病早期的肾损害。     

32P内照射防治血管成形术后再狭窄的实验研究

目的:观察纯β射线32P血管内照射对经皮血管腔内血管成形术(PTA)后平滑肌细胞增生及内膜增殖的影响,研究β射线血管内照射对血管成形术后再狭窄的抑制效应。材料和方法:雌性大白兔18只,随机分成对照组和照射组,采用Clowes球囊扩张法制作右侧髂动脉再狭窄模型,对照组球囊内充盈生理盐水,照射组球囊内充盈液体放射源32P,根据观察时间点的不同将对照组和照射组均随机分成3天组、10天组和4周组,每组3只。在不同的观察时间点对标本进行组织病理、免疫组织化学和电镜分析。结果:光镜下:PTA后3天对照组内弹力板处可见少量增殖的平滑肌细胞,照射组内弹力板处未见增殖的平滑肌细胞;10天对照组血管内膜可见大量增殖的平滑肌细胞,照射组血管内膜仅见少量增殖的平滑肌细胞;4周对照组动脉壁明显增厚,血管腔明显狭窄,照射组动脉壁厚度正常,血管腔未见狭窄(P<0.01)。增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色:PTA后3天和10天PCNA标记指数(PCNALI)对照组明显高于照射组(P<0.01);对照组的阳性细胞数尤以PTA后10天为高(P<0.01);4周,对照组和照射组阳性细胞数均明显减少;电镜下:PTA后3天对照组平滑肌细胞呈增生状态,照射组平滑肌细胞呈静止状态;10天对照组平滑肌细胞呈合成表型,照射组平滑肌细胞变性坏死,合成减少;4周对照组动脉壁内膜仍有合成表型的平滑肌细胞,照射组平滑肌细胞呈收缩表型。结论:血管内照射能显著降低平滑肌细胞的增殖,从而起到抑制再狭窄作用,平滑肌细胞的增殖和胶原的合成受到抑制在血管内照射抑制血管成形术后再狭窄的过程中起重要作用。     

干扰素-γ对血管紧张素II诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

目的　观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖的作用及干扰素 -γ对其增殖的影响。方法　幼龄Wistar大鼠 (4周龄 ) 1 2只 ,分成对照组、血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )组、干扰素 -γ组和干扰素 -γ +AngⅡ组 ,采用组织块贴壁法培养胸主动脉平滑肌细胞 ,分别测定3H -胸腺嘧啶 (3H -TdR)、3H -亮氨酸 (3H -Leu)的掺入量和细胞周期中各期细胞构成比。结果　AngⅡ (0 1 μmol/L)作用 2 4h能使VSMCs的3H -TdR与3H -Leu的掺入量比对照组增多 ,且S期和G2 /M期细胞增多 ,细胞增殖指数增大 ;干扰素 -γ组无以上作用。与AngⅡ组相比 ,干扰素 -γ(50 0U/mL) +AngⅡ组3H -TdR、3H -Leu的掺入量明显减少 ,S期细胞构成比和细胞增殖指数亦明显减少。结论　AngⅡ对血管平滑肌细胞有促增殖作用 ,这种促增殖作用能被干扰素 -γ所拮抗