侵袭性真菌感染实验室诊断研究进展

随着广谱抗生素、激素免疫抑制剂及抗肿瘤药物的广泛应用,导管插管的普遍开展,侵袭性真菌感染(IFI)明显增多,其患病率和病死率居高不下。IFI的病原菌主要由假丝酵母菌、曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属组成。因此,及时准确地诊断侵袭性真菌感染显得格外重要。     

侵袭性真菌感染实验室诊断研究进展

随着广谱抗生素、激素免疫抑制剂及抗肿瘤药物的广泛应用,导管插管的普遍开展,侵袭性真菌感染（IFI）明显增多,其患病率和病死率居高不下。IFI的病原菌主要由假丝酵母菌、曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属组成。因此,及时准确地诊断侵袭性真菌感染显得格外重要。     

（1,3）-β-D葡聚糖检测对侵袭性真菌感染早期诊断的意义

目的 探讨血浆（1,3）β D葡聚糖检测（G试验）在侵袭性真菌感染（IFI）早期诊断中的价值.方法 选择2012年1月-12月间在新疆医科大学第一附属医院住院的疑似IFI患者204例,根据IFI诊断标准,将研究对象分为IFI组和非IFI组,应用MB-80微生物动态快速检测系统定量检测血浆（1,3）-β-D葡聚糖（BDG）的含量,比较两组BDG的阳性率,及不同真菌感染者BDG浓度的差异,用ROC曲线法确定BDG的最佳诊断值,并评价G试验对IFI早期诊断的价值.结果 204例患者中血浆BDG阳性117例,总阳性率为57.4％,其中ICU病房阳性率最高,为90.7％.204例患者中,临床诊断IFI患者99例,真菌培养阳性标本主要来源于呼吸道,占75.8％.其中白假丝酵母菌感染者BDG高于曲霉菌感染者（t=2.514,P＜0.05）.以厂家给定的值10 pg/ml为诊断界值,IFI组BDG阳性率明显高于非IFI组（χ^2=127.069,P＜0.01）.BDG用于IFI诊断的灵敏度和特异度分别为98.0％和80.8％.ROC曲线法确定的最佳诊断界值为16.2 pg/ml,以该值为阈值,特异度可提高到81.7％,ROC曲线下面积为0.920.结论 血浆BDG葡聚糖检测可用于IFI的早期诊断.以16.2 pg/ml为阈值可适当提高诊断效率.     

血浆(1,3)-β-D葡聚糖检测对侵袭性真菌感染的诊断价值

目的 探讨血浆(1,3)-β-D葡聚糖检测(G试验)对侵袭性真菌感染(IFI)的临床诊断价值。方法 2013年1~9月收集IFI组67例、非IFI组61例及健康对照组48例血浆标本,应用动态浊度法检测血浆(1,3)-β-D葡聚糖水平,通过受试者工作特征曲线(ROC)确定G试验最佳临界值。结果 IFI组、非IFI组及健康对照组血浆(1,3)-β-D葡聚糖水平皆为非正态分布。IFI组的血浆(1,3)-β-D葡聚糖水平中位数208.00pg/mL明显高于非IFI组61.30pg/mL(Z=-5.083,P<0.01)和健康对照组31.16pg/mL(Z=-8.288,P<0.01)。G试验用于诊断IFI的ROC曲线下面积为0.846,最佳临界值为90.49pg/mL,其对应的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为86.6%、77.1%、69.9%和90.3%;同时,真菌培养诊断IFI的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为53.7%、94.5%、85.7%和61.9%。结论 血浆(1,3)-β-D葡聚糖检测灵敏度高,阴性预测值好,但有时发生假阳性,建议临床在诊断IFI时,动态检测G试验并联合真菌培养以提高IFI的诊断效率。     

女性生殖道念珠菌病病原体检测方法探讨

目的比较不同检验方法在女性生殖道念珠菌病诊断中的价值。方法收集门诊高度怀疑女性生殖道念珠菌病就诊者的阴道分泌物标本640例,分别采用直接真菌涂片法、实时荧光PCR定性法和念珠菌显色培养法进行检测,并以显色培养法为金标准对试验数据进行统计分析。结果直接真菌涂片阳性198例,实时荧光PCR定性检测结果真菌阳性296例,其中白色念珠菌234例,光滑假丝酵母菌39例,热带假丝酵母菌23例,白色念珠菌合并热带假丝酵母菌5例;显色培养法检测结果阳性287例,其中白色念珠菌229例,光滑假丝酵母菌36例,热带假丝酵母菌22例,白色念珠菌合并热带假丝酵母菌3例。三种方法检出率比较,直接真菌涂片法低于显色培养法和实时荧光PCR定性法(P0.05),实时荧光PCR定性法与显色培养法比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论直接真菌涂片检测虽然操作简单、快速,但漏检率高;念珠菌显色培养检出率高,但耗时长;实时荧光PCR定性法简单快速,特异性强,灵敏度高,检出率高,是女性生殖道念珠菌病诊断值得推广应用的首选方法。     

荧光定量PCR定量检测5种假丝酵母菌方法的建立

目的建立并评价从血液标本中检测5种假丝酵母菌的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法以5种假丝酵母菌共有的高度保守序列为靶序列,设计特异引物和探针进行检测,优化定量PCR体系,并进行方法学评价。结果建立的荧光定量PCR方法,其线性范围为101~109CFU/m L;灵敏度为5 CFU/m L;批内和批间CV值均5%;对19份模拟血液标本进行检测,其中分别含有5种假丝酵母菌的标本均为阳性,而分别含有常见血液感染曲霉菌和细菌的检测结果均为阴性。结论建立的检测血中假丝酵母菌荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,可对常见的临床血液感染假丝酵母菌进行定量检测。     

血浆（1，3）-β-D 葡聚糖检测对侵袭性真菌感染的诊断价值

目的：探讨血浆（1,3）-β-D 葡聚糖检测（G 试验）对侵袭性真菌感染（IFI）的临床诊断价值。方法2013年1～9月收集 IFI 组67例、非 IFI 组61例及健康对照组48例血浆标本,应用动态浊度法检测血浆（1,3）-β-D 葡聚糖水平,通过受试者工作特征曲线（ROC）确定 G 试验最佳临界值。结果 IFI 组、非 IFI 组及健康对照组血浆（1,3）-β-D 葡聚糖水平皆为非正态分布。IFI 组的血浆（1,3）-β-D 葡聚糖水平中位数208．00 pg/mL 明显高于非 IFI 组61．30 pg/mL（Z ＝-5．083,P ＜0．01）和健康对照组31．16 pg/mL（Z＝-8．288,P ＜0．01）。G 试验用于诊断 IFI 的 ROC 曲线下面积为0．846,最佳临界值为90．49 pg/mL,其对应的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为86．6％、77．1％、69．9％和90．3％;同时,真菌培养诊断 IFI 的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为53．7％、94．5％、85．7％和61．9％。结论血浆（1,3）-β-D 葡聚糖检测灵敏度高,阴性预测值好,但有时发生假阳性,建议临床在诊断 IFI 时,动态检测 G 试验并联合真菌培养以提高 IFI 的诊断效率。     

上尿路结石合并真菌感染的围术期治疗的探讨

<正>上尿路结石梗阻合并真菌感染近年来有增加趋势,其成因、诱发因素较复杂。研究[1]表明,糖尿病、尿潴留、近期抗生素或类固醇药物使用以及住院等均是念珠菌等真菌性尿路感染的危险因素。Sobel JD等[2]报道表明,假丝酵母菌为真菌性尿路感染的主要类型占比超过95%。除假丝酵母菌外,其他的酵母菌感染菌株包括新型隐球菌性酵母菌和阿氏丝孢酵母。霉菌包括曲霉菌和毛霉菌,可通过性生活传播,多数感染无症     

葡聚糖与半乳甘露聚糖抗原联合检测对临床侵袭性真菌病的诊断价值

目的探讨(1,3)-β-D-葡聚糖检测、半乳甘露聚糖抗原检测及(1,3)-β-D-葡聚糖与半乳甘露聚糖抗原联合检测对临床侵袭性真菌疾病的诊断价值。方法回顾性分析武汉市第一医院2014年7月～2016年7月临床疑诊为侵袭性真菌病的住院患者。根据2008年美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组及欧洲癌症-侵袭性真菌感染治疗研究协作组修订的侵袭性真菌感染诊断标准[1],将患者分为IFI组(确诊、临床诊断)组与非IFI组(拟诊、排除真菌感染组)。分析G试验((1,3)-β-D-葡聚糖检测)、GM试验(半乳甘露聚糖抗原检测)及G试验与GM试验联合检测对IFI诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值;比较G试验、GM试验以及G试验与GM试验联合检测对IFI的诊断价值。结果在收集的250例患者中,IFI确诊患者10例,临床诊断患者100例,拟诊患者32例,排除真菌感染患者108例。G试验以100pg/mL为阳性,对IFI诊断的灵敏度为74.5%,特异度为65.7%,阳性预测值为63%,阴性预测值为76.6%,约登指数为0.402;GM试验以I值≥0.5为试验阳性,对IFI诊断的灵敏度为50%,特异度为83.5%,阳性预测值为70.5%,阴性预测值为68%;G试验联合GM试验,对IFI诊断的灵敏度为90%,特异度为65%,阳性预测值为66.8%,阴性预测值为89.2%。G试验以≥100pg/mL为阳性,GM试验以I值≥0.5为阳性,G试验的ROC曲线下面积为0.712(95%置信区间为0.647～0.776);GM试验的ROC曲线下面积为0.666(95%置信区间为0.597～0.735)。结论 GM试验和G试验均对侵袭性真菌病具有诊断价值,是IFI可靠的诊断方法,G试验相比GM试验对临床侵袭性真菌病的诊断意义略强,二者联合应用可进一步提高应用价值。     

小儿新型隐球菌性脑膜炎的乳胶凝集试验诊断价值

目的 探讨小儿新型隐球菌性脑膜炎的乳胶凝集试验诊断价值.方法 对脑脊液标本进行乳胶凝集试验,查找新型隐球菌性脑膜炎抗原.结果 25例可疑有新型隐球菌性脑膜炎患者的脑脊液标本,颅脑CT和脑脊液墨汁染色共发现16例阳性诊断,乳胶凝集试验检到其中14例阳性诊断,诊断敏感性为87.5％;在9例阴性诊断中,乳胶凝集试验法有1例假阳性诊断,特异性为88.9％.结论 乳胶凝集试验对小儿新型隐球菌性脑膜炎诊断敏感性和特异性均高,值得推广应用.     

改进的多重PCR技术鉴定白色念珠菌、新生隐球菌及烟曲霉的实验研究

[目的]建立一种快速而简便的鉴定白色念珠菌、新生隐球菌及烟曲霉的分子生物学方法。[方法]应用通用引物ITS1与ITS4，PCR扩增真菌的内转录间隔区（包含5．8SrDNA），然后将白色念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉的单条种特异性异物与引物ITS1结合，对通用引物的扩增产物进行多重PCR扩增，达到鉴定上述菌株的目的。[结果]实验所采用的所有致病真菌，经通用引物的PCR扩增均能扩增出特异性的条带，而非真菌菌株扩增为阴性；白色念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉的3种种特异性引物与ITS1结合进行的多重PCR扩增，只对目的菌株进行了有效扩增，其他菌株扩增为阴性。应用此方法对临床分离的菌株，白色念珠菌，新生隐球菌，烟曲霉进行鉴定，也得到特异性扩增条带。[结论]改进的多重PCR技术，更加经济，简单，快速，为致病真菌菌种的鉴定提供了有效手段。     

新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型的分子鉴定

目的 评价限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法检测α和a交配型位点内GEF1α/a基因片段在鉴定新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型中的作用.方法 筛选交配型位点内的GEF1α/a基因进行PCR-RFLP分析.根据各基因型和交配型参考株的GEF1α/a基因保守序列设计引物,扩增受试新生和格特隐球菌GEF1α/a基因部分片段.利用DNAMAN和Vector NTI软件进行序列比对、限制性图谱分析、限制性内切酶的筛选和模拟电泳.选择EcoTl4 Ⅰ和Hap Ⅱ限制性内切酶分别对125株新生和格特隐球菌的GEF1α/a基因扩增片段进行RFLP分型.结果 所有受试的82株新生隐球菌和43株格特隐球菌均扩增出1 300 bp大小片段,而罗伦隐球菌、白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、阿萨希毛孢子菌、烟曲霉和黄曲霉参考株均扩增阴性.RFLP分型准确鉴定所有125株新生和格特隐球菌的种、变种、基因型和交配型.结论 针对GEF1α/a基因片段的PCR-RFLP方法特异性高、稳定性好,适用于新生和格特隐球菌种、变种、基因型和交配型的同步和快速鉴定以及进一步的分子流行病学分析.     

脓毒症常见病原菌多重实时PCR检测方法的建立

目的 建立可同时检测脓毒症患者血液中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌的多重实时PCR方法。方法 根据各病原菌基因组保守序列设计引物和探针,建立多重实时PCR检测方法。对建立的多重实时PCR检测方法进行特异性、敏感性和灵敏度分析,并使用该法对112份脓毒症血培养阳性标本进行验证。结果 成功建立脓毒症常见病原菌的多重实时PCR检测方法。此方法特异性、敏感性良好,灵敏度达10-5 ng/l,与标准检测方法（血培养加生化鉴定）相比,缩短了20 h。112份临床血培养阳性标本中,目标病原菌83例,多重实时PCR检出80例阳性;非目标病原菌29例,多重实时PCR检测均为阴性。检测结果显示,该方法特异性达100%,敏感性达96.39%。结论 该多重实时PCR检测方法具有快速、高效、灵敏、特异的优点,可用于临床重症监护室患者血液常见感染病原菌的诊断。     

BALF-GM联合曲霉IgG及IgM抗体对慢性肺曲霉病的诊断价值

目的 探讨肺泡灌洗液半乳甘露聚糖（BALF-GM）联合曲霉IgG、IgM抗体检测在慢性肺曲霉病（CPA）中的诊断价值。方法 将确诊为CPA的88例患者作为研究组,疑似CPA经确诊后排除的64例患者作为对照组。回顾性分析所有患者的BALF-GM、曲霉IgG及IgM抗体水平,采用受试者工作特征（ROC）曲线分析各检测方法BALF-GM、曲霉IgG、IgM及其联合检测对CPA的诊断价值。结果 BALF-GM诊断CPA价值较高,曲霉IgG、IgM等指标及其联合检测的诊断价值较低,BALF-GM联合曲霉IgG/IgM检测灵敏度有明显提高,但特异度下降。研究组BALF-GM、曲霉IgG、IgM含量均高于对照组,2组比较差异均有统计学意义（P均< 0.05）;2组BALF-GM、曲霉IgG、IgM及联合检测阳性率比较差异均有统计学意义（P均< 0.05）。ROC曲线分析显示BALF-GM诊断CPA、BALF-GM+曲霉IgG/IgM联合诊断CPA的曲线下面积均较高,灵敏度、特异度高,曲霉IgG、IgM及IgG/IgM联合检测的诊断价值均较低。结论 BALF-GM诊断CPA具有较高的灵敏度和特异度;BALF-GM联合曲霉IgG/IgM检测可提高其诊断灵敏度,但特异度会显著降低,因此需结合BALF-GM单独检测的高特异度来尽量降低假阴性的发生。     

Posaconazole: a new antifungal weapon

The last twenty years, the incidence of invasive fungal infections (IFI) has risen dramatically due to the prolongation of survival of patients with multiple risk factors for fungal infections. Amphotericin B was for more than 40 years the gold standard for almost all IFI, but toxicity and resistance, especially of new and emerging pathogens remained important issues. Fluconazole and itraconazole have also the same disadvantage of resistance. Voriconazole, a new triazole antifungal has offered an additional option, but the problem of resistant aspergillosis, and zygomycosis remains. Echinocandins (caspofungin, micafungin and anidulafungin) are active only against Candida and Aspergillus spp., but not against Fusarium, Scedosporium and Zygomycetes. Posaconazole is the most recently approved triazole with broad spectrum activity against Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, Zygomycetes, dermatiaceous, dimorphic, and other fungal pathogens. Interestingly, posaconazole is active against Candida spp., resistant to fluconazole and itraconazole, and Aspergillus fumigatus resistant to fluconazole itraconazole, amphotericin B, and voriconazole. The results from clinical trials of posaconazole as salvage treatment are encouraging. Multicenter clinical trials have also established its role in the prophylaxis of (IFI) in the severely immunocompromised patients such as those after hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) who developed graft versus host disease (GVHD), as well as the neutropenic patients with an acute myelogenous leukemia (AML) or myelodysplastic syndrome (MDS) after myeloablative chemotherapy. Posaconazole has pharmacokinetic advantages and low side effect profile, which are very important, especially in the seriously ill population.     

白色念珠菌的快速检测技术开发

目的利用白色念珠菌单克隆抗体建立一种快速检测临床标本中白色念珠菌的方法。方法利用免疫层析技术,采用双抗夹心法制作成检测白色念珠菌的检测卡。利用标准菌株及临床标本对检测卡的最低检测限、交叉反应进行评估。与荧光PCR核酸扩增法进行试验对比,评估其灵敏度、特异度。结果该方法的最低检测限为10^4 cfu/mL,对可能造成交叉反应的临床常见的菌株,如热带念珠菌、克柔氏念珠菌、曲霉、金黄色葡萄球菌等真菌和细菌进行检测,均无交叉反应。该检测卡的灵敏度及特异度分别为80.00%和97.00%,与荧光PCR核酸扩增法进行对比,差异有统计学意义(P<0.05),Kappa值为0.737,两种方法一致性一般。结论该研究建立了一种灵敏度、特异度、准确度较高的,能快速检测临床标本中白色念珠菌的方法,对于有临床症状而快速检测结果为阴性的标本,建议进行荧光PCR核酸扩增法检测。     

TaqMan荧光定量PCR检测新型隐球菌方法的建立

目的建立TaqMan荧光定量PCR方法定量检测新型隐球菌基因组DNA,为检测隐球菌性脑膜炎提供重要方法。方法在国家生物技术信息中心(NCBI)查找新型隐球菌各亚型的ITS-rDNA序列,序列比对后设计特异性引物和探针,扩增片段为114bp,构建质粒标准品,调整质粒浓度为1.42×10~8 copy/μL~1.42×10copy/μL共8个浓度梯度,分别取2μL作为模板,优化反应条件,建立标准曲线,进行敏感性、特异性、重复性评价,并检测临床确诊的15例隐球菌脑膜炎感染菌株。结果建立的荧光定量PCR可以检测2.84×10~2拷贝的质粒DNA,对临床分离的各10例其他真菌、细菌、乙型肝炎病毒DNA和人类基因组DNA均无扩增曲线,重复性良好,3个浓度的批间变异系数分别为2.86%、1.48%、1.36%,可准确检测15例新型隐球菌。结论成功建立检测新型隐球菌的荧光定量PCR方法,敏感性和特异性较高,结果稳定可靠,可早期、快速诊断隐球菌性脑膜炎。     

Antifungal activity of C-27 steroidal saponins

As part of our search for new antifungal agents from natural resources, 22 C-27 steroidal saponins and 6 steroidal sapogenins isolated from several monocotyledonous plants were tested for their antifungal activity against the opportunistic pathogens Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Cryptococcus neoformans, and Aspergillus fumigatus. The results showed that the antifungal activity of the steroidal saponins was associated with their aglycone moieties and the number and structure of monosaccharide units in their sugar chains. Within the 10 active saponins, four tigogenin saponins (compounds 1 to 4) with a sugar moiety of four or five monosaccharide units exhibited significant activity against C. neoformans and A. fumigatus, comparable to the positive control amphotericin B. The antifungal potency of these compounds was not associated with cytotoxicity to mammalian cells. This suggests that the C-27 steroidal saponins may be considered potential antifungal leads for further preclinical study.