吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡作用及其对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的探讨吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡作用及其对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法应用MTT比色检测法测定不同浓度(0、5、10、100、250)μmol/L不同作用时间(24 h、48 h、72 h)下吉西他滨对MCF-7人乳腺癌不同时期细胞生长抑制作用,倒置显微镜观察吉西他滨对MCF-7细胞形态学的影响,流式细胞仪测定MCF-7细胞凋亡情况,应用Western blot法及免疫荧光法对Bcl-2、Bax蛋白进行定性及定量分析。结果 MTT结果显示,吉西他滨能有效抑制MCF-7细胞增殖,且呈剂量及时间依赖性。在倒置显微镜下观察吉西他滨作用MCF-7细胞后,细胞呈通透性增加,形态不规则,细胞脱落破碎等改变。MCF-7乳腺细胞培养24 h后应用流式细胞仪可观察到5μmol/L、10μmol/L吉西他滨组细胞凋亡率分别为(34.25±3.89)%、(45.89±4.32)%显著高于对照组(4.02±0.39)%,差异有统计学意义(t=5.269,7.452,P0.05)。Western blot法显示MCF-7细胞中Bax蛋白表达增多,而Bcl-2蛋白表达减少。免疫荧光法显示在细胞培养24 h后随着吉西他滨浓度增加,Bax蛋白表达强度增加,而Bcl-2蛋白表达强度减弱。结论吉西他滨能有效抑制乳腺癌细胞增殖,诱导其凋亡,其诱导凋亡机制可能与上调Bax蛋白及下调Bcl-2蛋白有关。     

miR-122介导肝癌细胞凋亡的分子机制研究

目的探讨微小RNA-122(mi R-122)介导肝癌细胞凋亡的分子作用机制。方法将人工合成的mi R-122类似物、对照片段NC转染到肝癌细胞Hep G2(p53wt)、MHCC97H(p53 mutation)后,mi R-122组(转染mi R-122)、对照组(转染对照无意片段)和空白对照组均应用RT-PCR检测mi R-122,Western blot检测p53、Bax蛋白,MTT法检测肝癌细胞增殖变化,流式细胞术检测肝癌细胞凋亡率。结果在Hep G2中,mi R-122组的mi R-122的表达、p53蛋白和Bax蛋白表达量明显高于对照组和空白对照组,三组间差异均有统计学意义(χ~2=13.41,F分别=15.35、16.88,P均<0.05)。在MHCC97H中,mi R-122组mi R-122的表达和Bax蛋白表达量明显高于对照组和空白对照组,三组间差异均有统计学意义(χ~2=12.98,F=18.91,P均<0.05),而三组的p53蛋白测定值比较,差异无统计学意义(F=2.82,P>0.05)。在Hep G2和MHCC-97H细胞中,与对照组和空白对照组比较,mi R-122组细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(χ~2分别=8.53、7.81、11.64、12.45,P均<0.05)。对照组和空白对照组的细胞增殖和细胞凋亡率无明显变化,差异均无统计学意义(χ~2=0.08、0.05、0.12、0.09,P均>0.05)。结论 mi R-122可通过p53依赖途径及非p53依赖途径促进肝癌细胞凋亡。     

甘露糖结合凝集素对甲状腺癌细胞p53及Bcl-2蛋白表达的影响

目的探讨甘露糖结合凝集素（MBL）对甲状腺癌细胞株p53及凋亡基因Bcl-2基因表达的影响。方法将0、1mg／L的重组人甘露糖结合凝集素（RhMBL）（对照组、实验组）分别作用于两种甲状腺癌细胞株（甲状腺乳头状癌细胞和甲状腺滤泡状癌细胞）,利用蛋白印记（WesternBlot）检测p53、Bcl-2的表达。结果重组人甘露糖结合凝集素作用于甲状腺癌细胞株后,可使p53及Bcl-2蛋白相对表达量下调。（1）甲状腺乳头状癌细胞：p53蛋白对照组的表达量为1．51±0．29、实验组为0．74±O．07,两组比较差异有统计学意义（t=7．63,P=0．040）;Bcl-2蛋白对照组的表达量为1．20±0．07,实验组为0．59±0．04,两组比较差异有统计学意义（t=6．28,P=0．001）。（2）甲状腺滤泡状癌细胞：p53蛋白对照组的表达量为0．88±O．14,实验组为0．35±0．08,两组比较差异有统计学意义（t=3．29,P=0．003）;Bcl-2蛋白对照组的表达量为1．07±0．11,实验组为0．33±0．06,两组比较差异有统计学意义（t=5．73,P=0．000）。结论MBL在其诱导甲状腺癌细胞凋亡、抑制其增殖的的过程中,Bcl-2和p53可能发挥着一定的作用。     

顺铂诱导直肠癌HCT116细胞凋亡及其作用机制的研究

目的 研究顺铂诱导直肠癌HCT116细胞凋亡及其作用机制.方法 采用酶联免疫吸附法M30-ApoptosisTM-ELISA-kits、流式细胞仪测定不同浓度顺铂作用不同时间HCT116细胞的凋亡情况;West-ern-Blotting测定p53、p21、Bcl-2蛋白水平的表达.结果 顺铂可抑制直肠癌HCT116细胞生长,并呈时效(F=1129.383,P=0.000)和量效(F=125.267,P=0.000)关系;2.5、5.0、10.0、15.0 μmol/L顺铂分别作用直肠癌HCT116细胞0、12、24、48、72 h,通过亚G1峰检测其凋亡率,顺铂作用24、48、72 h细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(χ2值分别为5.669、14.110、12.221,P值分别为0.010、0.003、0.000),不同时间顺铂抑制HCT116细胞生长率的差异有统计学意义(χ2=14.008,P=0.003);不同时间顺铂诱导HCT116细胞释放CK18-Asp237-Asp396含量的比较,不同药物浓度结果差异有统计学意义(F=48.667,P=0.000),同时间结果差异有统计学意义(F=1194.394,P=0.000),Western-Blotting结果提示顺铂作用直肠癌HCT116细胞后p53、p21蛋白水平表达随着12、24、48、72 h与0 h比较逐步升高,p53蛋白(t值分别为9.873、-2.906、7.229、2.776,P值分别为0.000、0.007、0.000、0.011);p21蛋白(t值分别为-10.692、-8.867、-15.063、-16.281,P值分别为0.000、0.001、0.000、0.000);Bcl-2蛋白的表达无变化(t值分别为1.429、2.011、2.247、2.001,P值分别为0.178、0.069、0.053、0.062).结论 顺铂通过恢复pS3的功能,诱导肿瘤细胞凋亡,起到抑制肿瘤生长的作用.     

RPB5介导蛋白与HBx蛋白共表达对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的通过乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)与RPB5介导蛋白(RMP)在肝癌Hep G2细胞中的共表达,探索RMP与HBx对肝癌细胞凋亡的影响。方法脂质体介导瞬时转染细胞;实时荧光定量RT-PCR和western blot分别检测RMP与HBx在肝癌Hep G2细胞中的表达量;流式细胞仪检测细胞凋亡率;逆转录PCR检测细胞凋亡相关基因Bax、Caspase3、P53、Bcl-2 mRNA相对表达水平,western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。结果与未经任何处理的Hep G2细胞比较,转染RMP质粒的稳定表达HBx的Hep G2细胞中RMP、HBx在基因及蛋白质水平表达均显著升高(P0.01);细胞凋亡率显著降低;促凋亡基因Bax、Caspase3和P53 mRNA相对表达水平均显著下调(P0.01),凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA相对表达水平显著上调(P0.01);促凋亡蛋白Bax表达量明显降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显升高。结论 RMP与HBx共表达可降低肝癌Hep G2细胞凋亡率,提示RMP和HBx可能在肝癌发生和发展过程中起着重要的作用。     

大黄素对胃癌细胞生长及Bcl-2表达的调控

目的:研究大黄素对人胃腺癌SGC-7901细胞生长及凋亡的影响及对Bcl-2基因表达水平的改变,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制.方法:将不同浓度的大黄素作用于体外培养的人胃腺癌细胞,MTT法观察细胞增殖率的改变;流式细胞仪检测细胞凋亡;细胞免疫组化法检测Bcl-2蛋白表达.结果:各实验组均抑制胃癌细胞的生长,细胞增殖率随大黄素浓度的升高和作用时间的延长而下降,与对照组相比差异有统计学意义(P ＜ 0.01);各实验组作用于胃癌细胞48 h后,凋亡细胞可以检出且与对照组相比差异有统计学意义(P ＜ 0.01);各实验组可不同程度地下调胃癌细胞Bcl-2蛋白表达水平,与对照组相比差异有统计学意义(P ＜ 0.01),并呈浓度相关性.结论:大黄素体外可以抑制人胃腺癌SGC-7901细胞的增殖及诱导细胞的凋亡;大黄素诱导SGC-7901细胞凋亡可能与其下调Bcl-2蛋白表达有关.     

靶向IRF-2基因的siRNA对胰腺腺泡细胞凋亡的机制研究

目的探讨靶向干扰素调节因子2(IRF-2)基因的小干扰RNA(siRNA)对胰腺腺泡细胞凋亡的影响及机制。方法以脂质体Lipofectamine TM2000为载体,参照其转染说明将设计并合成的IRF-2的siRNA转染AR42J细胞,并设置阴性对照siRNA(NC)及空白组(仅加入脂质体)。IRF-2的siRNA及阴性对照siRNA转染AR42J细胞24 h后与雨蛙肽(10-8mol/L)同培养,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及活性氧族(ROS)含量;Western blotting检测Bcl-2、Bax和p53的蛋白表达。结果转染IRF-2的siRNA的AR42J细胞IRF-2蛋白表达降低,与空白组比较差异具有统计学意义(P0.05)。雨蛙肽可明显诱导AR42J细胞凋亡,诱导ROS产生,上调Bax和p53蛋白表达,下调Bcl-2的蛋白表达,与NC组比较差异具有统计学意义(P0.05),而转染si-IRF-2后可降低由雨蛙肽诱导的AR42J细胞凋亡和ROS产生,下调Bax和p53蛋白表达,上调Bcl-2的蛋白表达,与NC+雨蛙肽组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论靶向IRF-2基因的siRNA可抑制胰腺腺泡细胞凋亡,机制可能与降低细胞内ROS含量及下调Bax、p53表达和上调Bcl-2表达有关。这种抑制可能与增加急性胰腺炎的炎症程度有关。     

IFN-α联合5-FU对肝癌细胞增殖及凋亡的影响及机制研究

目的探讨α-干扰素(IFN-α)联合5-氟尿嘧啶(5-Fu)对人肝癌细胞Hep G2增殖及凋亡的影响及机制。方法培养人肝癌细胞Hep G2,实验分为4组,对照组不加药物干预,5-Fu组加入40μg/ml 5-Fu,IFN-α组加入4 000 U/ml IFN-α,联合用药组加入40μg/ml 5-Fu和4 000 U/ml IFN-α。培养48 h后收集细胞,采用MTT法检测各组细胞增殖,流式细胞仪检测各组细胞周期及凋亡情况,细胞免疫化学法检测各组Bcl-2、Caspase-3蛋白表达。结果 IFN-α组抑制作用较弱,为3.73%,5-FU组抑制率为22.50%,联合用药组抑制作用显著增强,抑制率为63.65%;联合用药组对肝癌Hep G2细胞的周期影响最大,G0/G1期比率明显增加,为(80.10±4.33)%,S期细胞比率明显减少,为(18.76±3.47)%,细胞增殖指数(PI)最低,为(20.11±4.53)%,差异有统计学意义(P0.05);联合用药组肝癌Hep G2细胞凋亡率为(22.51±4.41)%,明显高于其他组(P0.05);联合用药组Bcl-2蛋白表达率为(10.24±2.30)%,明显低于其他组(P0.05);联合用药组Caspase-3蛋白表达率为(30.12±1.81)%,明显高于其他组(P0.05)。结论 IFN-α联合5-FU能明显抑制Hep G2细胞增殖并诱导凋亡,其机制可能是通过调节Bcl-2、Caspase-3蛋白而发挥作用。     

不同温度热疗联合多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株增殖的影响

目的探讨亚高温热疗联合多西紫杉醇对人乳腺癌增殖的影响及其相关机制。方法采取四甲基偶氮唑盐法观察多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖的影响,且筛选出有效浓度。将体外培养的MCF-7细胞分为空白对照组、多西紫杉醇组及热疗与多西紫杉醇联合组,热疗与多西紫杉醇联合组依据不同温度(39.0℃、39.5℃、40.0℃、40.5℃、41.0℃)分为5个亚组。对各组细胞予以相应干预后,采取流式细胞仪检测各组细胞凋亡状况及细胞生长周期变化。结果随着热疗温度上升,细胞凋亡比例渐渐增高,41.0℃热疗时凋亡率[(38.90±6.88)%]最高,显著高于单一应用多西紫杉醇与其他各亚组;c-Jun氨基末端激酶在热疗温度为41.0℃时达到最高值,而细胞外调节蛋白激酶1/2、p-p38蛋白表达在热疗温度为40.0℃达到最高值,同其余亚组相比,差异均有统计学意义(P0.05);热疗与多西紫杉醇联合等亚组G2/M期细胞比例明显多于单一使用多西紫杉醇组,抑制MCF-7细胞周期进程的效应明显强于多西紫杉醇,且随着热疗温度增加,G2/M期细胞比例增高,差异有统计学意义(P0.05)。热疗与多西紫杉醇联合组丝裂原活化蛋白激酶通路蛋白表达较多西紫杉醇组显著增强,Bcl-2蛋白表达则明显降低,而Bax蛋白表达有轻微升高。结论亚高温热疗联合多西紫杉醇干预能抑制人乳腺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有协同抗肿瘤效应,其治疗机制可能与激活细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、p38蛋白有关。     

LncRNA UCA1 介导Raf/MEK/ERK 信号通路调控乳腺癌细胞生物学作用的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)尿路上皮癌胚抗原1(urothelial carcinoma antigen1,UCA1) 在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学作用的机制研究。方法 实时定量聚合酶链式反应(quantitativereal-time PCR , qRT-PCR) 法检测LncRNA UCA1 在正常人乳腺上皮细胞MCF-10A 与乳腺癌细胞BT-474,MCF-7,SKBR-3 和MDA-MB453 中的表达; 选择BT-474 和MCF-7 细胞随机分为三组, 分别转染UCA1-siR,NC-siR 及Control,再通过qRT-PCR 法验证转染后BT-474 和MCF-7 细胞中LncRNA UCA1 表达;通过CCK-8 法、Transwell 实验和流式细胞仪检测BT-474 和MCF-7 细胞增殖、侵袭、凋亡能力;利用Western blot 检测两种细胞中RAF/MEK/ERK通路相关蛋白的表达。结果 与MCF-10A 相比,LncRNA UCA1 在BT-474,MCF-7, SKBR-3 和MDA-MB453 细胞中表达水平分别上调了133.8%,169.2%,35.4% 和73.8%,差异有统计学意义(F=34.152,P=0.002)。转染处理后,BT-474 细胞Control 组、NC-siR 组和UCA1-siR 组Lnc RNA UCA1 表达量分别为1.52±0.36,1.49±0.17 和0.63±0.11,差异有统计学意义(F=42.628,P ＜ 0.001) 。MCF-7 细胞Control 组、NC-siR 组和UCA1-siR 组Lnc RNA UCA1 表达量分别为1.75±0.25,1.70±0.22 和0.74±0.08,差异亦有统计学意义(F= 39.372,P ＜ 0.001)。CKK-8 结果表明,与Control 组和NC-siR 组相比,UCA1-siR 组BT-474 和MCF-7 细胞增殖能力均显著下降,差异有统计学意义(F=57.382 ～ 198.251, 均P ＜ 0.001)。Transwell 结果显示,BT-474 细胞Control 组、NC-siR 组和UCA1-siR 组穿膜数分别为205±12 个,192±16 个和114±9 个,差异有统计学意义(F=108.250,P ＜ 0.001),MCF-7 细胞Control 组、NC-siR 组和UCA1-siR 组穿膜数分别为187±9 个,175±13 个和96±12 个,差异亦有统计学意义(F= 139.062,P＜ 0.001)。流式结果显示,BT-474 细胞Control 组、NC-siR 组和UCA1-siR 组凋亡率分别为4.25%,4.44% 和10.28%,差异有统计学意义(F=49.134,P ＜ 0.001),MCF-7 细胞Control 组、NC-siR 组和UCA1-siR 组凋亡率分别为2.30%,3.05%和8.98%,差异亦有统计学意义(F=62.750,P ＜ 0.001)。Western blot 结果显示,与Control 组和NC-siR 组相比,UCA1-siR 组BT-474 和MCF-7 细胞中Raf,p-MEK/MEK 及p-ERK1/2/ ERK1/2 蛋白表达均显著下调,差异有统计学意义(F=42.384 ～ 76.092,均P<0.001)。结论 LncRNA UCA1 在乳腺癌细胞系中呈高表达,沉默LncRNA UCA1 基因可以抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭,促进凋亡,其作用机制可能与阻断Raf/MEK/ERK 磷酸化通路有关。     

DNA-PK基因沉默对卵巢癌细胞细胞凋亡的影响

目的 探讨DNA-PK基因对沉默卵巢癌细胞凋亡的影响及机制.方法 DNA-PK shRNA以脂质体介导转染卵巢癌细胞株Skov3,24h后接受2Gy X射线照射,继续培养48 h.收集细胞,标记Annexin Ⅴ/PI,流式细胞术分析细胞凋亡情况,同时,RT-PCR检测p53和p21 mRNA的表达量.结果 2Gy辐射引起2.40％±1.53％ Skov3细胞凋亡,高于对照组（t=2.618,P=0.026）,而转染DNA-PK shRNA的Skov3细胞经2Gy照射,凋亡细胞为18.74％±4.15％,明显高于单纯2Gy照射组（t=9.052,P＜0.001）及DNA-PK shRNA转染组（2.77％±1.73％）（t=8.869,P＜0.001）.RT-PCR检测结果显示,2Gy照射组,Skov3细胞p53 mRNA表达量高于对照组,而DNA-PKshRNA转染的Skov3细胞接受2Gy照射,其p53 mRNA表达量降低,接近正常水平,单独转染DNA-PK shRNA组p53 mRNA表达量无明显变化.转染DNA-PK shRNA的Skov3细胞经2Gy照射,其p21 mRNA表达量低于2Gy照射组接近正常组水平,单独转染DNA-PK shRNA组Skov3细胞p21 mRNA表达水平与正常对照组相当.结论 DNA-PK shRNA可增加辐射后巢癌细胞株的细胞凋亡,其可能机制是通过下调p53和p21 mRNA表达,而启动细胞凋亡.     

米哚妥林对急性白血病细胞株HL-60细胞抑制效应的研究

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂米哚妥林(PKC412)对HL-60细胞株增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:采用CCK-8法检测不同浓度PKC412对HL-60细胞增殖的影响;瑞士吉姆萨染色法鉴定PKC412对HL-60细胞凋亡的影响;qRT-PCR检测BCL-2、P53基因的mRNA表达,Western blot检测BCL-2、P53蛋白的表达;以尾静脉注射HL-60细胞构建急性白血病小鼠模型,以PKC41231.25nmol/kg尾静脉给药,生理盐水组作为对照组,研究PKC412在小鼠体内对HL-60细胞的抑制;ELISA法检测PKC412对肿瘤小鼠细胞因子TNF-α和TGF-β分泌的影响。结果:PKC412抑制HL-60细胞株细胞增殖,呈剂量依赖性(r=0.9973),其中IC50=0.31μmol/L;并能诱导HL-60细胞凋亡。PKC412作用HL-60细胞株48 h后,与对照组比较BCL-2基因mRNA表达下调(0.417±0.044 vs 0.933±0.033,t=9.347,P<0.001),P53基因mRNA表达上调(1.533±0.145 vs 1.050±0.161,t=2.231,P>0.05);BCL-2蛋白表达量下降,P53蛋白表达量升高。PKC412在体内可抑制HL-60肿瘤细胞生长,给药后小鼠生存率为50%,与对照组比较体重增加(18.02±0.403 g vs 16.44±0.562 g,t=2.272,P=0.0356)。PKC412组血清及脾细胞中TNF-α和TGF-β细胞因子较对照组分泌明显减少(P<0.05)。结论:PKC412能通过抑制BCL-2基因表达水平诱导HL-60细胞凋亡,体内给药可抑制肿瘤的生长。     

miRNA-34b 对子宫内膜癌细胞凋亡、侵袭、迁移的影响及作用机制

目的 探究miR-34b 对子宫内膜癌(endometrial cancer) 凋亡、迁移、侵袭的影响及对Jag1/Cyclin D1 信号通路的影响。方法 将人子宫内膜癌细胞AN3CA 细胞分为对照组、NC 组和miR-34b 组。通过流式细胞技术、Transwell实验分别检测各组细胞凋亡、迁移能力和侵袭能力;通过定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)及Westernblot 检测各组细胞Jagged-1 蛋白(Jag1)及其靶基因G1/S- 特异性周期蛋白-D1(Cycling D1)mRNA和蛋白的表达水平;通过裸鼠荷瘤实验分析miR-34b 对肿瘤生长的影响。结果 对照组、NC 组和miR-34b 组细胞凋亡比例分别为5.6%±0.12%,5.80%±0.22% 和19.4%±0.51%。miR-34 组细胞凋亡比例高于对照组,差异具有统计学意义(t=8.325,P ＜ 0.01);对照组、NC 组和miR-34b 组细胞迁移数分别为322.15±13.71 个,327.67±9.14 个和162.19±7.49 个,miR-34b 组细胞迁移数低于对照组,差异具有统计学意义(t=7.945 , P ＜ 0.01);对照组、NC 组和miR-34b 组细胞侵袭数分别为357.6±14.11 个,364.05±16.12 个和157.58±8.77 个,miR-34b 组细胞侵袭数低于对照组,差异具有统计学意义(t=7.643,P ＜ 0.01);qPCR 结果表明对照组、NC 组和miR-34b 组Jag1 mRNA 表达为2.75±0.21,2.67±0.14 和1.19±0.19,miR-34b 组低于对照组,差异具有统计学意义(t=8.434,P ＜ 0.01);对照组、NC 组和miR-34b 组蛋白表达为1.71±0.11,1.77±0.24 和0.69±0.16,miR-34b 组低于对照组,差异具有统计学意义(t=7.895,P ＜ 0.01);对照组、NC 组和miR-34b 组Cyclin D1mRNA 表达为1.29±0.13,1.32±0.11 和0.59±0.13,miR-34b 组低于对照组,差异具有统计学意义(t=9.124,P ＜ 0.01);对照组、NC 组和miR-34b 组蛋白表达为1.81±0.18,1.79±0.14和1.29±0.16,miR-34b 组低于对照组,差异具有统计学意义(t=8.227,P ＜ 0.01);裸鼠荷瘤实验表明过表达miR-34b 裸鼠肿瘤生长曲线与对照组差异有统计学显著性意义,并且肿瘤体积显著低于对照组(t=8.184,P ＜ 0.01)。结论 miR-34b 可以促进人子宫内膜癌细胞的凋亡,抑制细胞迁移和侵袭能力,其机制与Jag1/Cyclin D1 信号通路活性的抑制相关。     

低频超声联合微泡影响前列腺癌DU145细胞血管内皮细胞生长因子表达的实验研究

目的探讨低频超声联合微泡对前列腺癌DUl45细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响。方法体外培养前列腺癌DUl45细胞,细胞呈对数生长时分为4组进行实验：对照组（细胞悬液1ml）、单纯微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue）、单纯低频超声组（1ml细胞悬液以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30S）、低频超声联合微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue后立即以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30s）。MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测凋亡率,Western印迹法检测细胞VEGF蛋白的表达。采用单因素方差分析比较对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率、凋亡率、VEGF蛋白表达量差异,进一步组间两两比较采用SNK-q检验。结果对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率分别为100％、（96．50±12．49）％、（93．20±5.31）％、（81．30±9．32）％;凋亡率分别为（1．10±0．26）％、（1．78±0．63）％、（5．85±0．45）％、（9．36±0．90）％;VEGF蛋白表达量分别为0．81±0．05、0．79±0．06、0．58±0．04、0．38±0．05。单纯微泡组、单纯低频超声组细胞存活率与对照组比较差异均无统计学意义,低频超声联合微泡组细胞存活率较对照组降低,且差异有统计学意义（q=5．88,P〈0．05）。单纯微泡组细胞凋亡率、VEGF蛋白表达量与对照组比较差异均无统计学意义;单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞凋亡率均高于对照组,VEGF蛋白表达量均低于对照组,且差异均有统计学意义（q=14．09、24．51、8．06、14．89,P均〈0．05）。低频超声联合微泡组细胞凋亡率高于而VEGF蛋白表达量低于单纯低频超声组,且差异亦均有统计学意义（q=10．42、6．83,P均〈0．05）。结论微泡能增强低频超声抑制前列腺癌DUl45细胞增殖及促进凋亡,其机制可能与其下调前列腺癌DUl45细胞VEGF表达有关。     

RMP 通过AMPK 通路调节线粒体稳态和氧化应激诱导卵巢癌细胞增殖与凋亡的机制研究

目的 探讨 RPB5调节蛋白（RPB5-mediating protein,RMP）对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响以及通过腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK）通路调节线粒体稳态和氧化应激的作用机制。方法 实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)法检测人输卵管上皮永生化细胞 FTE-187与人卵巢癌细胞系 SKOV3, A2780和 HO8910中 RMP基因的表达。以 SKOV3细胞作为研究对象,利用 siRNA技术敲低 SKOV3细胞中 RMP的表达,再通过 qRT-PCR法验证 RNAi效率。通过平板克隆形成实验和流式细胞技术观察敲低 RMP表达后对 SKOV3细胞增殖能力、周期分布及凋亡能力的影响。通过激光共聚焦显微镜观察敲低 RMP表达后 SKOV3细胞中线粒体形态的变化。 Western blot进一步证实 RMP调控线粒体稳态相关蛋白 AMPK和 p-AMPK以及凋亡蛋白 Bcl-2和 Bax的表达。采用 ROS荧光法检测敲低 RMP表达后对 SKOV3细胞内 ROS水平的影响。结果 RMP在 FTE-187细胞中的表达水平为 1.00±0.13,在 A2780,HO8910和 SKOV3细胞中的表达水平分别为 1.58±0.19,1.88±0.17,2.15±0.10,较 FTE-187中的表达显著上升,差异有统计学意义（F=72.035,P＜ 0.001）。SKOV3细胞转染后, RMP-siR组 RMP表达水平为 0.86±0.20,较 control组（2.06±0.11）和 NC-siR组（1.92±0.23）显著下降,差异有统计学意义（F=90.220, P＜ 0.001）。平板克隆形成实验和流式细胞检测结果表明,敲低 RMP可以通过引起 G2/M期阻滞导致卵巢癌细胞增殖障碍,促进卵巢癌细胞凋亡。通过激光共聚焦显微镜观察到敲低 RMP表达后, SKOV3细胞中点状的线粒体明显增多,线粒体的碎片化也增多,导致线粒体稳态失衡。 Western blot结果表明, control组和 NC -siR组 p-AMPK表达水平分别为 0.75±0.12,0.77±0.17,敲低 RMP表达后, p-AMPK表达水平为 1.39±0.33,较 control组和 NC-siR组升高,差异有统计学意义（F=46.550,P＜ 0.001）。control组和 NC-siR组凋亡相关蛋白 Bax/Bcl-2比值分别为 0.55±0.11和 0.56±0.08,敲低 RMP表达后, Bax/Bcl-2比值增加为 1.57±0.22,差异亦有统计学意义（F=62.027,P＜ 0.001）。荧光显微镜观察到, control组和 NC-siR组荧光强度分别为 100.24%±8.76%和 103.07%±7.93%,敲低 RMP后其荧光强度为 295.14%±12.10%,显著高于 control组和 NC-siR组,差异有统计学意义（F=392.708,P＜ 0.001）。结论 RMP在卵巢癌细胞中呈高表达,敲低 RMP表达后可以通过激活磷酸化 AMPK通路导致卵巢癌细胞线粒体稳态失衡和氧化应激,诱导卵巢癌细胞在 G2/M期发生阻滞,进而抑制卵巢癌细胞增殖,促进其凋亡。     

LINC01503 调控ERK 磷酸化促进食管鳞状细胞癌放疗抵抗的机制研究

目的 探究长链非编码核糖核酸 (LncRNA) LINC01503调控细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）通路磷酸化促进食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）放疗抵抗的作用机制。方法 收集 2014年 6月～2017年 12月内蒙古自治区人民医院 ESCC患者癌组织及癌旁组织标本 79例,采用实时荧光定量 PCR检测 LINC01503在 ESCC组织中的表达水平,分析 LINC01503与 ESCC患者临床病理参数、放疗敏感性及预后的关系。构建 ESCC放疗抵抗细胞株 KYSE150R,检测 KYSE150R细胞中 LINC01503的表达;转染 siRNA下调 KYSE150R中 LINC01503的表达。 CCK8实验检测各组细胞放疗敏感性;流式细胞试验检测各组细胞周期和细胞凋亡;Western blot检测各组细胞中 ERK1/2,PERK1/2,细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）,细胞周期素依赖性激酶 4（cyclin dependent kinase 4,CDK4）,凋亡蛋白 Bcl-2和 Bax蛋白表达。结果 与癌旁组织相比, LINC01503在 ESCC组织中表达上调（4.15±1.21 vs 0.96±0.43）,差异有统计学意义（t=22.083,P<0.001）。LINC01503高表达与患者 T分期、淋巴结转移、 TNM分期、放疗抵抗有关,差异均有统计学意义（t=2.322～2.939,均 P<0.05）。LINC01503预测预后的曲线下面积为 0.780（95%CI:0.676～0.884）,灵敏度和特异度分别为 81.58%,67.05%。LINC01503高表达组 5年生存率低于 LINC01503低表达组 [41.86%（18/43）vs 63.89%（23/36）],差异有统计学意义（χ2=4.430,P=0.035）。与 si-NC组相比, si-LINC01503组 KYSE150R细胞的放疗敏感性增加,差异均有统计学意义（t=17.391～33.692,均 P<0.001）;si-LINC01503组 KYSE150R细胞周期阻滞在 G0/G1期（61.47%±3.60% vs 52.15%±2.11%）,细胞凋亡增加（31.95%±2.40% vs 3.68%±0.47%）,差异均有统计学意义（t=4.602,20.022;P=0.004, 0.002）;PERK1/2（0.24±0.03 vs 1.25±0.09）,cyclin D1（0.18±0.06 vs 1.40±0.14）,CDK4（0.87±0.09 vs 1.37±0.16）和 Bcl-2（0.16±0.03 vs 0.85±0.07）蛋白表达降低, Bax蛋白表达增加（0.69±0.06 vs 0.22±0.05）,差异均有统计学意义（t=4.718～18.440,均 P<0.05）。结论 LINC01503通过促进 ERK磷酸化调控细胞周期和凋亡促进 ESCC细胞放疗抵抗,是逆转 ESCC放疗抵抗的潜在分子靶点。     

RNA干扰技术抑制急性白血病细胞THP-1中SALL4基因表达的研究

目的 抑制SALL4基因在急性白血病细胞THP-1中的表达,探讨其在白血病发病机制中的作用.方法 将表达SALL4干扰序列的质粒载体转染至急性白血病细胞THP-1中,分为4组:(1)空白对照组:不加处理;(2)转染对照组:加入空pRS质粒载体;(3)转染一组:加入SALL4-shRNA-pRS-1干扰质粒的转染复合体;(4)转染二组:加入SALL4-shRNA-pRS-2干扰质粒的转染复合体.采用实时荧光定量PCR和WB技术观察THP-1细胞中SALL4基因mRNA及蛋白表达的变化,建立抑制SALL4表达的体系.实时荧光定量PCR检测SALL4受抑后Wnt/β-catenin信号通路中C-myc、Cyclin D1、β-catenin基因的表达改变,采用流式细胞术分析THP-1细胞凋亡情况.结果 实时荧光定量PCR结果 显示,转染一组、转染二组、转染对照组、空白对照组SALL4基因的表达水平分别为(36.0±4.3)%、(32.0±2.4)%、(102.0±6.5)%、(100.0±2.6)%,差异有统计学意义(F=226.3,P<0.05);转染一组、转染二组的SALL4基因表达水平显著低于空白对照组,差异有统计学意义(t值分别为19.7、19.1,P<0.05);转染对照组SALL4基因表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(t=1.1,P＞0.05).WB检测结果 显示,转染一组、转染二组SALL4蛋白表达与空白对照组和转染对照组相比明显下降.以上基因和蛋白表达水平均提示SALL4干扰效率良好.SALL4基因抑制表达后,转染一组C-myc基因、β-catenin基因、Cyclin D1基因的表达分别为(44.0±6.2)%、(44.0±5.1)%和(107.0±13.6)%,转染二组为(22.0±4.5)%、(25.0±3.5)%和(48.0±7.6)%,转染对照组为(42.0±3.5)%、(59.0±3.7)%及(79.0±5.6)%.转染一组、转染二组C-myc基因表达水平显著低于空白对照组的(103.0±7.5)%,差异有统计学意义(t值分别为10.1、9.5,P均<0.05);转染一组、转染二组β-catenin基因的表达显著低于空白对照组的(100.0±4.1)%,差异有统计学意义(t值分别为23.3、22.9,P均<0.05);转染一组、转染二组Cyclin D1基因的表达显著低于空白对照组的(102.0±6.0)%,差异有统计学意义(t值分别为17.4、12.4,P均<0.05).SALL4基因被抑制后,转染一组、转染二组、转染对照组及空白对照组的细胞凋亡率分别为(57.2±9.1)%、(34.4±8.6)%、(14.4±3.6)%及(14.8±4.8)%,差异有统计学意义(F=42.5,P<0.05).转染一组、转染二组细胞凋亡率显著高于空白对照组(t值分别为9.7、4.5,P均<0.05).结论 抑制急性白血病细胞THP-1中SALL4基因表达后,Wnt/β-catenin信号通路的C-myc、Cyclin D1及β-catenin基因的表达随之下调,并促进了细胞凋亡.     

肾病综合征外周血单个核细胞凋亡与P-糖蛋白170表达

目的 检测原发性肾病综合征(PNS)患儿外周血单个核细胞(PBMC)细胞凋亡、P-糖蛋白170(P-gp170)的表达情况,分析二者关系,探讨其在糖皮质激素(GC)耐药中的作用.方法 对28例PNS患儿分别于GC(强的松)治疗前和治疗4周时采血,流式细胞仪(FCM)检测PBMC细胞凋亡、P-gp170表达情况,并进行相关性分析.依据对GC的反应分为激素敏感组(SSNS组,16例)、激素耐药组(SRNS组,12例),另设10例健康体检儿童作为对照组.结果 (1)GC治疗前PBMC在SSNS组、SRNS组及对照组均有凋亡,凋亡率分别为(6.14±1.85)％、(6.44±1.83)％和(5.56±1.53)％,3组间差异无统计学意义(P＞0.05);与治疗前比较,治疗4周后SSNS组凋亡率增高为(11.48 ±6.25)％(P＜0.01),SRNS组无明显变化[(6.94±1.87)％,P＞0.05].(2)GC治疗前P-gp170在SSNS、SRNS、对照组表达率分别为(4.54±3.10)％、(11.78±4.52)％和(2.30±2.07)％,3组间差异有统计学意义(P＜0.01),SRNS组高于其他2组,SSNS组高于对照组;治疗后P-gp170在SSNS、SRNS组的表达率较治疗前增高为(7.29±2.69)％、(15.36±4.36)％,差异有统计学意义(P均＜0.01),且SRNS组高于SSNS组(P＜0.01).(3)PBMC细胞凋亡与P-gp170表达未见线性相关(r=-0.174,P＞0.05).结论 (1)PBMC的凋亡延迟可能参与PNS患儿GC耐药.(2)外周血P-gp170表达增高可能与PNS患儿GC耐药有关.(3)PBMC细胞凋亡率及P-gp170表达情况可作为判断PNS患儿预后的指标.