绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅸ.两活力碎片及抑制剂的一级结构

前文已报道绿豆胰蛋白酶抑制剂经胃蛋白酶酶解后能使两个活性区域拆开,分离后的两活力碎片,经证实它们的活性中心分别为Lys及Arg,并测定了各自的氨基酸组成及N、C末端。今在此基础上确定了绿豆抑制剂的全部氨基酸排列顺序。一、绿豆抑制剂N端的氨基酸顺序天然绿豆胰蛋白酶抑制剂在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示有四条不同粗细的条纹,样品的N末端分析主要有Ser及Asp,它们是属于差异极少的异构体,具有完全相同的活     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅸ.两活力碎片及抑制剂的一级结构

前文已报道绿豆胰蛋白酶抑制剂经胃蛋白酶酶解后能使两个活性区域拆开,分离后的两活力碎片,经证实它们的活性中心分别为Lys 及Arg,并测定了各自的氨基酸组成及N、C 末端。今在此基础上确定了绿豆抑制剂的全部氨基酸排列顺序。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究 Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N端的一个,而近C端的活性区域经CNBr裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅶ.N-端活力碎片的研究

绿豆胰蛋白酶抑制剂经溴化氰及胃蛋白酶限止性裂解后经固相胰蛋白酶亲和层析及Sephadex G-50柱分离可得一活力碎片,能当量抑制胰蛋白酶,它是属于抑制剂中两个活性区域中近N 端的一个,而近C 端的活性区域经CNBr 裂解后活力丧失。此活力碎片是由两条肽链所组成,通过两对二硫键相连结,它们分别含26及9个氨基酸残基,N 末端分别为丝氨酸及苯丙氨酸,C 末端分别为亮氨酸及高丝氨酸。活力碎片与牛胰蛋白酶当量结合后的络合物能获得片状或小颗粒晶体,在低pH 下解离后的活力碎片可用Sephadex G-50柱分离提纯,其氨基酸组成与抑制活力特性都保持不变。在pH 3～12范围内不同温度下测定活力碎片的稳定性,当pH 低于6时即使在100℃下加热10分钟也不失活,在较高pH 下活力碎片的失活情况大致上与天然抑制剂相仿。活力碎片再同时经过量氨肽酶与羧肽酶进一步酶解后,氨基酸残基数虽降至27个左右,活力仍不丧失,是目前已知分子量最小而活力又全保留的抑制剂活力碎片。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Ⅷ.两个活性碎片的拆分

1.绿豆胰蛋白酶抑制剂有二个活性中心,可以同时抑制两分子胰蛋白酶。用苯乙二醛及顺丁烯二酸酐分别进行化学修饰,都可使其活力降低至原有的50%左右,表明此两活性中心分别应为精氨酸残基及赖氨酸残基。2.绿豆抑制剂经胃蛋白酶酶解后,活力不丧失,在凝胶过滤中出现分子量为原抑制剂一半的新活力峰,经证实为两个不同活性中心的活力碎片。3.利用两活性中心残基赖氨酸和精氨酸侧链基团解离pK 值的差异,在pH11.4的条件下通过固相胰蛋白酶亲和层析可将两活力碎片彼此分离。分离所得两碎片活力大致相等。4.以赖氨酸为活性中心的碎片能被顺丁烯二酸酐全部抑制失活,在pH3.5下保温却和原抑制剂一样能恢复其原有活力的90%以上。此活力碎片由两条肽链所组成,共含35个氨基酸残基,N-末端为丝氨酸和苯丙氨酸,两C-末端分别为亮氨酸及甲硫氨酸。5.以精氨酸为活性中心的碎片的活力能被苯乙二醛全部抑制,经鉴定为一条肽链,其含约27个氨基酸残基,N-末端为门冬酰胺,C-末端为门冬氨酸。     

慈菇中两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂的研究

由于蛋白酶抑制剂在生理、生化、病理、药理上都占有很重要的地位,特别是具有多功能的蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床,近年来愈来愈受到各方面的重视。本文报道了从慈菇中提取两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂,它们都具有两个活力相等的活性中心,这与其他已知的同类型植物蛋白酶抑制剂不同,有它的特殊性。(1)慈菇蛋白酶抑制剂A、B,除能抑制胰蛋白酶外,还能抑制胰凝乳蛋白酶及猪颌下腺的舒缓激肽释放酶。用酰胺、酯及蛋白等不同底物分别求出抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值及对胰凝乳蛋白酶的半抑制比值。两者对胰蛋白酶的抑制常数在10~(-9)～10~(-10)的范围内,抑制剂B对胰蛋白酶较之A有更大的结合力,但抑制剂A对胰凝乳蛋白酶及舒缓激肽释放酶较之B却有更明显的抑制活力。(2)用葡聚糖凝胶过滤及聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测定抑制剂A、B的分子量均在17000左右。从抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值求得分子量为8500。这说明每一抑制剂分子中具有两个活力相等的活性中心。(3)测定了抑制剂A、B的氨基酸组成,二者除碱性氨基酸及天冬氨酸含量略有差异外其余皆相同,各含有两对二硫键,非极性氨基酸含量较高约占60%左右。由氨基酸组成求得最小分子量约16500。(4)用二硝基氟苯,二甲基氨基萘磺酰氯及氨肽酶M测定抑制剂A、B的N末端,都证实是天冬氨酸。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂┐猪胰蛋白酶复合物的四方晶体结构

本文报道了绿豆胰蛋白酶抑制剂－猪胰蛋白酶（１∶２）复合物的四方晶体的结构测定。晶体属于Ｉ４２２空间群,衍射分辨率为０．２５ｎｍ,共确定了绿豆抑制剂５６个残基的空间位置。与已报道的三方晶体结构相比,其中的抑制剂分子的结构基本相同,并且抑制剂－酶三元复合物在四方晶体中也处于堆积无序状态,即复合物按两种取向进行堆积：Ｔａ∶ＭａＭｂ∶Ｔｂ和Ｔｂ∶ＭｂＭａ∶Ｔａ（Ｔａ,Ｔｂ为胰蛋白酶,Ｍａ为抑制剂结合环Ⅰ,Ｍｂ为抑制剂结合环Ⅱ）。但四方晶体结构比三方晶体结构多测定了一个抑制剂残基Ｐｒｏ１１的位置,同时,四方晶体中的抑制剂不存在膺β－折叠片层结构,其构象与三方晶体中的抑制剂相比有所变化。分析表明抑制剂的两个刚性的结构域之间的连接肽具有一定的柔性,并因此形成不同的晶型。此外,绿豆抑制剂与其他Ｂｏｗｍａｎ－Ｂｉｒｋ抑制剂相比,分子的两个双股的反平行β－折叠片层和抑制活性位点所在的结合环的结构具有很高的保守性     

慈菇中两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂的研究

由于蛋白酶抑制剂在生理、生化、病理、药理上都占有很重要的地位,特别是具有多功能的蛋白酶抑制剂被广泛应用于临床,近年来愈来愈受到各方面的重视。本文报道了从慈菇中提取两种结晶的多功能蛋白酶抑制剂,它们都具有两个活力相等的活性中心,这与其他已知的同类型植物蛋白酶抑制剂不同,有它的特殊性。(1)_慈菇蛋白酶抑制剂A、B,除能抑制胰蛋白酶外,还能抑制胰凝乳蛋白酶及猪颌下腺的舒缓激肽释放酶。用酰胺、酯及蛋白等不同底物分别求出抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值及对胰凝乳蛋白酶的半抑制比值。两者对胰蛋白酶的抑制常数在10~(-9)～10~(-10)的范围内,抑制剂B对胰蛋白酶较之A有更大的结合力,但抑制剂A对胰凝乳蛋白酶及舒缓激肽释放酶较之B却有更明显的抑制活力。(2)_用葡聚糖凝胶过滤及聚丙烯酰胺凝胶电泳分别测定抑制剂A、B的分子量均在17000左右。从抑制剂A、B对胰蛋白酶的当量抑制比值求得分子量为8500。这说明每一抑制剂分子中具有两个活力相等的活性中心。(3)_测定了抑制剂A、B的氨基酸组成,二者除碱性氮基酸及天冬氨酸含量略有差异外其余皆相同,各含有两对二硫键,非极性氨基酸含量较高约占60%左右。由氨基酸组成求得最小分子量约16500。(4)_用二硝基氟苯,二甲基氨基萘磺酰氯及氨呔酶M测定抑制剂A、B的N末端,都证实是天冬氨酸。     

慈菇蛋白酶抑制剂对亚洲玉米螟消化酶的影响

亚洲玉米螟幼虫中肠消化酶主要为胰蛋白酶：利用慈菇蛋白酶抑制剂研究它对玉米螟消化酶的影响,发现这种抑制剂体外强烈抑制玉米螟幼虫中肠消化酶：同时我们又比较了长时间取食（三龄至五龄第二天）和短时间取食(四龄未取食48小时)抑制剂的幼虫体内胰蛋白酶活性,当它们短时间取食抑制剂后,体内消化酶水平迅速下降,取食更长时间时,胰蛋白酶活力下降更明显,仅为对照的27．2%。由此可见,慈菇蛋白酶抑制剂严重影响了玉米螟的正常消化,阻断了玉米螟营养与食物间的联系．使玉米螟生长发育不良。     

蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响,采用室内人工接虫和生化测定的方法,研究了在离体条件和饲喂条件下4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶的抑制作用,并测定了绿豆象幼虫取食不同含量的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的人工绿豆后,其中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的变化.结果表明:在离体条件下,供试4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性均有明显的抑制作用,且浓度越大,抑制效果越显著,其中以20μg·mL^-1的MBTI对3种酶活性的抑制效果最强,3种酶活性分别比对照降低了62.5%、41.2%和38.7%,而卵粘蛋白抑制剂(OI)抑制效果最弱.绿豆象幼虫取食含不同抑制剂的人工绿豆后,中肠内3种酶活性也均受到一定的抑制作用,取食后随龄期的延长,3种酶活性有所升高但仍显著低于对照,且以MBTI的抑制作用最强.当绿豆象幼虫取食不同含量MBTI的人工绿豆后,随MBTI含量的增加,对总蛋白酶活性和类胰蛋白酶活性的抑制作用均逐渐增强,但对类胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用并不显著,只有当MBTI含量达20%时,对类胰凝乳蛋白酶活性才表现出明显的抑制作用.     

Kunitz 型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构与功能研究

蛋白酶抑制剂在酶学及蛋白质的结构与功能关系研究中有重要意义,Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是其中最重要的,也是研究最广泛的蛋白酶抑制剂之一．该类蛋白酶抑制剂三维结构高度保守：由一个明显的疏水核心、三对高度保守的二硫键桥、三链β-折叠和一个N端3 10螺旋及一个C端α-螺旋组成．3对二硫键对分子空间结构的稳定起着非常重要的作用．这一类型抑制剂有5个主要的活性位点：P1、P1’、P3、P3’、P4,它们都位于一个溶剂暴露的环上．P1位点是抑制作用的关键活性位点,抑制剂的专一性由P1位点氨基酸残基的性质决定;P1’位点氨基酸残基的侧链大小对抑制剂．酶的结合常数有很大影响,用大的侧链残基取代会导致结合常数降低;P4位点残基被取代经常产生负效应,会导致活性区域环的构象发生很大改变,从而影响酶与抑制剂的结合．     

慈菇蛋白酶抑制剂通过花粉管途径对小麦的导入及转基因植株分析

慈菇蛋白酶制剂（ＡｒｒｏｗｈｅａｄＰｒｏｔｅｉｎａｓＩｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＡＰＩ）是来源于慈菇（Ｓａｇｉｔｔａｒｉａｔｒｉｆｏｌｉａ）储藏器官的一种天抗虫物质,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂类,能抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激肽释放酶,对某些鳞翅目,双翅目以及鞘翅目等昆虫有毒杀作用。     

一种苦荞麦种子蛋白酶抑制剂的纯化、特性及其抗虫活性

蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内, 是自然界含量最为丰富且具有一定防御作用的蛋白种类之一. 本文采用离子交换层析和凝胶层析等方法,从苦荞麦种子中分离出一种胰蛋白酶抑制剂（TBTI-Ⅱ）. SDS-PAGE分析表明,TBTI Ⅱ的分子量约9.0 kD,由80个氨基酸残基组成,分子中含有较多的 Glu, Asp 和Arg. TBTI-Ⅱ具有较高热稳定性.当在100℃加热处理10 min后,仍保留有67.6%的抑制剂活性. 动力学测定显示,来自苦荞麦中的TBTI-Ⅱ对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为1.01×10－4 mol/L. 另外,将含有不同活力单位的苦荞麦蛋白酶抑制剂掺入到棉铃虫的饲料中进行饲养试验显示,TBTI-Ⅱ具有明显的抑制棉铃虫生长的作用. 这些结果表明,来自苦荞麦种子中的小分子蛋白酶抑制剂可能是一种潜在的抗虫因子.     

苦荞胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性研究

利用固相胰蛋白酶亲和色谱及离子交换色谱,从苦荞种子中分离纯化了三个具有抑制胰蛋白酶活力的组份(BTI-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。经聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦测定,三种抑制剂的等电点为6.87,6.7,5.14。根据Sephadex G-75凝胶过滤,SDS-PAGE测定,以及由当量抑制比值和氨基酸组份的推算,它们的分子量范围分别为5200-5700(Ⅰ),5500—6000(Ⅱ),5000—5600(III)。三者对胰蛋白酶的抑制常数分别为2.12×10~(-8),4.78×10~(-9),1.22×10~(-8)。氨基酸分析结果表明,它们均含有很高的极性氨基酸。在酸性条件下,它们均具有很高的热稳定性。化学修饰的结果表明,它们活性中心的氨基酸残基为Lys。     

决明胰蛋白酶抑制剂1活性相关残基的定点突变与抑制活性分析

决明胰蛋白酶抑制剂1（CoTI1）属于Kunitz胰蛋白酶抑制剂家族成员,通过序列比对预测Arg86、Leu84和Thr88等3个氨基酸残基可能是CoTI1发挥抑制作用的关键残基。通过定点突变的方法将Arg86、Leu84与Thr88残基分别突变为Asp残基,并考察各突变体对胰蛋白酶及棉铃虫等鳞翅目害虫消化酶的抑制作用。与CoTI1相比,CoTI1^R86D、CoTI1^T88D与CoTI1^L84D突变体对胰蛋白酶的抑制活性分别下降了93%、64%与59%;对棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等3种鳞翅目害虫消化酶的平均抑制活性分别下降了88.7%、57%与60.7%。以上结果表明Arg86、Leu84与Thr88是CoTI1发挥抑制作用的关键残基,这为CoTI1的抑制分子机制及抗虫研究提供了重要的理论依据。     

天花粉胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及DNA序列分析

从天花粉块茎中分离纯化的天花粉胰蛋白酶抑制剂ＴＴＩ是目前已知的最小的蛋白酶抑制剂,它属于南瓜族蛋白酶抑制剂家族;由２７个氨基酸残基组成,含三对二硫键。本文用ＰＣＲ方法扩增一特异探针;结合传统的筛库方法,从天花粉ｃＤＮＡ基因库中筛选到含ＴＴＩ基因的克隆,经序列测定,得到了ＴＴＩ的ｃＤＮＡ全序列。其读框编码区编码的是一个由６５个氨基酸组成的Ｐｒｅ－Ｐｒｏ－ＴＴＩ,Ｐｒｅ与Ｐｒｏ分别含有２４个和１４个氨基酸。由ｃＤＮＡ序列推论的氨基酸序列和已测定的氨基酸序列完全相同。     

牙鲆弹性蛋白酶cDNA全长和蛋白质结构分析

为研究牙鲆丝氨酸蛋白酶家族的功能和及其家族的分子进化规律,从本实验室已构建的牙鲆肝胰脏cDNA文库进行了部分测序,从而筛选出一个弹性蛋白酶新成员：弹性蛋白酶5。在此基础上,结合Genbank数据库中已经提交的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶,对三者蛋白质进行了序列分析和三维结构的比较。牙鲆弹性蛋白酶cDNA包含一个完整的读码框（提交Genbank的登录号为EU873084）。其编码区平均GC含量为54％,推测编码的蛋白质包含296个氨基酸,分子量为29．04KD,等电点为6．14。蛋白序列比较表明它和牙鲆弹性蛋白酶3相似性最高。通过同源建模得到弹性蛋白酶5的三维结构和牛胰凝乳蛋白酶结构相似,包含了2个α螺旋、β个8折叠和13个转角结构。牙鲆弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶中底物结合区的3个关键氨基酸有明显的区别,这些氨基酸的变化改变了底物结合位点开口的大小,胰凝乳蛋白酶2的三个关键氨基酸和牛胰凝乳蛋白酶相同,该区域能接受结构较大的芳香族氨基酸;胰蛋白酶3能更好的结合阳性氨基酸Lys或Arg;而弹性蛋白酶开口很小,只能结合小的残基。上述结果证明了牙鲆丝氨酸蛋白酶家族中的弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶底物结合位点的结构差异决定了其对底物选择的特异性。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂—猪胰蛋白酶复合物的四方晶体结构

本文报道了绿豆胰蛋白酶抑制剂－猪胰蛋白酶复合物的四方晶体的结构２测定。晶体属于１４２２空间群,衍射分辨率为０．２５ｎｍ,共确定了绿豆抑制剂５６个残基的空间位置。与已报道的三方结构相比,其中的抑制剂分子的结构基本相同,并且抑制剂－酶三元复合物在四方晶体中也处于堆积无序状态,即复合物按两种取向进行堆积;Ｔａ;ＭａＭｂ;Ｔｂ和Ｔｂ：ＭｂＭａ：ａ。     

用圆二色性探测绿豆胰蛋白酶抑制剂的构象

绿豆胰蛋白酶抑制剂的紫外圆二色谱与一般球状蛋白质不同,属典型的Bowman-Birk抑制剂的图形,具有231nm正峰,245nm肩,275nm负峰及202nm大负峰。异硫氰酸苯酯修饰Lys活力中心后,使抑制剂失去一半活力,但CD谱变化不大。溴化氰处理后,抑制剂Arg活力区破坏,231nm峰消失,202nm峰变小。这两个峰可能与抑制剂特定的硫-硫键构象有关。研究了此抑制剂及上述衍生物与羊胰蛋白酶形成的络合物的CD谱。从CD谱看,羊胰蛋白酶属无规卷曲。络合物CD谱与两游离组分CD谱的加和谱比,有一些不同,但大体上是相似的。因此,络合物中两组分的构象与游离时的构象大体上相似。