一株分离自海水的产生物表面活性剂菌株的鉴定及其发酵优化

为研究分离自海水的芽孢杆菌dhs-330产生物表面活性剂的培养条件和产物特性,采用16S r DNA基因序列分析鉴定菌种,对发酵培养基的碳源、氮源、p H值和培养温度进行优化,采用飞行时间质谱进行产物鉴定及抑菌圈法考察产物抑菌活性。结果显示,该菌株与Bacillus mojavensis菌株16S r DNA的序列相似性为99%。菌株发酵液表面张力可由70 m N·m-1降低至27 m N·m-1。发酵培养基的最适碳源、有机氮源和无机氮源分别为甘油、酵母膏和尿素;p H值为6.5~7.0、温度为30~35℃条件下,菌体生长和生物表面活性剂合成最为有利。发酵产物为脂肽-糖脂混合型生物表面活性剂,对海洋污损微生物Bacillus pumilus dhs04有显著的抑菌活性。菌株dhs-330是能合成脂肽-糖脂混合生物表面活性剂、具有海洋污损微生物防除潜力的优选菌株。     

Bacillus amyloliquefaciens C-1胞外抑菌脂肽的分离与鉴定

Bacillus amyloliquefaciens C-1为本实验室从即食食品中分离出的菌株,其发酵液上清具有一定的抑菌活性。通过酸沉淀法从发酵液上清中分离粗脂肽,并确定脂肽是发酵液上清中具有抑菌活性的物质。本实验以蜡样芽孢杆菌MS10362R(产黑色素)、蜡样芽孢杆菌CMCC63301(不产黑色素)和大肠杆菌O157∶H7 CDC157为指示生物进行粗脂肽的抑菌活性测定,结果显示0.1 mg/m L的脂肽对这三个菌的6 h生长抑制率分别96%、75%、93%;同时在不同温度、蛋白酶和有机溶剂处理下分别测定了该脂肽的抑菌活性稳定性,结果显示C-1抑菌脂肽对这些处理均不敏感,其抑菌活性非常稳定,具有很好的开发应用潜力。     

金黄色葡萄球菌拮抗菌株的筛选鉴定及其抗菌物质分析

【背景】植物内生菌的次生代谢产物是新型天然活性物质的重要来源。【目的】从芍药内生细菌中筛选对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的菌株和次生代谢产物。【方法】采用平板对峙法筛选拮抗菌株,根据形态学特征和分子生物学的方法鉴定菌株,PCR扩增检测合成脂肽类物质的功能基因;运用牛津杯法依次测定内生细菌发酵液和脂肽类粗提物的抑菌活性,利用Sephadex LH-20凝胶层析分离脂肽类物质,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析具有抑菌作用的分离组分。【结果】共筛选出13株对金黄色葡萄球菌具有不同程度抑制作用的内生菌株,其中菌株SY11的抑菌作用最为显著,其发酵液和脂肽类粗提物均具有较强的抑制作用。结合形态学鉴定以及16S r RNA基因序列分析,鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。PCR扩增检测表明菌株SY11含有3个合成脂肽类物质的功能基因fenA、ituD和srfkn,推测该菌株可能具有合成脂肽类物质的能力。根据具有抑菌活性分离组分的质谱分析结果,推测其有效物质的主要成分为Bacillomycin D。【结论】解淀粉芽孢杆菌SY11对金黄色葡萄球菌有良好抑制效果,其脂肽类粗提物也具有较强的体外抑菌活性。本研究为芍药内生细菌的开发应用奠定了基础。     

抗菌豆豉发酵菌株的筛选及其脂肽组分鉴定和特性研究

目的:从豆豉中分离广谱抗菌活性菌株,并鉴定其发酵产物中的抗菌成分.方法:采用生理生化实验结合16SrRNA序列测定法鉴定目标分离株,通过LC-MS和ESI/CID技术对其抗菌组分进行鉴定.结果:从8个豆豉样品中分离出7株具有抗菌活性菌株,其中抗菌活性较强的分离株NT-6为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其发酵液抗菌提取物的主要成分是抗菌脂肽类物质iturin、fengycin、surfactin同系物的混合物.该提取物对供试革兰氏阳性、阴性细菌、霉菌等指示菌具有广谱的抗菌活性,在pH 2～ 12、121℃条件下加热30min活性不丧失,说明具有广泛的pH适应范围和良好的耐热性.结论:该菌株产生多组分抗菌脂肽,其抑菌谱宽,适应性好,显示了在食品、农业、医药等领域具有良好的应用前景.     

云贵川湖泊芽孢杆菌分离、鉴定及抗动物病原菌活性研究

为从湖泊沉积物中筛选出对动物病原菌具有抑菌活性的芽孢杆菌Bacillus,采用纯培养方法对云贵川地区9个湖泊样品中的芽孢杆菌进行分离、16S rRNA基因序列测定和发酵,以4株常见动物病原菌作为对象,对芽孢杆菌次级代谢产物进行活性检测,筛选有抗菌活性的菌株,并对活性菌株的发酵产物进行液相色谱-质谱联用技术分析。结果显示,在9个湖泊样品中共分离出47株芽孢杆菌,筛选出13株有抗菌活性的菌株,且其产生的脂肽类抗生素对动物病原菌显示出较好的抗菌活性。本研究不仅扩大了芽孢杆菌物种资源信息库,为后续开展芽孢杆菌次生代谢产物研究奠定理论依据。同时也为开发新型动物致病菌抗生素提供了新的途径。     

芽孢杆菌dhs-330-021菌粉的制备及稳定性研究

目的:利用喷雾干燥工艺制备芽孢杆菌dhs-330-021菌粉,并研究菌粉的活性及稳定性。方法:以脱脂乳、海藻糖、β-环糊精和谷氨酸钠为保护剂,采用喷雾干燥(条件为:进口温度100℃,出口温度50～60℃,进样速度2～4mL/min)制备芽孢杆菌菌粉,以喷干存活率和菌粉活菌数为指标,选择最佳制备条件。结果:获得喷干保护剂配方为脱脂乳10.0%、海藻糖6.0%、β-环糊精13.0%、谷氨酸钠15.0%,喷干存活率为65.9%,菌粉活菌数为1.38×109CFU/g,存放180 d后菌粉活菌数为1.03×10~9CFU/g。结论:喷雾干燥工艺可以用于芽孢杆菌dhs-330-021菌粉的制备,获得的菌粉稳定性较好。     

拮抗菌株的筛选及其发酵滤液抑菌活性考察

从土壤中筛选出3株具有抑菌活性的菌株,其中1#菌株对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、灰霉葡萄孢菌、变异链球菌、大肠杆菌均有较强抑制作用,初步鉴定为地衣芽孢杆菌。对其性质进行考察结果表明,在30℃,pH 7.0,150 r/min的条件下,恒温振荡培养24 h,测其发酵滤液的抑菌活力约为2 000 IU/mL。该发酵滤液具有较强的热稳定性,60℃放置1 h,抑菌活性下降了29%;100℃放置30 min,抑菌活性下降了45%,放置1 h,抑菌活性下降了48%;121℃放置1 h,抑菌活性仍能保持40%。该发酵滤液抑菌作用的最适pH值为7.0,在pH 3.0时能保持71%的抑菌活性,在pH 11.0时,仍能维持67%的抑菌活性,此发酵滤液对蛋白酶K不敏感,并且蛋白酶K对该发酵滤液的抑菌活性也起一定的促进作用。     

原生质体融合构建高效产脂肽工程菌

芽孢杆菌因其可产生多种生理活性物质,在环境污染修复、生物防治、微生物采油等领域具有广阔的应用前景。莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis JF-2和解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens BQ-6是从油田筛选出的产脂肽类表面活性剂菌株, 但在微生物采油实际应用中受到氧气浓度、盐度及pH的限制。原生质体融合是改变微生物代谢功能的一种简便有效的方法,以上述两株芽孢杆菌为对象,利用4因素3水平正交试验来探索菌龄、溶菌酶浓度、酶解温度和酶解时间对原生体制备、再生的影响。此外,对两菌株进行了双亲灭活原生质体融合,通过筛选得到了一株工程菌HY-4,并对其进行了初步的评价。结果表明:菌龄、溶菌酶浓度和酶解时间显著影响芽孢杆菌原生质体制备率及再生率(P<0.05),且在溶菌酶处理前用生理盐水多次洗涤菌体细胞,可提高制备率。两种芽孢杆菌原生质体制备及再生的最优条件均为:菌龄7 h、溶菌酶浓度2.5 mg/ml、酶解时间30 min、酶解温度42 ℃。融合子HY-4的最高耐盐度为15%,可耐50 ℃高温,代谢产脂肽的pH范围为4.0~9.5,且在好氧及厌氧条件下均能够代谢产脂肽,在厌氧条件下生长迅猛(细胞干重>1.6 g/L)。综上所述,融合子HY-4具有较大的应用潜力,该研究为芽孢杆菌的遗传育种打下了方法学基础,并对驱油微生物菌种的选育具有指导意义。     

脂肽-糖脂混合生物表面活性剂产生菌筛选和优化培养

结合脂肽和糖脂的性能优势,致力于产脂肽-鼠李糖脂混合型生物表面活性剂的新菌株选育和培养条件优化。采用血平板溶血圈法初筛菌株、改进排油圈法快速检测产量以及飞行时间质谱鉴定产物结构。对优选菌株的碳源、氮源和磷酸盐缓冲液、重要金属离子浓度等进行了单因子和正交试验,优化了培养基和培养条件。采用高压液相色谱和蒽酮比色法定量分析了产物组成。筛选获得了同时积累糖脂和脂肽的新菌株,鉴定命名为芽胞杆菌Bacillus subtilis THY-7。摇瓶分批培养48 h,细胞OD600为37.0,产物浓度2.4 g/L,分别是优化前的3.4倍和3.1倍。发酵罐补料分批培养,泡沫中产物浓度达到4.5 g/L,且74％为表面活性素,22％为鼠李糖脂。B. subtilis THY-7是具有脂肽-鼠李糖脂高产潜力的优选菌株。     

bmy基因敲除对解淀粉芽孢杆菌Q-426溶血性及抗菌活性的影响

Iturin家族环脂肽对于红色毛癣菌等病原真菌具有较强的抑菌活性,有潜力成为治疗皮肤疾病的新型抗真菌药物。解淀粉芽孢杆菌Q-426菌株能够产生环脂肽fengycins和iturin家族的bacillomycin D,但该菌株发酵液具有溶血活性。为确定bacillomycin D是否为引发溶血作用的主要物质,本文利用同源重组基因敲除技术,构建解淀粉芽孢杆菌bmy基因缺失菌株,抑制bacillomycin D的合成,研究对其溶血性及抗菌活性的影响。突变菌株发酵液中未检测到bacillomycin D产生,且发酵液的溶血性及抗菌活性明显减小,表明bacillomycin D与该菌的溶血活性及抑菌活性密切相关。     

青海湖M1菌发酵液体外抗菌活性及稳定性的初步研究

从青海湖中分离得到一株霉菌M1,采用平板抑菌法进行体外抗菌作用以及pH值、温度因素对其抗菌活性的影响。结果表明：该菌株发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌都有明显的抑菌效果。M1菌株发酵液的抑菌活性对热稳定性较差,在pH值3～7的条件下抑菌效果最佳,遗传稳定性也不高。     

解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌脂肽芬芥素的分离鉴定及抑菌作用

对一株解淀粉芽孢杆菌TF28产生的抗菌脂肽进行分离鉴定及抑菌活性研究,采用酸沉淀、乙酸乙酯和甲醇萃取技术制备了抗菌脂肽粗提物,经过2次HPLC分离纯化,在保留时间32～42min内获得8个抗菌脂肽纯品,经MALDI-TOF-MS鉴定为芬芥素(fengycins),对尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌显示出较强的抑菌活性,该研究为提高菌株TF28抗菌脂肽产量的定向遗传改造奠定基础。     

木榄根际土壤来源的曲霉属真菌F5及其抗菌活性代谢产物

将一株分离自木榄根际土壤的菌株F5鉴定为曲霉属环绕组真菌成员,其在形态学特征和ITS序列上与Aspergillus ochraceopetaliformis极为相似。该菌株在改良葡萄糖蛋白胨酵母培养基(GPYM)中28℃下160r/min发酵7d后的产物具有明显的抑菌活性。利用色谱方法从菌株F5的发酵产物中分离鉴定到2种化合物:(R)-(-)-mellein(Ⅰ)和flavacol(Ⅱ),其中,flavacol对枯草芽孢杆菌的生长具有明显的抑制作用,最低抑菌浓度(MIC)为32mg/L,而mellein对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长均无明显的抑制活性。     

牡丹根部内生细菌的分离鉴定及脂肽类物质的拮抗活性研究

【目的】从牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)根部组织中分离鉴定内生细菌,测定拮抗菌株脂肽类活性物质的体外抑菌活性。【方法】采用平板对峙法筛选出对牡丹灰霉病菌(Botrytis paeoniae Oadem)、牡丹炭疽病菌(Gloeosporium sp.)、牡丹黑斑病菌(Altenaria sp.)、牡丹黄斑病菌(Phyllosticta commonsii)有拮抗作用的内生细菌。基于形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性鉴定拮抗菌株。根据脂肽类抗菌物质合成相关基因序列对拮抗菌株进行基因扩增检测,采用酸沉淀法提取拮抗菌株的脂肽类物质,平板对峙法测定脂肽类物质的体外抑菌活性。【结果】从牡丹根部组织中共分离获得62株内生细菌,其中菌株Md31和Md33对4种病原菌均有较明显的抑制作用。Md31和Md33被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。通过对菌株Md31和Md33进行5个脂肽类合成功能基因bmyB、fenD、ituC、srfAA和srfAB的检测,序列同源性分析,表明两个菌株具有合成脂肽类物质的能力。菌株Md31和Md33的脂肽类粗提物对所测试的牡丹病原真菌均具有不同程度的抑制作用。【结论】获得了2株对牡丹病原菌有良好抑制效果的解淀粉芽孢杆菌Md31和Md33,两个菌株的脂肽类粗提物也具有较强的体外抑菌活性,该研究为牡丹内生细菌的进一步开发应用奠定了基础。     

氮源和碳源对解淀粉芽孢杆菌Q-426抗菌脂肽合成的影响

微生物来源的环状脂肽在生物农药以及医学领域极具应用潜力。通过测量抑菌活性并利用反相高效液相色谱(RP-HPLC),液相质谱联用(HPLC-MS)和串联质谱(MS/MS)技术检测抗菌脂肽组分的变化研究了氮(N)源、碳(C)源和培养基中的初始pH值对解淀粉芽孢杆菌Q-426菌株中抗菌脂肽bacillomycin D和fengycins合成的影响,从而为进一步研究它们生物合成的基因调控以及更有目的性提高产量提供理论依据。结果表明:L-组氨酸、L-赖氨酸、甘油、山梨醇以及培养基中的[OH]-均能促进脂肽bacillomycin D的合成,但它们在该实验菌株抗菌脂肽bacillomycinD合成途径中的调控靶点有所不同。     

枯草芽孢杆菌SN-02发酵液的抑菌谱及稳定性研究

目的:研究枯草芽孢杆菌SN-02发酵液的抑菌谱及稳定性。方法:以28种植物病原菌为供试菌,杯碟法测定SN-02菌发酵液的抑菌谱;以烟草靶斑病菌为指示菌,杯碟法测定发酵液的热稳定性、酸碱稳定性及传代稳定性。结果:SN-02菌发酵液对28种供试菌株的抑菌圈直径在20mm以上。将发酵液于120℃处理2.5h,-20℃处理25d抑菌活性没有明显变化;发酵液在pH 4~9时抑菌活性无明显变化,在pH 1~3和pH 10条件下抑菌活性明显下降;连续培养10代,发酵液抑菌活性没有下降。结论:SN-02菌发酵液抑菌谱较广,耐高温和低温,传代稳定性好,但在强酸和强碱条件下稳定性较差。     

芽孢杆菌dhs-330-021对链状亚历山大藻的溶藻机理研究

目的:本实验室通过转座突变技术获得了一株高产表面活性物质的芽孢杆菌dhs-330-021,研究其对链状亚历山大藻的抑制效果,及其溶藻作用方式。方法:在链状亚历山大藻的培养液中添加dhs-330-021的发酵液等,间隔一定时间计数获得藻细胞的数量。结果:菌株dhs-330-021培养后期的发酵液溶藻效果好于培养前期和中期;在一定浓度范围内,dhs-330-021的发酵液对不同生长期的链状亚历山大藻均有溶藻效果,其中对延滞期和稳定期效果最好;菌株的发酵液和无菌上清液的溶藻效果明显,而菌悬液溶藻效果较差。结论:菌株dhs-330-021能显著抑制链状亚历山大藻的生长,其溶藻方式属于间接溶藻。     

动物乳杆菌的分离鉴定及其抑菌蛋白的特性分析

通过滤纸片法从健康肉猪猪大肠、小肠中分离得到212株抗生物质产生菌, 以杯碟法复筛, 得到1株对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)等革兰氏阳性菌和大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等革兰氏阴性菌以及部分真菌如禾谷镰刀霉(Fusarium graminearum)均有强烈抑制作用的乳酸菌。经形态学、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析等手段鉴定该菌株为动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)。排除酸和过氧化氢的干扰后, 该菌株的发酵上清液对指示菌仍有明显抑菌活性; 用蛋白酶处理该菌株的发酵上清液后, 抑菌活性丧失; 发酵液粗提物具有较好的热稳定性(经121°C处理20 min仍有较强抑菌活性)以及较宽的抑菌活性pH值范围(3.5~5.5), 因此初步认为该菌株产生一类具有广谱抑菌活性的类细菌素物质。     

枯草芽孢杆菌HAINUP40的培养条件及其抑菌物质分析

前期研究表明枯草芽孢杆菌HAINUP40能够有效拮抗罗非鱼无乳链球菌,是潜在的益生菌。为了进一步优化其培养条件,并探索其其抑菌机理,本研究通过普通平板扩散法和单因素变量控制法,探究了培养条件的改变对菌株HAINUP40发酵的影响,同时确定发酵上清液抑菌活性成分及其稳定性。结果表明菌株HAINUP40的最宜培养条件为:普通淡水培养基,pH值为7.0～7.5,温度34℃,培养时长24 h,转速为50～150 r/min。HAINUP40发酵上清液中抑菌活性物质可以被80%(NH_4)_2SO_4溶液析出,对蛋白酶K敏感,不耐高温,pH4或8时失去抑菌活性,可以耐受短时间(180 s)紫外线照射。综上证明枯草芽孢杆菌HAINUP40所分泌的抑菌活性物质为大分子蛋白质,且非小分子抗菌肽。本研究为枯草芽孢杆菌HAINUP40在生物防治方面的大规模应用提供了重要的参考依据。     

糙苏提取物抑菌活性的初步评价

目的:比较糙苏甲醇提取物和丙酮提取物的抗菌活性.方法:对糙苏的丙酮提取物和甲醇提取物进行体外抗菌活性实验,测定其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较相应的MIC和MBC值.结果:两种提取物对所选取的8种菌株均具有抑菌效果,丙酮提取物的抑菌活性高于甲醇提取物.巨大芽孢杆菌是对提取物最敏感的细菌.结论:糙苏提取物作为天然抗菌物质,具有广谱抗菌效果,具有较高的应用潜力和综合开发前景.