含甘露糖异构酶基因植物表达载体的构建

目的:构建了以manA基因为选择标记的植物表达载体。方法:从大肠杆菌DH5α中克隆出manA基因,连接到质粒pCAMBIA1301的XhoⅠ位点,替换hpt基因,通过酶切和PCR检测了插入片段的正确性,使用XbaⅠ和HindⅢ酶切Gateway载体(pGWCBF)获得含有P35S-T35S-attR1-attR2-CmR-ccdB的结构域,将其插入到表达载体pCAMBIA1301的相应位点中,获得中间表达载体pCAMBIA1301-manA-GW,使用Gateway载体的BP反应与LR反应,将转录因子CBF基因片段整合到载体中。结果:酶切结果表明以甘露糖异构酶基因(manA)为选择标记的植物表达载体pCAMBIA1301-manA-CBF已经构建完成。结论:将构建好的载体用液氮冻融法转化到农杆菌中,可以用于葡萄的遗传转化研究,为将来获得安全的转基因抗寒植株奠定基础。     

以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建

目的:构建以木糖异构酶基因xylA为筛选标记的无抗生素标记Gateway系统植物表达载体。方法:克隆大肠杆菌木糖异构酶基因xylA并用其替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因,利用载体中的多克隆位点将Gateway Binary Vector(pH7WG2D)中酶切位点XbaⅠ和HindⅢ之间包括P35S、T35S、attR1、attR2和CmR-ccdB的片段重组入表达载体pCAMBIA1301中,构建表达载体pCAMBIA1301-xylA-GW,利用含有津田芜菁HY5基因片段的BP反应产物与载体进行LR反应,获得含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5,并导入根癌农杆菌LBA4404中。结果:抗生素筛选及酶切和PCR鉴定表明成功构建了以xylA为筛选标记的无抗生素标记植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5。结论:利用木糖异构酶基因xylA结合Gateway克隆技术构建无抗生素标记植物表达载体,可简化、方便植物转基因表达载体构建。     

利用FLP/frt重组系统产生无选择标记的转基因烟草植株

在植物转基因植株产生过程中,对转化细胞进行抗性筛选是通用程序,转化细胞的抗性一般是抗生素抗性或除草剂抗性,将赋予转化细胞抗性的选择标记基因删除是提高转基因植物生物安全性的重要措施。来自于啤酒酵母的FLP/frt位点特异性重组系统可有效删除同向定点重组位点frt之间的基因。通过多步骤重组,建立了可在植物中广泛应用的FLP/frt位点特异性重组系统。该系统包括含有frt位点的植物表达载体pCAMBIA1300-betA-frt-als-frt和含有由热诱导启动子hsp启动的FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA1300-hsp-FLP-hpt。利用二次转化的方式将二者先后转入烟草植株,热激处理后,热诱导型启动子hsp调控的重组酶FLP基因的表达催化位于选择标记基因als两侧同向frt位点间的重组反应,有效地删除了选择标记基因als。41%的经热激处理的二次转化植株发生了选择标记基因的删除,表明该系统在获得无选择标记基因的转基因植株中有很好的应用价值。     

含有融合标记基因和LoxP/FRT位点的植物表达载体构建及应用

本研究利用化学合成法合成了包含pCAMBIA0390左右边界T-DNA和LoxP/FRT (LF)位点的DNA片段Ⅰ,利用SacⅡ和SphⅠ酶切位点,去除了pCAMBIA0390左右边界T-DNA和多克隆位点之间的序列,然后连接DNA片段Ⅰ和载体片段,构建了植物表达载体pGM323-LF-enTP.随后,再合成含有适合在单子叶植物中表达的由玉米Ubi-1启动子驱动的融合标记基因(Bar::gus)和水稻actin-1启动子驱动的Bt抗虫蛋白基因(Cry1Ab)表达元件的DNA片段Ⅳ,在pGM323-LF-enTP的基础上,利用SalⅠ和PstⅠ位点构建了同时含有LF位点、Bar::gus以及Cry1Ab基因表达元件的表达载体pGM626-LF-ABt.利用含有pGM626-LF-ABt的农杆菌遗传转化烟草和玉米,以草丁膦作为抗性筛选剂,非转化细胞得到了有效抑制,快速获得了转基因植株,利用GUS组织化学检测和RT-PCR分析了转基因植株中标记基因的表达,结果表明pGM626-LF-ABt可以用于农杆菌介导的单、双子叶植物遗传转化.本研究为培育安全抗虫转基因植物奠定了基础.     

银杏CONSTANS基因植物表达载体构建

目的:构建银杏CONSTANS基因的表达载体.方法:PCR扩增CO基因得到1.2kb左右的片段,用BamH Ⅰ+HindⅢ酶切纯化,通过T4 DNA连接酶连接到植物表达载体pCAMBIA 1304上,并转化到农杆菌LBA4404,然后进行菌落PCR及酶切鉴定.结果:载体构建成功.结论:构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa,可用于GbCO基因的转基因功能研究.     

利用FLP/frt重组系统产生无选择标记的转基因烟草植株

在植物转基因植株产生过程中,对转化细胞进行抗性筛选是通用程序,转化细胞的抗性一般是抗生素抗性或除草剂抗性,将赋予转化细胞抗性的选择标记基因删除是提高转基因植物生物安全性的重要措施。来自于啤酒酵母的FLP/frt位点特异性重组系统可有效删除同向定点重组位点frt之间的基因。通过多步骤重组,建立了可在植物中广泛应用的FLP/frt位点特异性重组系统。该系统包括含有frt位点的植物表达载体pCAMBIA1300-betA-frt-als-frt和含有由热诱导启动子hsp启动的FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA1300-hsp-FLP-hpt。利用二次转化的方式将二者先后转入烟草植株,热激处理后,热诱导型启动子hsp调控的重组酶FLP基因的表达催化位于选择标记基因als两侧同向frt位点间的重组反应,有效地删除了选择标记基因als。41%的经热激处理的二次转化植株发生了选择标记基因的删除,表明该系统在获得无选择标记基因的转基因植株中有很好的应用价值。     

番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究

克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA 1300上hpt II基因,构建中间表达载体p1300~-/MFRG,分离单T-DNA区段,与载体pCAMBIA 2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG.酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG已被成功导入农杆菌EHA 105.通过遗传转化,初步获得了GUS染色呈阳性且具Kan抗性的番木瓜胚性愈伤组织.     

AGPase基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

将大肠杆菌BL21的AGPase基因定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,从而构建植物表达载体,转化烟草获得了转基因植株。经GUS组织化学染色、PCR、Southern blot以及RT-PCR鉴定证实,该基因已导入烟草基因组中。淀粉含量测定结果显示,转基因植株比非转基因植株淀粉含量平均增加了13.1%,由此验证了该载体构建的成功与可用性,为下一阶段用该载体转化木薯主栽品种提高块根淀粉含量的研究奠定了基础。     

含幽门螺杆菌CagA、UreB蛋白与霍乱肠毒素B亚单位（CTB）融合基因的植物表达载体的构建及遗传转化

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生也密切相关。目前所用的疫苗制造成本高、运输费用贵,然而利用转基因植物生产的植物疫苗成本低廉、服用方便是现有疫苗的良好替代品。将Hp相关蛋白与免疫佐剂CTB的融合基因(ctb-linker-cagA和ctb-linker-ureB)利用PCR、酶切、连接等一系列方法从载体p1300-WxCLCN和p1300-WxCLUN中重组到载体pCAMBIA2301中(含35S启动子),重组载体分别命名为p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN。通过冻融法将载体导入农杆菌EHA105菌株中,以农杆菌介导的方法,将重组载体p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN转化烟草黄苗榆和心叶烟,获得了具有卡那霉素抗性再生植株,经过酶切、PCR、GUS染色和PCR-Southern鉴定结果表明,目的基因分别正确插入载体中并稳定整合到植株中,为利用植物反应器生产幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。     

野生罂粟RNAi表达载体的构建及遗传转化

通过PCR方法从质粒pGEM-bc中克隆野生罂粟BBE-COR融合基因片段约760 bp,以pHANNIBAL和植物表达载体pCAMBIA3300为基础,将克隆到的BBE-COR融合基因正向和反向片段分别插入pdk内含子的两边,经酶切、PCR鉴定及序列分析表明,特异性RNAi表达载体p3300-pHR构建成功.采用直接转化法,将重组子导入根癌农杆茵AGL1中.以野生罂粟茎尖生长点为转化受体,用农杆茵介导法将目的基因转入野生罂粟中.经卡那霉素和除草剂筛选后,共获得53株转基因植株,PCR检测后,其中14株表现阳性,可初步确定目的基因已经整合到野生罂粟基因组中.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.