基于磁珠法的荧光定量PCR检测HBV-DNA临床应用评价

目的评价基于磁珠法的荧光定量PCR检测HBV-DNA的临床应用。方法选用磁珠法定量检测试剂和煮沸法定量检测试剂,对一系列临床患者血清标本进行检测,比较两种试剂检出率的差异;通过浓度为1×108的样本的梯度稀释结果考察两者的灵敏度和线性范围。结果 68例临床样本中,磁珠法试剂检测的阳性率为69.12%,煮沸法试剂检测的阳性率为32.35%(P0.05);两种试剂对103IU/m L阳性样本检测结果:y=0.913x-0.261,r=0.919;磁珠法线性范围3.9×(101~108),灵敏度39 IU/m L,煮沸法线性范围2.4×(102~107),灵敏度240 IU/m L。结论磁珠法核酸提取试剂线性范围宽,灵敏度高,临床检出率明显高于煮沸法,对于高浓度和低浓度样本都能准确的定值,适合于乙肝治疗后监测与体检筛查。     

二甲双胍(Metformin)在少突胶质前体细胞分化中的作用和机制*

目的：研究二甲双胍(metformin)在少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cell, OPC)分化过程中的作用,并对其分子机制进行初步探讨。方法：使用免疫吸附法直接分离纯化OPC后诱导培养,通过免疫荧光染色对细胞进行鉴定。在不同浓度二甲双胍处理OPC后,使用CCK8检测细胞活性;通过免疫荧光染色、流式细胞分析、实时荧光定量PCR和蛋白质印迹检测二甲双胍对OPC分化中细胞数量、mRNA和蛋白质水平的影响。结果：使用免疫吸附法可分离出高纯度OPC;CCK8检测结果显示在100 μmol/L浓度以内,二甲双胍对细胞无毒性;免疫荧光染色结果显示,二甲双胍处理OPC后,PDGFRα ⁺ OLIG2⁺阳性细胞数明显增加,且MBP⁺细胞数显著增加;流式细胞分析结果显示,PDGFRα⁺细胞数显著增加;实时荧光定量PCR结果显示,OPC分化相关基因Mag、Mbp等的mRNA水平显著增加;蛋白质印迹结果显示,分化相关蛋白OLIG2和MBP表达增加。机制上,少突胶质细胞系Oli-neu、OPC分别经二甲双胍处理5 min后,RAS、p-MEK、p-ERK蛋白量显著增加。结论：二甲双胍通过RAS-MEK-ERK信号通路促进少突胶质前体细胞的分化。     

病理组织PAS染色影响因素分析

目的分析病理组织过碘酸雪夫氏(periodic acid Schiff, PAS)染色的影响因素,以期提高其染色效果。方法选取已知含有PAS阳性物质的胃粘膜组织,分别制作成蜡块,通过对比试验,比较高碘酸水溶液不同染色时长、雪夫氏(Schiff)试剂不同配制方法、Schiff试剂不同保存时间对PAS染色质量的影响。结果胃粘膜组织在使用高碘酸水溶液染色11～15min优于其他时长,Schiff试剂热配法优于冷配法,试剂保存2个月内的染色效果优于试剂保存大于2个月者。结论胃粘膜组织使用高碘酸水溶液染色11～15min、热配法配制的Schiff试剂、保存在2个月内的Schiff试剂进行染色效果最佳。     

微波快速免疫荧光组化染色方法的研究

本文应用微波辐射方法加速免疫荧光组化染色(间接和直接法),分别定位15种不同组织抗原,并应用连续切片同时用两种不同的孵育方法即微波辐射和常规孵育方法进行比较。结果证明,经微波辐射后免疫荧光组化染色时间大大缩短,背景染色明显好于常规法,阳性率和阳性强度与常规法基本一致。     

肠道病毒71型抗原ELISA定量检测方法的建立及应用

目的建立肠道病毒71型(EV71)抗原ELISA定量检测方法,用于EV71疫苗生产工艺中抗原定量检测。方法选取抗EV71单克隆抗体作为包被抗体,HRP标记抗EV71多克隆抗体作为酶标二抗,建立EV71抗原ELISA定量检测方法。该方法经系统验证后,应用于定量检测2BS及Vero细胞基质EV71疫苗生产工艺过程样品的抗原含量。结果验证结果显示,该方法的线性范围为3.125~50.000 U/m L,样品回收率为92.0%~110.0%,变异系数小于8.8%;孵育时间及温度在一定范围内偏差的样品回收率为100.8%~113.8%;检测其他肠道病毒中抗原其A值均小于cut-off值;试剂于37℃孵育3 d后的检测样品回收率为101.4%~112.4%;2BS及Vero细胞基质EV71疫苗生产工艺过程样品的适用性检测中,抗原回收率为92.1%~114.9%。结论建立并验证EV71抗原ELISA定量检测方法,其准确度、精密度、耐用性均优良,特异性强、稳定性好,适用于不同细胞基质的EV71疫苗及多价手足口病疫苗生产工艺过程的质量控制。     

野生和栽培川西獐牙菜醇提物红外光谱分析及药效比较研究

比较野生和栽培川西獐牙菜醇提物的成分及其肝保护、镇痛、抑制肠蠕动等药理作用。采用HPLC方法,红外光谱分析技术分析两种醇提物的成分;采用CCl4致小鼠肝损伤模型、小鼠扭体实验和小鼠小肠推进功能实验对其进行药效学研究。野生和栽培川西獐牙菜原药材中含獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和芒果苷的总量分别为3.949%和4.539%,两种原药材的一维和二维红外光谱间均没有明显差异;两种醇提物的二维红外光谱之间差异较显著,但均有显著的预防肝损伤的作用,明显抑制醋酸所致的炎性疼痛和正常小鼠的肠蠕动功能,二者药效没有明显差异,且栽培品随给药剂量的增加而增强药效的趋势比野生品明显。     

超氧化物歧化酶和Bcl-2在实验性精索静脉曲张大鼠睾丸中的变化

目的:建立大鼠实验性精索静脉曲张(experimental varicocele EV)的模式,测量睾丸中超氧化物歧化酶(superoxide dismutaseSOD)活性和Bcl-2的表达。方法:将40只雄性青春期Wistar大鼠随机分为EV8周组和12周组(各12只)和相应的假手术对照组2组(各8只),通过部分结扎左肾静脉建立大鼠EV模型,分别于术后8周、12周处死动物,测左侧精索静脉直径,用比色法测SOD 活力,免疫组化法测Bcl-2的表达。结果:成功建立了EV型,与相应的对照组相比左侧精索静脉直径明显增大(P<0.01)。光学显微镜下观察睾丸组织,发现大鼠睾丸生精上皮退变,曲细精管萎缩,间质水肿和精子发育阻滞。EV组双侧睾丸的SOD活性显著低于相应的对照组(P<0.01),左侧睾丸比右侧睾丸更低,但无明显统计学意义(P>0.05)。EV组双侧睾丸间质细胞中Bcl-2的染色指数与相应的对照组相比均显著降低(P<0.01),左侧睾丸染色指数比右侧睾丸下降更明显(P<0.01),EV12周组与 EV8周组相比,EV12周组染色指数更低(P<0.05)。SOD活性与Bcl-2的染色指数在0.01水平有显著相...     

革兰氏染色三步法与质量控制

革兰氏染色(Gram stain),是细菌学中一个经常使用和十分重要的方法,自从1884年微生物学家Gram氏发明著名的革兰氏染色法以后,100多年来虽然经过后来学者的几次改进,但都仍然沿用着Gram氏原来的四步法,基本原理也没有改变。最近Allen氏对Ziehl-Neelsen抗酸菌染色法的改进,是一个良好的启示,使我们开始了革兰氏染色三步法的研究并取得了成功。现将我们建立的革兰氏染色三步法与质量控制报告如下。 1 材料和方法 1.1 结晶紫染色液 甲液:结晶紫2g;95％乙醇20ml。 乙液:草酸铵0.8g;蒸馏水80ml。 甲乙二液先分别溶解,然后混合在一起,过滤除去残渣后装入滴瓶中备用。     

丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片的制备及临床评价

为了制备丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片,并对其临床应用价值进行评价,将基因工程表达的丙型肝炎病毒分片段抗原,点至经特殊处理的玻片上,制成蛋白质芯片.收集来自三家临床单位用于临床验证的905份血清标本.分别用丙肝病毒分片段抗体检测蛋白质芯片、ELISA丙肝病毒抗体检测试剂进行检测.部分样本同时采用进口RIBA抗体检测试剂进行了检测,分别比较蛋白质芯片法与ELISA法以及RIBA试剂的符合率.结果表明：a.905份血清标本,ELISA法检出阳性294份,阴性611份.阳性标本用蛋白质芯片法检测,融合抗原292份显示阳性结果、2份阴性结果,根据蛋白质芯片的核心抗原,以及NS3, NS4,NS5分片段抗原综合判断确定阳性样本288份阳性,阴性样本2份,4份样本结果不确定.ELISA法检出的611份阴性标本用两种蛋白质芯片法检测,检出阴性均为611份.两种蛋白质芯片法与ELISA法的阳性符合率分别为99.3%和98.9%,与ELISA法的阴性符合率均为100%.用RIBA 试剂检测6份ELISA法为阳性,蛋白质芯片法为非阳性的样本,结果均为非阳性.b.290份经 RIBA试剂确认的阳性标本104份,单片段阳性标本66份,阴性标本120份,用蛋白质芯片法检测,检出阳性标本103份,单片段阳性标本61份,阴性标本126份,二者具有很高的符合率（P＞0.01）.丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片,检测灵敏度和特异性高于ELISA法,对血清样本的确认程度与进口的RIBA试剂高度一致,具有操作简便,费用低廉的特点,是一种新型、高效的体外诊断试剂.     

肠道病毒EV71 IgM抗体参考品的建立

目的建立肠道病毒EV71 IgM抗体检测用参考血清盘。方法通过收集手足口病感染早期患者的咽拭子和血清,对咽拭子病毒进行分离、鉴定、基因分型,通过血清中和试验及酶联免疫吸附试验(捕获法)的验证,确定EV71 IgM抗体阳性样品,组建EV71 IgM抗体参考血清盘,并经3家实验室对该参考血清盘进行协同标定和确认。结果 12名患儿的咽拭子中均分离到EV71病毒,在RD细胞上引起细胞病变。通过套式PCR扩增、序列测定后进化树分析确认均为流行的C4基因亚型。每名患儿的双份血清均可中和EV71病毒,抗体效价为1∶512~1∶2048。通过捕获法进行EV71 IgM抗体检测结果均为阳性。以此12份样品为原料制备EV71 IgM抗体阳性参考品,同时以12份EV71 IgM抗体阴性血清制备阴性参考品,建立了由12份阳性参考品、12份阴性参考品、1份最低检出限参考品和1份精密性参考品组成的肠道病毒EV71 IgM抗体参考血清盘。通过3家实验室协同标定,各实验室间差异均无统计学意义。结论建立了EV71 IgM抗体检测参考血清盘,为相关检测试剂的质量控制和评价提供了参考标准。     

LDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物过氧化物酶同工酶

以高粱和甘蓝型油菜叶片为材料,用十二烷基磺酸锂不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（LDS-PAGE）检测过氧化物酶同工酶的结果表明,LDS-PAGE的酶带条数比非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）明显增加,分辨率大大提高,上样量少,胶片易保存;比复性电泳（G-PAGE）的步骤简单,电泳后无需除去LDS即可直接按常规活性染色方法染色。     

脱落细胞涂片免疫组织化学技术有关问题的探讨

脱落细胞涂片免疫组织化学技术最需要注意的问题是背景染色和涂片粘附的牢固程度。因为背景的存在会影响对阳性结果的判断,尤其是抗原表达少的弱阳性的病例,而涂片涂的不好,厚薄不均,粘贴不牢都将会在操作时把涂上的细胞冲掉,造成染色的失败。因此我们采用了敏感性高,效果好的免疫组织化学真空负压ＬＳＡＢ法进行标记,ＡｒｔｃｒａｙｏｔａＡｒｔ和Ｃｒａｆｔｇｌｕｅ等涂于载玻片上,干后再涂片。经多次反复的实验证明,获得的结果好,背景清晰,阳性物明显突出,易于判断,涂片上的细胞黏附牢固,未出现细胞被冲洗脱落的现象。保证…     

两种提取蒙古黄芪miRNA方法的比较

通过对两种miRNA提取方法——一步法和多步法进行比较研究,以期获得较高质量的蒙古黄芪不同器官的miRNA。实验结果表明,两种方法均可用于蒙古黄芪miRNA提取,二者存在着不同的优缺点,多步法提取成功率较高但步骤繁琐,相比之下一步法实验条件要求严苛但步骤简单、快捷省时,提取的蒙古黄芪miRNA完整性好,可以满足荧光定量PCR等进一步实验需要。     

鱼腥草多糖的制备及其体外抗病毒活性研究

以不同方法制备鱼腥草多糖,探究其体外抗EV71、RSV、CV-B3三种病毒的活性。分别采用胃蛋白酶解法、胃蛋白酶解-Sevag结合pH=4、胃蛋白酶解-Sevag结合pH=7试剂法制备多糖,并检测其含量;采用CPE法考察不同提取工艺的多糖和鱼腥草水提物对EV71、RSV和CV-B3的体外抗病毒作用。鱼腥草不同冻干产物—水提物、酶法提取多糖、酶法-Sevag pH=7提取多糖、酶法-Sevag pH=4提取多糖得率分别为1.87%、1.01%、0.83%、0.88%,多糖含量分别为18.21%、22.68%、29.03%、23.07%;对EV71的治疗指数为24.05、2.73、12.59、6.39(阳性药利巴韦林的治疗指数为43.16),治疗效果为水提物≈酶法-Sevag pH=7提取多糖酶法-Sevag pH=4提取多糖酶法提取多糖;对RSV的治疗指数分别为2.46、5.43、15.57、9.72(利巴韦林为19.76),治疗效果为酶法-Sevag pH=7提取多糖酶法-Sevag pH=4提取多糖酶法提取多糖水提物,对CV-B3的治疗指数为2.81、5.34、17.86、5.98(利巴韦林为18.39),治疗效果为酶法-Sevag pH=7提取多糖酶法-Sevag pH=4提取多糖≈酶法提取多糖水提物。说明鱼腥草水提物和3种方法制备的多糖对EV71、RSV和CV-B3均具有一定的体外抗病毒活性。     

一种光学显微镜下观察原生质体的染色方法

Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ菌液经溶菌酶处理后分别与４种微生物染色液混合,在光学显微镜下比较观察原生质体形态的效果。结果表明;染色样品中的原生质体比未经染色的形态清晰易观察,而且显微照相效果好;其中使用草酸铵结晶紫和复红染色液的效果更佳。该方法程序简单、操作方便、效果明显,还适用于悬滴法观察菌体形态和细菌运动方式。     

鲎试验测定内毒素的一步显色法

<正>本文介绍了使用单一混合试剂的终点法和LAL显色动力学法。该试剂可用缓冲液、鲎试剂和底物(显色鲎试剂)混合冻干或用市售的LAL凝胶试剂、底物和缓冲液(显色法、凝胶法通用)混合后立即使用。这种单一试剂既可用于显色动力学方法,也可用于一步终点法(规定孵育时间)。由于去除了许多步骤和技术误差,因此可极大地减少显色法的差异。本文对动力学法和终点法进行了详细地比较,单一试剂法也与传统的多试剂法进行了对比。     

Ozanimod(RPC1063)在少突胶质前体细胞分化中的作用和机制

目的:研究Ozanimod(RPC1063)在少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)分化中的作用,并初步探讨其分子机制。方法:利用免疫吸附法直接分离OPC诱导培养,使用免疫荧光染色、实时荧光定量PCR(quantitative real time-PCR,qRT-PCR)对细胞进行鉴定。qRTPCR法检测大脑皮层发育、OPC分化过程中的S1pr家族基因mRNA水平变化。OPC经不同浓度RPC1063处理后,使用MTT法、ATP细胞活性检测法、免疫荧光染色、qRT-PCR和Western blot检测RPC1063对OPC分化细胞数目、mRNA或蛋白水平的影响。结果:利用免疫吸附法可获得高纯度的OPC;而MTT、ATP检测结果显示在0、0. 1、1、5、50、100nmol/L浓度下,RPC1063对细胞活性无明显影响。进一步研究发现,RPC1063处理OPC后,O4、MBP阳性细胞形态舒展,MBP蛋白表达量增加,OPC分化相关基因Mbp、Mag、Sox10、Cnp的mRNA水平增加。机制上,少突胶质细胞系Oli-neu或OPC经RPC1063处理5min后,AKT-mTOR信号通路相关蛋白p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1显著增加,OPC经RPC1063处理48h后,p-AKT、p-mTOR蛋白水平增加;而抑制m TOR活性,RPC1063作用减弱。结论:RPC1063通过AKT-mTOR信号通路促进少突胶质前体细胞的分化。     

Ames试验假阳性的判断方法

目的:确立一种判断Ames试验假阳性的可靠方法。方法:在Ames平皿掺入试验中发现经受试物处理的TA97和TA1535的菌落数相比溶媒对照组明显增加,为了证实其是因为受试物致突变性导致的回变菌落数增加还是由受试物毒性导致的菌落数增加,对分别经受试物和阳性对照物处理的Ames菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸的培养基上,观察比较细菌的生长情况。结果:经受试物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中,而经阳性对照物处理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上,说明经受试物处理的菌株没有发生突变。结论:此方法能可靠地验证菌株是否为突变菌株,由本研究可以发现经受试物处理的菌株没有发生突变,Ames平皿掺入试验中所观察到的菌落数增加是由于受试物毒性造成的假阳性。     

免疫印迹检测人红细胞膜血型糖蛋白的方法学

用免疫印迹技术检测人红细胞膜血型糖蛋白(GP)比PAs试剂染色和BLOTTO法点样量少,区带清晰,异常GP的检出率较高,其放射自显影的影像反差好。本文还就该方法的可靠性,最适点样量的选择,血样的有效保存时间以及 ¹²⁵Ⅰ-蛋白A的效价等方面进行了讨论。     

结核分枝杆菌滤过型的初步研究

目的研究结核分枝杆菌滤过型的生物学特性与检测方法。方法菌阴肺结核患者的结核分枝杆菌及其L型的液体培养物经0.45μm滤膜过滤后,涂片观察细菌形态,滤液分别进行分枝杆菌及其L型培养,并采用荧光基因定量法进行结核菌DNA检测。培养物用免疫组化染色鉴定,并采用透射电镜观察。结果30例痰、血滤前、滤后FQ-PCR检测同时阳性为53%,同时阴性为13%,滤前、滤后FQ-PCR结果符合率为67%。滤过后液体培养9例涂片见少许抗酸颗粒或椭圆性球菌。透射电镜见细胞壁缺失的"致密体"样细菌和细胞壁缺如菌。结论菌阴肺结核痰及血培养物中存在结核菌滤过型,滤过型携带遗传信息并可自我复制,采用生物学方法可以对其进行检测。